2020年血凝實(shí)驗(yàn)操作報(bào)告.doc

血凝實(shí)驗(yàn)操作報(bào)告 隨著養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展和廣大養(yǎng)殖戶(hù)科學(xué)意識(shí)的不斷提高，人們普遍認(rèn)識(shí)到實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)在臨床應(yīng)用的重要性，發(fā)病率越來(lái)越高。下面為大家了關(guān)于血凝的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，希望對(duì)你有鎖幫助！ 篇一：禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn) 禽流感血凝-血凝抑制試驗(yàn)操作方法及注意事項(xiàng) 禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)可用于血清中抗體水平的監(jiān)測(cè)，也可用于判斷未使用疫苗群體的感染狀態(tài)等。該試驗(yàn)是目前世界衛(wèi)生組織和國(guó)際動(dòng)物健康組織進(jìn)行全球流感監(jiān)測(cè)所普遍采用的方法，而且因其具有經(jīng)濟(jì)、快速、可靠、操作簡(jiǎn)便、能夠處理大量的樣品，并能在短時(shí)間內(nèi)報(bào)告禽流感抗體水平等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為當(dāng)前基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室禽流感疫病監(jiān)測(cè)和免疫抗體檢測(cè)中最為常用的方法。但因該試驗(yàn)受人為操作影響較大，經(jīng)常因操作不規(guī)范、不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)仍斐山Y(jié)果偏差大、重復(fù)性差等問(wèn)題，現(xiàn)根據(jù)幾年來(lái)的工作經(jīng)驗(yàn)對(duì)該試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)做一探討。 一、血凝試驗(yàn)操作程序 1、取96孔90V形酶標(biāo)板，用微量移液器在第一至第五排的112孔每孔加25LPBS液。 2、吸取25L標(biāo)準(zhǔn)禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混勻。 3、從第1孔吸取25L混勻后的抗原液加到第2孔中，混勻后吸取25L加入到第3孔中，依次進(jìn)行倍比稀釋至第二排最后一孔即第24孔，最后棄去25L。第三排孔至第四排孔同上操作。 4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25L1%的雞紅細(xì)胞懸液。 5、將酶標(biāo)板置于微量振蕩器上振蕩10秒，室溫（20-25）靜置30min觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4環(huán)境下）。 6、結(jié)果判定：將板作45傾斜，觀察紅細(xì)胞是否呈淚滴狀流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀釋倍數(shù)為1個(gè)血凝單位（HAU） 二、血凝抑制試驗(yàn)操作程序 1、根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4） 2、取96孔V形酶標(biāo)板，用移液器在第112孔各加入25LPBS。 3、在第1孔加入25L被檢血清，充分混勻后移出25L加至第2孔，依次類(lèi)推，倍比稀釋至第12孔，棄去25L。 4、按以上步驟加入陽(yáng)性血清和陰性血清（各做兩份），作對(duì)照孔。 5、在第112孔各加入25L4單位抗原，置于微量振蕩器上輕輕混勻，室溫20-25下靜置30min。 6、每孔加入25L1%的雞紅細(xì)胞懸液。置于微量振蕩器上輕輕混勻，室溫（20-25）靜置40min后觀察結(jié)果，若環(huán)境溫度過(guò)高，可于4條件下進(jìn)行，紅細(xì)胞將呈明顯的紐扣狀沉到孔底。 7、結(jié)果判定：只有陰性對(duì)照孔血清滴度不大于2log2，陽(yáng)性對(duì)照孔誤差不超過(guò)1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。將酶標(biāo)板作45傾斜，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)判為該血清的血凝抑制滴度。當(dāng)被檢血清效價(jià)大于等于4log2，判為禽流感抗體陽(yáng)性。 三、試驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng) 1樣品的保存及試驗(yàn)前處理 1.1采集的血液樣品應(yīng)及時(shí)分離血清，最好分裝至離心管中，標(biāo)記清楚，離心后吸出血清，對(duì)應(yīng)編號(hào)冷藏送檢，并禁止運(yùn)輸過(guò)程中劇烈震動(dòng)。 1.2一般情況下，在5天內(nèi)檢測(cè)的樣品可放置在4的冰箱中冷藏，否則低溫冷凍保存。 1.3在檢測(cè)前血清樣品應(yīng)充分混勻，混勻時(shí)采用上下緩慢顛倒幾次的方法即可，切忌劇烈振蕩而引起產(chǎn)生氣泡及血清中蛋白變性。 1.4對(duì)出現(xiàn)膠凍狀的血清樣品，可采用反復(fù)攪動(dòng)幾下再離心的方法有助于緩解該狀態(tài)。膠狀物是含纖維蛋白和纖維蛋白原的血清，可能是由于放置時(shí)間不夠造成的血清未完全析出狀態(tài)。不建議直接吸取其中少量的清亮血清。 1.5水禽等樣品為排除非特異性反應(yīng)，還應(yīng)相應(yīng)進(jìn)行滅能反應(yīng)。具體操作方法：56水浴鍋30min或加等量10%雞紅細(xì)胞，輕搖后靜置30分鐘，離心，收集上清液即可。 2器材的選擇 2.1酶標(biāo)板的選擇： 建議使用96孔90V型板進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)證明：90V型板相對(duì)于110板及130板來(lái)講，具有紅細(xì)胞沉降速度快，產(chǎn)生的凝集圖像清晰、結(jié)果容易判定等優(yōu)點(diǎn)。 2.2移液槍的選擇及使用： 單道、多道可調(diào)微量移液槍?xiě)?yīng)選擇合適的量程，以便精確度的提高。 使用時(shí)應(yīng)采用一檔吸液二檔排液的方法。吸取液體時(shí)，槍頭要深入液下緩慢平穩(wěn)吸液。加緩沖液時(shí) 應(yīng)加在板孔底部。倍比稀釋血清時(shí)，應(yīng)每孔至少反復(fù)吹吸6次，以便混合均勻，還應(yīng)注意盡量避免產(chǎn)生泡沫引起混合不均。加抗原及紅細(xì)胞時(shí)應(yīng)在板內(nèi)液面上方加樣，以免交叉污染，影響試驗(yàn)結(jié)果。 加樣、倍比稀釋時(shí)應(yīng)高度集中注意力，以免漏加、重復(fù)加樣等。 3試劑的保存及配置 3.1禽流感血凝抑制試驗(yàn)所用的抗原、陽(yáng)性血清應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行保存和配置，試驗(yàn)前應(yīng)提前將其恢復(fù)至室內(nèi)溫?？乖谋４鏈囟葹?20，反復(fù)凍融會(huì)降低抗原的滴度，應(yīng)避免反復(fù)凍融。 3.2PH7.2、0.01mol/L的PBS液的制備 應(yīng)盡量現(xiàn)用現(xiàn)配 每次使用前應(yīng)測(cè)PH值，以免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致PH值發(fā)生改變。 由于PH試紙跨度范圍偏大，PH值不易準(zhǔn)確介定，因此最好采用酸度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)量PH值，以提高試驗(yàn)的精確度。 全部試驗(yàn)均采用同一種稀釋液。 3.31%紅細(xì)胞的制備 為避免有些雞只的紅細(xì)胞有自凝現(xiàn)象，因此配制1%紅細(xì)胞懸液時(shí)應(yīng)最好選擇采取2-3只SPF雞或未進(jìn)行過(guò)任何免疫過(guò)的成年公雞血液。當(dāng)然采血的前提條件是要按十分之一采血量比例在一次性注射器中加入抗凝劑，如肝素、枸椽酸鈉、檸檬酸鈉等。 采血完畢后最好分裝至2ml容量的圓底離心管中，因?yàn)橥ㄟ^(guò)2ml與1.5ml兩種容量離心管相比較，放入1.5ml尖底離心管中的話，離心后，離心管底部紅細(xì)胞不易與加入的PBS液混勻，易沉積在管底部，達(dá)不到洗脫干凈的目的。 經(jīng)20003000r/min，510min，棄去上液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液，上下緩慢顛倒（切忌用力過(guò)大使紅細(xì)胞破裂），使其充分混勻，再離心棄去上清液，反復(fù)幾次直至上清液清亮透明為止。 在加紅細(xì)胞過(guò)程中還須不斷輕搖以確保紅細(xì)胞均勻，使其每孔加入相同數(shù)量的紅細(xì)胞。 制備好的紅細(xì)胞液如果放置后上清液變紅，說(shuō)明有溶血，不可再使用。 3.4抗原液的配制 先做血凝試驗(yàn)測(cè)定效價(jià)，以抗原與紅細(xì)胞完全凝集的孔為1HUA抗原，配制4HUA抗原應(yīng)往前推算兩孔，即除以4后的值。 每次做試驗(yàn)前，必須重新檢測(cè)禽流感抗原的血凝效價(jià)，以免效價(jià)發(fā)生改變而導(dǎo)致抗原稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確，從而導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。 為保證配制的抗原準(zhǔn)確，還要進(jìn)行抗原回滴試驗(yàn)。具體方法：做二排抗原回滴，在兩排的第18孔各加25微升PBS，取4HAU抗原25微升加在兩排的第1、第2孔，混勻，從第2孔倍比稀釋至第4孔，棄去25微升，另一排同樣。從第2至第8孔補(bǔ)25微升PBS，以保持75微升總量不變，另一排同樣。兩排的第1至第8孔各加25微升1%紅細(xì)胞，震蕩10秒鐘。靜置30分鐘觀察結(jié)果。這樣在第1孔為4HAU抗原，第2孔為2HAU抗原，第3孔為1HAU抗原，第4孔為1/2HAU抗原，均為75微升總量，第5至第8孔為空白對(duì)照。如果抗原回滴試驗(yàn)不成立，應(yīng)相應(yīng)調(diào)整抗原濃度直至回滴試驗(yàn)成立。因?yàn)槿绻乖瓭舛冗^(guò)高，則所測(cè)定的抗體效價(jià)水平偏低，如果抗原濃度過(guò)低，則所測(cè)定的效價(jià)偏高。所以不調(diào)整抗原濃度至實(shí)驗(yàn)成立的話會(huì)對(duì)結(jié)果有很大影響。 4結(jié)果的判定 每次試驗(yàn)必須設(shè)陽(yáng)性及陰性（空白）對(duì)照血清，判別試驗(yàn)是否成立。判讀結(jié)果時(shí)，將酶標(biāo)板傾斜45，以孔底沉淀的紅細(xì)胞流動(dòng)性好，呈淚珠樣流淌，邊緣無(wú)凝集顆粒為凝集完全抑制。 5試驗(yàn)器具的清洗 每次試驗(yàn)完畢后，應(yīng)將酶標(biāo)板中液體甩凈，然后用自來(lái)水反復(fù)沖凈每個(gè)孔，再放入3%NaOH中4小時(shí)，清水反復(fù)沖凈，再放入3%Hcl中4小時(shí)，清水反復(fù)沖凈，再用蒸餾水反復(fù)沖洗幾次，甩干水份，入干燥箱中干燥備用。實(shí)驗(yàn)用燒杯、加樣槽、量筒等也應(yīng)充分洗凈、干燥。以免器具內(nèi)有雜物、污物以及殘留物從而影響試驗(yàn)結(jié)果。 四、小結(jié) 在進(jìn)行禽流感血凝抑制試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)充分考慮到各方面的影響因素，提供的檢測(cè)結(jié)果才會(huì)真實(shí)可靠，準(zhǔn)確掌握禽類(lèi)的免疫抗體水平，進(jìn)而為科學(xué)防控禽流感提供理論依據(jù)。 篇二：血凝抑制試驗(yàn) 血凝抑制（HI）試驗(yàn)簡(jiǎn)介 （以禽流感病毒為例） 一、原理 流感病毒顆粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有識(shí)別并吸附于紅細(xì)胞表面受體的結(jié)構(gòu)，HA試驗(yàn)由此得名。HA蛋白的抗體與受體的特異性結(jié)合能夠干擾HA蛋白與紅細(xì)胞受體的結(jié)合從而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。 二、應(yīng)用 該試驗(yàn)是目前WHO進(jìn)行全球流感監(jiān)測(cè)所普遍采用的試驗(yàn)方法?？捎糜诹鞲胁《痉蛛x株HA亞型的鑒定，也可用來(lái)檢測(cè)禽血清中是否有與抗原亞型一致的感染或免疫抗體。 三、缺點(diǎn) 只有當(dāng)抗原和抗體HA亞型相一致時(shí)才能出現(xiàn)HI現(xiàn)象，各亞型間無(wú)明顯交叉反應(yīng)；除雞血清以外，用雞紅細(xì)胞檢測(cè)哺乳動(dòng)物和水禽的血清時(shí)需要除去存在于血清中的非特異凝集素；需要在每次試驗(yàn)時(shí)進(jìn)行抗原標(biāo)準(zhǔn)化；需要正確判讀的技能。 四、試驗(yàn)步驟 1阿氏（Alsevers）液配制 稱(chēng)量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，散熱溶解后調(diào)pH值至6.1， 69kPa15min高壓滅菌，4保存?zhèn)溆?。?.8%枸櫞酸鈉（3.8g枸櫞酸鈉，100ml超純水），101kPa,20min高壓滅菌，4保存?zhèn)溆?保存期1個(gè)月）。 210%和1%雞紅細(xì)胞液的制備 2.1采血 用注射器吸取阿氏液約1mL（3.8%枸櫞酸鈉），取至少2只SPF雞（如果沒(méi)有SPF雞，可用常規(guī)試驗(yàn)證明體內(nèi)無(wú)禽流感和新城疫抗體的雞），采血約24mL，與阿氏液混合（3.8%枸櫞酸鈉），放入裝10mL阿氏液（生理鹽水）的離心管中混勻。 2.2洗滌雞紅細(xì)胞 將離心管中的血液經(jīng)15001800r/min離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入阿氏液（生理鹽水），輕輕混合，再經(jīng)15001800r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再重復(fù)2次以上過(guò)程后，加入阿氏液20mL（生理鹽水），輕輕混合成紅細(xì)胞懸液，4保存?zhèn)溆?，不超過(guò)5天。 2.310%雞紅細(xì)胞懸液 取阿氏液保存不超過(guò)5天的紅細(xì)胞，在錐形刻度離心管中離心15001800r/min8分鐘，棄去上清液，準(zhǔn)確觀察刻度離心管中紅細(xì)胞體積(mL)，加入9倍體積(mL)的生理鹽水，用吸管反復(fù)吹吸使生理鹽水與紅細(xì)胞混合均勻。（此步 可省略，直接配制1%紅細(xì)胞） 2.41%雞紅細(xì)胞液 取混合均勻的10%雞紅細(xì)胞懸液1mL，加入9mL生理鹽水，混合均勻即可。（根據(jù)檢測(cè)血清的數(shù)量，估算一下需要的1%雞紅細(xì)胞量，可按0.3ml/每份血清） 3抗原血凝效價(jià)測(cè)定（HA試驗(yàn)，微量法） 3.1在微量反應(yīng)板的1孔12孔均加入25lPBS（生理鹽水），換滴頭。 3.2吸取25l抗原加入第l孔，混勻。 3.3從第1孔吸取25l，病毒液加入第2孔，混勻后吸取25l加入第3孔，如此進(jìn)行倍比稀釋至第11孔，從第11孔吸取25l棄之，換滴頭。 3.4每孔再加入25lPBS（生理鹽水）。 3.5每孔均加入25l體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液（將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻后加入）。 3.6振蕩混勻，在室溫（2025）下靜置40min后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4環(huán)境下反應(yīng)1小時(shí)）。對(duì)照孔紅細(xì)胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。 3.7結(jié)果判定將板傾斜，觀察血凝板，判讀結(jié)果（見(jiàn)下表）。 表1：血凝試驗(yàn)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) 能使紅細(xì)胞完全凝集（100%凝集，+）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價(jià)，此效價(jià)為1個(gè)血凝單位（HAU）。注意對(duì)照孔應(yīng)呈現(xiàn)完全不凝集（-），否則此次檢驗(yàn)無(wú)效。 4血凝抑制（HI）試驗(yàn)（微量法） 4.1根據(jù)3的試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點(diǎn)滴度為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:64（256除以4）。 4.2在微量反應(yīng)板的1孔11孔加入25lPBS（生理鹽水），第12孔加入50lPBS（生理鹽水）。 4.3吸取25l血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸25l于第2孔，依次倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取25l棄去。 4.41孔11孔均加入含4HAU抗原25l，室溫（約20）靜置至少30min。 4.5每孔加入25l1%的雞紅細(xì)胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20，若環(huán)境溫度太高可置4條件 下進(jìn)行），對(duì)照紅細(xì)胞將呈現(xiàn)鈕扣狀沉于孔底。 4.6結(jié)果判定 試驗(yàn)成立的條件：只有陰性對(duì)照孔血清滴度不大于21og2，陽(yáng)性對(duì)照孔血清誤差不超過(guò)1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。 以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。 HI價(jià)小于或等于31og2判定HI試驗(yàn)陰性；HI價(jià)大于或等于41og2為陽(yáng)性。 五、HI試驗(yàn)注意事項(xiàng) 1、合理選擇抗原和對(duì)照陽(yáng)性血清。針對(duì)Re-4和Re-5株疫苗免疫采用相應(yīng)抗原和對(duì)照陽(yáng)性血清。 同一亞型的禽流感病毒制成的抗原，如果毒株不同，則可能會(huì)存在抗原性差異，從而使檢測(cè)同一血清的結(jié)果有差別。一般來(lái)講，疫苗種毒株如果與抗原所用毒株相同時(shí)，則所測(cè)得的HI效價(jià)較高。 2、合理使用和保存抗原。反應(yīng)試劑要按規(guī)定保存和使用，凍干的試劑應(yīng)按照說(shuō)明中規(guī)定的體積重新溶解并保存。要避免雜菌污染，因?yàn)槲廴舅斐傻姆橇鞲衅鹪吹哪匾部膳c所有抗血清發(fā)生非特異反應(yīng)。為避免反復(fù)凍融和細(xì)菌污染，可以無(wú)菌操作將試劑分裝成小包裝。 3、反應(yīng)溫度不能太高。若在37（如溫箱）下進(jìn)行。 篇三：血凝和血凝抑制試驗(yàn) 隨著養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展和廣大養(yǎng)殖戶(hù)科學(xué)意識(shí)的不斷提高，人們普遍認(rèn)識(shí)到實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)在臨床應(yīng)用的重要性。下面簡(jiǎn)單介紹一下雞新城疫微量血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)的注意事項(xiàng)及操作方法。 應(yīng)用： 用于新城疫、產(chǎn)蛋下降綜合征和傳梁性支氣管炎等的母源抗體的檢測(cè)、雛雞首免日齡的確定、疫苗免疫后的免疫應(yīng)答的監(jiān)測(cè)、臨床雞病的鑒別診斷等。 下面以新城疫病毒為例，介紹血凝和血凝抑制試驗(yàn)的方法： 注意事項(xiàng)： 一、樣本要具有代表性：所采樣本要能代表整體，通常采用四角加中間的隨機(jī)取樣法，并且確定適當(dāng)?shù)臉悠窋?shù)量，一般1000只以下的雞群采樣率在25%；5000只以下12%；5000只以上0.51%。對(duì)產(chǎn)蛋期間的雞群可采雞蛋；對(duì)雛雞或青年雞，可采血。方法是：取青霉素小瓶，洗凈后用蒸餾水沖洗、控干水分，并注意不要用消毒劑，以免影響結(jié)果。每只雞采血量在1ml左右，最好不低于1ml，在室溫下靜置至血清自然析出。 二、四單位抗原的準(zhǔn)確性：要獲得準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)效果，先做紅血球的凝集試驗(yàn)，即測(cè)得抗原的血凝價(jià)，爾后前移2孔作為四單位抗原的稀釋度。 三、紅血球洗脫的充分性：原則上，新城疫檢測(cè)所用的紅血球應(yīng)非疫苗免疫過(guò)的健康公雞，但實(shí)際上卻多采用免疫過(guò)疫苗的健康公雞，有時(shí)甚至是病雞。因此，對(duì)紅血球的洗脫的次數(shù)要多、要充分，并注意轉(zhuǎn)速和時(shí)間，通常采用五次變速離心法：前四次為每分鐘1500轉(zhuǎn)，每次5分鐘，最后一次為每分鐘3000轉(zhuǎn)，持續(xù)78分鐘。另外，洗紅血球過(guò)程中，應(yīng)注意動(dòng)作要輕，玻璃儀器之間盡量減少碰撞，以免造成紅血球破裂而影響結(jié)果。 四、結(jié)果判定的及時(shí)性：檢測(cè)中，每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)抗原與生理鹽水對(duì)照，加入紅血球后，每隔5分鐘觀察一次，一旦兩列對(duì)照孔圖像清晰地顯示出來(lái)時(shí)，應(yīng)立即對(duì)樣本進(jìn)行結(jié)果判定，過(guò)早過(guò)晚都會(huì)影響判定結(jié)果的準(zhǔn)確性。 血凝與血凝抑制試驗(yàn)的操作方法 一、材料與儀器：新城疫抗原、1%雞紅血球、抗凝劑、生理鹽水、被檢血清、離心機(jī)、吸管、滴管、洗耳球、燒杯、量筒、注射器、長(zhǎng)針頭、96孔V型醫(yī)用血凝板、微量移液器、微量振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱等。 二、方法： 1%雞紅血球的制備： 1.用長(zhǎng)針刺入雞心臟或翅下靜脈，采血，采血量視用量而定，5%抗凝劑與全血的比例為134。 2.洗血球：共洗45次，每次58分鐘，紅血球與生理鹽水的比例至少為123。離心機(jī)轉(zhuǎn)速為每分鐘15003000轉(zhuǎn)，最后傾去上清。 3.吸紅血球泥1ml加生理鹽水99ml，配成1%紅血球備用。 三、