基因工程的下游技術(shù)　重組蛋白的表達(dá)、純化和分析.ppt

基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá) 純化和分析 重組蛋白的表達(dá)表達(dá)體系 表達(dá)載體原核受體細(xì)胞真核 選擇表達(dá)載體常用的關(guān)鍵元件 啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列 表達(dá)強(qiáng)弱 細(xì)胞或組織特異性 表達(dá)調(diào)節(jié)等 如本實(shí)驗(yàn)的乳糖操縱子 融合基因 純化 標(biāo)簽 或增強(qiáng)蛋白可溶性等 如多聚His標(biāo)簽 6 His 便于鎳柱親和層析純化 GST融合蛋白用GST柱親和層析 分泌信號(hào)篩選標(biāo)記其它 6 His 重組蛋白的純化親和層析離子交換層析凝膠過(guò)濾層析 本單元實(shí)驗(yàn)流程 細(xì)菌 pEF GFPuv 親和層析 IPTG誘導(dǎo) 細(xì)菌總蛋白 重組蛋白融合蛋白 乳糖操縱子的特性 SDS PAGE 初步分析 實(shí)驗(yàn)十重組DNA在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理材料與試劑實(shí)驗(yàn)儀器操作步驟注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)安排思考與討論 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私夂驼莆誌PTG誘導(dǎo)表達(dá)的原理 了解降解物阻遏的現(xiàn)象及其機(jī)理 實(shí)驗(yàn)原理操縱子是基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位 通常由2個(gè)以上功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因以及一些調(diào)節(jié)序列 如啟動(dòng)子序列 操縱序列等 組成 乳糖操縱子由三個(gè)結(jié)構(gòu)基因Z Y A和操縱序列 啟動(dòng)子 CAP結(jié)合位點(diǎn)等調(diào)節(jié)序列組成 乳糖操縱子的誘導(dǎo)表達(dá)當(dāng)沒(méi)有乳糖存在時(shí) 調(diào)節(jié)基因lacI表達(dá) 轉(zhuǎn)錄的mRNA翻譯成阻遏蛋白 阻遏蛋白與操縱序列l(wèi)acO結(jié)合 阻礙了結(jié)合在旁邊啟動(dòng)子的RNA聚合酶向前移動(dòng) 使結(jié)構(gòu)基因不能轉(zhuǎn)錄 也就不能翻譯出蛋白質(zhì) 也就是說(shuō) 當(dāng)沒(méi)有乳糖存在時(shí) 乳糖操縱子處于阻礙狀態(tài) 乳糖操縱子的誘導(dǎo)表達(dá) 續(xù) 當(dāng)有乳糖存在時(shí) 乳糖轉(zhuǎn)化為異乳糖 異乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合 使阻遏蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變 而不能結(jié)合到操縱序列上 RNA聚合酶可以從啟動(dòng)子向3 端移動(dòng) 于是 結(jié)構(gòu)基因可以轉(zhuǎn)錄出mRNA 然后翻譯出蛋白質(zhì) 也就是說(shuō) 當(dāng)有乳糖存在時(shí) 乳糖操縱子被誘導(dǎo) 乳糖操縱子的誘導(dǎo)物是異乳糖 IPTG是異乳糖的結(jié)構(gòu)類似物 由于IPTG不會(huì)被分解 它的誘導(dǎo)作用是持久的 乳糖操縱子的誘導(dǎo)表達(dá) 續(xù) 本實(shí)驗(yàn)所使用的表達(dá)載體上含有乳糖操縱子的調(diào)節(jié)序列 目的基因?yàn)榫G色熒光蛋白基因 在IPTG的誘導(dǎo)下 目的基因表達(dá)可增強(qiáng)105倍 然而 誘導(dǎo)表達(dá)常常受到溫度和誘導(dǎo)物的影響 乳糖操縱子的降解物阻遏當(dāng)細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí) 通常優(yōu)先利用葡萄糖 而不利用乳糖 只有當(dāng)葡萄糖耗盡后 細(xì)菌才能充分利用乳糖 這種現(xiàn)象稱葡萄糖效應(yīng) 其實(shí)質(zhì)是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用 所以又稱降解物阻遏 catabolicrepression 乳糖操縱子的降解物阻遏 續(xù) 降解物阻遏的機(jī)理 代謝物基因激活蛋白 CatabolitegeneActivationProtein CAP 又稱cAMP受體蛋白 cAMPReceptorProtein CRP 屬于激活蛋白的一種 對(duì)乳糖操縱子進(jìn)行正調(diào)節(jié) CAP分子內(nèi)分別有DNA結(jié)合區(qū)和cAMP結(jié)合區(qū) 當(dāng)CAP與cAMP結(jié)合后 就可結(jié)合到CAP結(jié)合位點(diǎn)上 促進(jìn)轉(zhuǎn)錄 葡萄糖降解物能抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性 并活化磷酸二酯酶的活性 從而降低cAMP的濃度 抑制轉(zhuǎn)錄 阻遏蛋白負(fù)調(diào)節(jié)與CAP正調(diào)節(jié)的協(xié)調(diào)當(dāng)阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時(shí) CAP對(duì)該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用 而沒(méi)有CAP存在時(shí) 即使沒(méi)有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合 操縱子仍無(wú)轉(zhuǎn)錄活性 只有在CAP存在且沒(méi)有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合時(shí) 或者說(shuō)只有高乳糖低葡萄糖時(shí) 操縱子發(fā)揮最大轉(zhuǎn)錄活性 這種協(xié)調(diào)與細(xì)菌對(duì)碳源的優(yōu)先利用相一致 Thestructureoflacoperon 調(diào)節(jié)序列 結(jié)構(gòu)基因 Repressorandnegativeregulation 異乳糖 異丙基硫代半乳糖苷 異乳糖 CAPandpositiveregulation 低乳糖時(shí) 高乳糖時(shí) 在協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)下 lacoperon的強(qiáng)誘導(dǎo)作用發(fā)生在高乳糖 低葡萄糖的狀態(tài) 材料與試劑材料含pUC18質(zhì)粒工程菌及含pGFPuv質(zhì)粒工程菌 試劑LB液體培養(yǎng)基 蛋白胨 tryptone 10g 酵母粉 yeastextract 5g NaCl10g 加800mL雙蒸水溶解 用10MNaOH調(diào)pH至7 2 7 5 定容至1000mL 分裝 高壓滅菌 4 保存 氨芐青霉素溶液 無(wú)菌雙蒸水配成100mg mL 分裝 20 保存 使用終濃度為50 g mL或100 g mL IPTG溶液 將238 3mgIPTG溶解于10mL雙蒸水 0 22 m細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌 分裝 20 保存?zhèn)溆?貯存濃度為100mM 20 葡萄糖溶液 20g葡萄糖溶解于適量雙蒸水 定容至100mL 121 15min滅菌 4 保存 實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái) 恒溫?fù)u床 離心機(jī)等 操作步驟挑取含pUC18質(zhì)粒工程菌及含pGFPuv質(zhì)粒工程菌單菌落 分別接種于含氨芐青霉 終濃度為100 g mL 以下同 的5mL的LB培養(yǎng)基中 于37 250rpm過(guò)夜培養(yǎng)12h 14h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 取3支已滅菌的大試管 分別加入5mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液 編號(hào)為1 2 3 另取一個(gè)250mL的滅菌三角瓶 編號(hào)為6 加入50mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液 1 接50 L空載工程菌 含pUC18 過(guò)夜培養(yǎng)物 25 28 培養(yǎng)10h 12h 2 接50 L重組菌 含pGFPuv 過(guò)夜培養(yǎng)物 25 28 培養(yǎng)10h 12h 3 接50 L重組菌 含pGFPuv 過(guò)夜培養(yǎng)物 37 培養(yǎng)至O D600約為0 5 約3h 4h 然后加入20 葡萄糖50 L至終濃度為0 2 及100mMIPTG5 L至終濃度為0 1mM 25 28 培養(yǎng)8h 10h或過(guò)夜 6 接500 L重組菌 含pGFPuv 過(guò)夜培養(yǎng)物 37 培養(yǎng)至O D600約為0 5 約3h 4h 然后只加入100mMIPTG50 L至終濃度為0 1mM 25 28 培養(yǎng)8h 10h或過(guò)夜 4 收集菌體 分別將1 3 全部培養(yǎng)物收集到三個(gè)7mL離心管中 編上相應(yīng)編號(hào) 離心棄上清 三角瓶培養(yǎng)的50mL菌液混勻后取5mL于7mL離心管中 編號(hào)為4 離心 上清收集到另一個(gè)指管 編號(hào)為5 其余的培養(yǎng)液用50mL離心管于5000rpm 4 離心10min 棄上清 菌體用裂解緩沖液重懸后用超聲波破碎細(xì)胞或保存于 20 備用 見(jiàn)實(shí)驗(yàn)十二 5 于紫外燈下觀察1 5 管收集的菌體或上清液 觀察哪支管有熒光 記錄觀察到的現(xiàn)象 注意 把1 和2 管置4 保存 分別標(biāo)Sample1和Sample2 1 2 3 6 pUC18 pGFPuv 挑取單菌落 接種于5mLLBA培養(yǎng)基中 37 過(guò)夜培養(yǎng) 按1 100接種 對(duì)照 IPTG Glc IPTG 1 2 3 6 1 2 3 4 5 25 28 培養(yǎng)過(guò)夜 5000rpm離心 收菌體 取5mL離心 其余離心收菌體 提取蛋白 注意事項(xiàng)本實(shí)驗(yàn)的目的是比較該重組DNA在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)受IPTG和葡萄糖存在的影響 在轉(zhuǎn)管培養(yǎng)及收菌時(shí)要注意各管編號(hào)要相應(yīng)對(duì)好 不能混亂 1 2 管不加IPTG和葡萄糖 3 管除加IPTG外還加入葡萄糖 濃度要大于0 2 以上 6 瓶?jī)H加IPTG 不同的重組DNA在不同的宿主菌中蛋白的表達(dá)量往往受到IPTG濃度和培養(yǎng)溫度的影響 在科研中一般都采用不同溫度或不同濃度的IPTG來(lái)誘導(dǎo) 以獲得最大的蛋白表達(dá)量 本實(shí)驗(yàn)所表達(dá)的綠色熒光蛋白基因 其產(chǎn)物在大腸桿菌中有很強(qiáng)的熒光 離心后收集的菌體在紫外線的照射下可見(jiàn)黃綠色熒光 所以把1 2 3 4 沉淀菌體放在紫外燈下觀察其是否有熒光以及熒光的強(qiáng)弱 就可判斷其是否有表達(dá)及其所表達(dá)的強(qiáng)度 實(shí)驗(yàn)安排第一天 上午配試劑 滅菌 下午開(kāi)始接種 約3h 4h后開(kāi)始誘導(dǎo) 步驟2 3 第二天 收菌 紫外觀察結(jié)果和拍照 破碎細(xì)菌 分離上清 待過(guò)柱 思考與討論對(duì)紫外燈下觀察到的結(jié)果作出解釋 為什么誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌要在其OD600濃度約為0 5時(shí)加入IPTG 大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)常受哪些因素的影響 實(shí)驗(yàn)十二金屬鰲合親和層析分離目的蛋白質(zhì) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理材料與試劑實(shí)驗(yàn)儀器操作步驟注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)安排思考與討論 一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)親和層析的原理 掌握親和層析法分離蛋白質(zhì)的技術(shù)與操作 實(shí)驗(yàn)原理以普通凝膠作載體 連接上金屬離子制成螯合吸附劑 用于分離純化蛋白質(zhì) 這種方法稱為金屬螯合親和層析 蛋白質(zhì)對(duì)金屬離子具有親和力是這種方法的理論依據(jù) 已知蛋白質(zhì)中的組氨酸和半胱氨酸殘基在接近中性的水溶液中能與鎳或銅離子形成比較穩(wěn)定的絡(luò)合物 因此 連接上鎳或銅離子的載體凝膠可以選擇性地吸附含咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì) 過(guò)渡金屬元素鎳在較低pH范圍時(shí) pH6 8 有利于選擇性地吸附帶咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì) 在堿性pH時(shí)吸附更有效 但選擇性降低 金屬螯合親和層析在很大程度上 由被吸附的肽和蛋白質(zhì)分子表面咪唑基和巰基的稠密程度所支配 吲哚基可能也很重要 用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)含有特定的組氨酸標(biāo)簽 這種可溶性蛋白質(zhì)能用金屬親和層析法進(jìn)行分離 且操作簡(jiǎn)單 快速 純化效率高 材料與試劑材料含pUC18質(zhì)粒工程菌及含重組pGFPuv質(zhì)粒工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞裂解蛋白 試劑0 05mol LEDTA 0 5mol LNaCl溶液50mL2mol LNaCl溶液50mL1mol LNaOH溶液50mL0 2mol LNiSO4溶液30mL 起始緩沖液 50mmol LTris HCl 500mmol LNaCl pH7 0500mLChelatingSepharoseFastFlow4 5mL大腸桿菌細(xì)胞裂解蛋白樣品10 20mL洗滌液 50mmol L咪唑 50mmol LTris HCl 0 5mol LNaCl pH7 0洗脫液 300mmol L咪唑 50mmol LTris HCl 0 5mol LNaCl pH7 0 實(shí)驗(yàn)儀器1 5cmX50cm層析柱 自動(dòng)分部收集器 紫外分光光度計(jì) 紫外檢測(cè)儀及記錄儀等 操作步驟樣品的制備 細(xì)胞的培養(yǎng)及熒光蛋白表達(dá)見(jiàn)實(shí)驗(yàn)十 細(xì)胞的破碎及蛋白的收集如下 收集在25 培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液 5000r min 離心10min 去上清液 菌體用起始緩沖液洗滌一次 離心收集菌體 用三分之一 細(xì)胞培養(yǎng)液 體積 15mL 的起始緩沖液充分懸浮 冰浴下進(jìn)行超聲波處理 功率為400W 工作4秒 間隙4秒 為一次 99次為一周期 共處理六周期 然后8000r min 離心30min 取上清液 放冰箱備用 親和層析柱的安裝把層析柱固定在鐵支架上 柱下端出口封閉 加入少量的無(wú)離子水 排去下端的空氣泡 取出20 乙醇浸泡的螯合凝膠4mL到燒杯中 加入少量的無(wú)離子水制成糊狀 沿著貼緊柱內(nèi)壁的玻璃棒把糊狀凝膠倒進(jìn)柱內(nèi) 打開(kāi)下端的排水口 讓親和凝膠劑隨水流自然沉下 親和層析劑為4 5mL 親和凝膠的再生處理 用10倍柱體積的再生溶液 0 05mol LEDTA 0 5mol LNaCl 過(guò)柱 流速3mL min 1drops 2s 用5倍柱體積的2mol LNaCl溶液洗親和層析柱除去多余的EDTA 流速3mL min 用5倍柱體積的1mol LNaOH溶液洗滌層析柱 流速2mL min 用10倍柱體積的無(wú)離子水洗至pH8 9 流速3mL min 用2倍柱體積的0 2mol L的硫酸鎳溶液過(guò)層析柱 使凝膠金屬鎳離子結(jié)合 流速2mL min 過(guò)完后放置5分鐘 用10倍柱體積的無(wú)離子水洗滌層析柱除去多余的鎳離子 流速3mL min 用5倍柱體積的起始緩沖溶液平衡層析柱 備用 上樣 先從15mL裂解上清液中取出50 L準(zhǔn)備用于電泳 作為親和層析分離前上清液中的總蛋區(qū)帶對(duì)照?qǐng)D譜 Sample3 然后以每分鐘1mL的流速上層析柱 分部收集流出液 每管3mL 測(cè)得的OD280值曲線為穿流峰 取最高的一管樣品液用作電泳 標(biāo)Sample4 再用10mL起始緩沖液過(guò)層析柱 操作同前 洗滌 用含50mmol L咪唑的洗滌緩沖液25mL洗脫 分部收集洗脫液 每管5mL 取中間管樣品電泳 Sample5 洗脫 用含300mmol L咪唑的洗脫緩沖液10mL洗脫 用Ep管分部收集洗脫液 每管收0 5mL 測(cè)得的OD280值曲線峰為目的蛋白峰GFP 標(biāo)Sample6 12 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè) 進(jìn)行12 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)親和層析分離純化的結(jié)果 Sample1 6 外加Marker 見(jiàn)實(shí)驗(yàn)十一 注意事項(xiàng)不管是裝柱還是上樣 洗脫 在整個(gè)操作過(guò)程中 水或溶液面都不能低于凝膠柱平面 否則 凝膠柱會(huì)產(chǎn)生氣泡 就會(huì)影響層析效果 樣品上柱和洗脫過(guò)程 其流速都要慢 分離效果才好 親和層析劑可回收 經(jīng)再生可循環(huán)使用 該親和層析劑用20 乙醇浸泡于冰箱保存 親和層析柱在再生處理 上樣 洗脫過(guò)程中其顏色都有明顯變化 白 藍(lán) 綠 只要細(xì)心操作 樣品是否被吸附上去或被洗脫下來(lái) 都能觀察到從而作出判斷 實(shí)驗(yàn)安排先用母液配制其它未配制溶液 再生鎳柱 然后 過(guò)柱純化重組蛋白 思考與討論解釋IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的熒光蛋白經(jīng)12 SDS PAGE電泳結(jié)果圖譜 鎳柱在再生處理 上樣 洗脫過(guò)程中其顏色有何變化 為什么 要達(dá)到好的分離效果要注意哪些問(wèn)題 實(shí)驗(yàn)十一SDS PAGE電泳分離蛋白質(zhì) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理材料與試劑實(shí)驗(yàn)儀器操作步驟注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)安排思考與討論 一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私釹DS PAGE靈敏度高 分辯率強(qiáng)的原理 用此法分析不同條件下培養(yǎng)的菌其熒光蛋白表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)原理聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體 acrylamide 簡(jiǎn)稱ACR 和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺 N N methylenebisacrylsmide簡(jiǎn)稱BIS 在催化劑的作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠 通過(guò)改變單體濃度與交聯(lián)劑的比例可以得到不同孔徑的凝膠 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種 1 化學(xué)聚合 催化劑采用過(guò)硫酸銨 加速劑為N N N N 四甲基乙二胺 簡(jiǎn)稱TEMED 通?？刂七@兩種溶液的用量使聚合在1h內(nèi)完成 2 光聚合 通常用核黃素為催化劑 通過(guò)控制光照時(shí)間和強(qiáng)度來(lái)控制聚合時(shí)間也可加速反應(yīng) 本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)聚合 聚丙烯酰胺凝電泳常分為二大類 第一類為連續(xù)的凝膠 僅有分離膠 電泳 第二類為不連續(xù)的凝膠 濃縮膠和分離膠 電泳 通常聚丙烯酰胺凝膠 不連續(xù) 電泳有三種效應(yīng) 電荷效應(yīng) 電泳物所帶電荷的差異性 凝膠的分子篩效應(yīng) 凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及電泳物的大小形狀不同所致 濃縮效應(yīng) 凝膠濃度的不連續(xù)性 緩沖液離子成分的不連續(xù)性 電位梯度的不連續(xù)性以及pH的不連續(xù)性所致 因此 樣品分離效果好 分辨率高 SDS PAGE 是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS 十二烷基磺酸鈉 SDS破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu) 強(qiáng)還原劑使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂 因此 蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中 與SDS分子按比例結(jié)合 形成帶負(fù)電荷的SDS 蛋白質(zhì)復(fù)合物 這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS 降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異 而由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按大小成比例的 在進(jìn)行電泳時(shí) 蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小 當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí) 蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系 符合下式 logMW K bX 式中 MW為分子量 X為遷移率 k b均為常數(shù) 試劑 30 的凝膠貯備液 Acr29g Bis1g溶于100mL去離子水中 避光貯存棕色瓶中 3MTris HCl pH8 9 36 6gTris base 48mL1MHCl dH2O至100mL 5 Tris 甘氨酸電泳buffer pH8 3 Tris base15 1g 甘氨酸94g 5gSDS H2O至1L 用時(shí)稀釋5倍 10 SDS 10gSDS溶解于100mL去離子水中 貯存于室溫中 0 5MTris HCl pH6 8 6 05gTris base 48mL1MHCl dH2O至100mL TEMED 四甲基乙二胺 濃度10 20mL 共用 10 AP 過(guò)硫酸銨 10mL 1gAP溶解于10mL去離子水中 新鮮配制 2x樣品緩沖液 100mMTris HCl pH6 8 200mMDTT 二硫蘇糖醇 4 SDS0 2 溴酚藍(lán)20 甘油 考馬斯亮藍(lán)染色液 0 25g考馬斯亮藍(lán)R250溶于45mL甲醇中 加10mL冰醋酸 H2O至100mL 濾紙過(guò)濾除去不溶物 脫色液 75mL冰乙酸 50mL甲醇 875mLH2O 如只配500mL 各物質(zhì)減半 實(shí)驗(yàn)儀器電泳儀 垂直板電泳裝置 微量進(jìn)樣器 50 L 染色 脫色搖床等 操作步驟膠板模型的安裝 在干凈的帶隔板的玻璃板的三條邊上把橡膠條壓上 然后將另一塊凹形玻璃板壓上 放入電泳槽中 示范 12 分離膠的制備 每次配10mL 去離子水3 2mL30 凝膠液4 0mL3mol LTris HCl pH8 9 2 6mL10 SDS0 1mL10 APS0 1mLTEMED0 005mL 用手輕搖約2分鐘混勻 注意不要產(chǎn)生氣泡 小心將混合液注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中 為濃縮膠留足夠的空間 輕輕在頂層加入幾毫升去離子水復(fù)蓋 以阻止空氣中氧對(duì)凝合的抑制作用 剛加入水時(shí)可看出水與膠液之間有界面 后漸漸消失 不久又出現(xiàn)界面 這表明凝膠已聚合 再靜置片刻使聚合完全 注意 為避免凝膠過(guò)快聚合 配膠用的無(wú)離子水 30 的凝膠液及Tris HCl緩沖液應(yīng)事先于4 或冰上放置 以下同 濃縮膠的制備 先吸去已聚合好的分離膠上層的水 用水洗界面一次 再用濾紙吸干殘留的水液 按下列配方制備5毫升濃縮膠溶液 混合后將其注入分離膠上端 插入梳子應(yīng)小心避免氣泡 去離子水3 2mL30 凝膠液0 83mL0 5MTris HCl pH6 8 0 75mL10 SDS0 050mL10 AP0 050mLTEMED0 005mL 在濃縮膠聚合的同時(shí) 將樣品與5 樣品緩沖液 16 L 4 L 混合 100 加熱3分鐘以變性蛋白質(zhì) Sample1 2用600 L起始緩沖液懸浮 取16 L同上操作 濃縮膠聚合完全后 小心地拔出梳子 用無(wú)離子水沖洗梳孔 將凝膠模板放入電泳槽上固定好 上下槽均加入1X電泳緩沖液 檢查有無(wú)漏液 除去兩玻璃板間凝膠底部的氣泡 上樣前用上槽緩沖液沖洗梳子孔 按次序上樣 用微量進(jìn)樣器往凝膠梳孔中加樣品混合液 20 L 孔 一孔加一個(gè)樣品 同時(shí)安排已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物作對(duì)照 電泳 開(kāi)始時(shí)濃縮膠電壓為80V 染料進(jìn)入分離膠后 將電壓增到120V 繼續(xù)電泳至染料 溴