（植物病理學(xué)專(zhuān)業(yè)論文）稻瘟菌定殖與擴(kuò)展過(guò)程中特異表達(dá)基因分析.pdf

福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要 稻瘟病菌與水稻互作系統(tǒng)，是理想的病原菌與植物互作的模式系統(tǒng)，也是病害生態(tài) 控制的理想模式。為了探索稻瘟病菌與水稻互作的分子機(jī)理，本文采用基因芯片的方法 篩選了稻瘟病菌在定殖與擴(kuò)展過(guò)程中與水稻互作的特異表達(dá)基因，并對(duì)這些基因進(jìn)行初 步的分析和部分基因r t - p c r 驗(yàn)證。 基因芯片結(jié)果顯示，若以?xún)杀兜淖兓鳛闃?biāo)準(zhǔn)，在稻瘟病菌定殖和擴(kuò)展過(guò)程中，稻 瘟病菌共有3 3 0 9 個(gè)基因發(fā)生上調(diào)，3 4 5 3 個(gè)基因發(fā)生下調(diào)；水稻有9 7 4 個(gè)基因上調(diào)，1 1 3 4 個(gè)基因下調(diào)。參照n c b i 數(shù)據(jù)庫(kù)、稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫(kù)和水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合p r o t c o m p8 0 軟件，對(duì)基因芯片結(jié)果中稻瘟病菌中上調(diào)最大的1 2 2 個(gè)基因，下調(diào)最大的6 7 個(gè)基因； 水稻上調(diào)最大的6 2 個(gè)基因，下調(diào)最大的7 個(gè)基因，進(jìn)行基因表達(dá)產(chǎn)物的分析和亞細(xì)胞 定位。并對(duì)基因芯片中稻瘟病菌上調(diào)最大的2 0 個(gè)基因進(jìn)行r t - p c r 的驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 其中有1 8 個(gè)基因與基因芯片結(jié)果一致，有2 個(gè)基因未能擴(kuò)增得到產(chǎn)物。 主題詞：稻瘟病菌水稻基因芯片互作差異表達(dá) 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 a b s t r a c t t h es y s t e mo fr i c e m a g n a p o r t h eg r i s e a , i sa ni d e a lm o d e ls y s t e mo ft h ep l a n t s i n t e r a c t i o nw i t ht h e i rp a t h o g e n sa n dt h ee c o l o g i c a lc o n t r o lo fp l a n td i s e a s e i no r d e rt o u n d e r s t a n dt h ei n t e r a c t i o nm o l e c u l a rm e c h a n i s mb e t w e e nm a g n a p o r t h eg r i s e aa n dr i c e ，t h e s p e c i f i ce x p r e s s i o ng e n e sd u r i n gt h ep a t h o g e ni n f e c t i o nw e r es c r e e n e do u tb yt h et e c h n o l o g y o fg e n ec h i pa n ds o m eo ft h e mw e r ev e r i f i e db yr t - p c r 。 t h er e s u l to fg e n ec h i pe x p e r i m e n ts h o w e dt h a t ，f o rm o r et h a n2 - f o l dc h a n g e ，t h e r ew e r e 3 3 0 9u p - r e g u l a t e dg e n e sa n d3 4 5 3d o w n r e g u l a t e dg e n e sf r o mm a g n a p o r t h e g r i s e a ；a n d9 7 4 u p r e g u l a t e dg e n e sa n d113 4d o w n r e g u l a t e dg e n e sf r o mr i c e t h en c b i ，m a g n a p o r t h e g r i s e ag e n o m ea n dr i c eg e n o m ea n n o t a t i o np r o j e c td a t a b a s e s ，a n dp r o t c o m p8 0s o f t w a r e w e r eu s e dt oa n n o t a t et h ep r o t e i n sa n dt h e i rs u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n so ft h em o s to b v i o u s l y c h a n g e dg e n e s ，i nw h i c h 12 2u p r e g u l a t e da n d6 6d o w n r e g u l a t e dg e n e sf r o mm g r i s e a ，a n d 6 2u p r e g u l a t e da n d6 6d o w n r e g u l a t e dg e n e sf r o mr i c e f i n a l l y , t h et o p2 0u p - r e g u l a t e d g e n e sw e r es e l e c t e df r o mm a g n a p o r t h eg r i s e aa n dv e r i f i e db yr t - p c ra n a l y s i s k e yw o r d s ：m a g n a p o r t h e g r i s e a r i c e g e n ec h i pi n t e r a c t i o n d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n i i 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學(xué)位( 畢業(yè)) 論文，是本人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下獨(dú)立完 成的研究成果，并且是自己撰寫(xiě)的。盡我所知，除了文中作了標(biāo)注和致謝中已作 了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果。與我一同對(duì)本 研究做出貢獻(xiàn)的同志，都在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意，如被查有侵犯 他人知識(shí)產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)應(yīng)有的責(zé)任。 學(xué)位( 畢業(yè)) 論文作者親筆繇鑰剪螗日期：妒尹似 論文使用授權(quán)的說(shuō)明 本人完全了解福建農(nóng)林大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位( 畢業(yè)) 論文的規(guī)定，即學(xué) 校有權(quán)送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕?部分內(nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。 保密，在年后解密可適用本授權(quán)書(shū)。 口 不保密，本論文屬于不保密。日 學(xué)位( 畢業(yè)) 論文作者親筆簽名：劫遺考烀 日期： 礦尸 心 指導(dǎo)教師親筆簽名： 日期： 一 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 l 刖百 寄主植物與病原微生物的相互作用在自然界中是廣泛存在的，也是長(zhǎng)期以來(lái)兩者之 間相互選擇的結(jié)果。體現(xiàn)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，一個(gè)抗病品種的大面積使用后，致病菌中很快 就會(huì)出現(xiàn)新的致病生理小種，并大量繁殖，最后使原抗病品種的抗病性喪失。因此，找 到農(nóng)作物與病原菌之間互作的機(jī)理，具有深遠(yuǎn)的理論意義和重大的實(shí)際意義。 目前對(duì)寄主植物與病原微生物互作的解釋有“基因?qū)颉奔僬f(shuō)和后人對(duì)該假說(shuō)的 補(bǔ)充，即：植物抗病性是由植物的抗病基因r 與相應(yīng)的病原物的無(wú)毒基因a v r 的相互 作用所決定的，r 基因和a v r 基因稱(chēng)為主效基因；同時(shí)還有一些基因的表達(dá)產(chǎn)物由于 涉及信號(hào)傳導(dǎo)、植物防衛(wèi)基因的激活及與微生物毒性基因互作等，可能會(huì)影響植物與微 生物互作的表現(xiàn)，但效應(yīng)遠(yuǎn)不及r 基因和a v r 基因，被稱(chēng)為微效多基因。因此，如果 找出這些基因，并明確它們的作用機(jī)理，對(duì)揭示寄主植物與病原微生物互作原理和解決 病原菌致病的關(guān)鍵問(wèn)題將有很大幫助。 而新興的基因芯片技術(shù)，使人們能夠同時(shí)高通量地檢測(cè)基因表達(dá)及基因間的相互作 用，因而得到廣泛的應(yīng)用。該方法也是全面獲取植物與病原微生物互作后差異表達(dá)基因 的有利工具。 水稻是我國(guó)主要糧食作物之一，種植面積最廣。稻瘟病菌( m a g n a p o r t h eg r i s e a b a r n ) 侵染水稻引起的稻瘟病是影響水稻生產(chǎn)的三大主要病害之一。由于水稻是禾本科 的模式植物，稻瘟病菌是致病絲狀真菌的模式生物，并且水稻和稻瘟病菌的基因組測(cè)序 工作也先后完成【1 3 】。因而，研究水稻與稻瘟菌互作系統(tǒng)是研究植物與致病微生物相互 作用的最佳模式系統(tǒng)之一。本研究采用基因芯片技術(shù)，找出稻瘟病菌與水稻互作中差異 表達(dá)基因，從而為揭示稻瘟病菌與水稻的互作機(jī)理打下研究基礎(chǔ)。 1 1 稻瘟病菌生物學(xué)特性及致病相關(guān)基因的研究現(xiàn)狀 稻瘟病菌( m a g n a p o r t h eg r i s e ab a r r ) 弓l 致的水稻稻瘟病是世界性的水稻重要病害，并 且易暴發(fā)成災(zāi)，一般可導(dǎo)致水稻減產(chǎn)1 0 2 0 【1 1 ，重則造成水稻絕收，直接關(guān)系到世界 糧食的安全生產(chǎn)問(wèn)題。因此，多年來(lái)無(wú)數(shù)科學(xué)家針對(duì)該病的發(fā)生流行規(guī)律、綜合防治策 略和措施等方面開(kāi)展了大量研究。稻瘟病菌作為絲狀子囊菌，易于開(kāi)展遺傳分析，在生 長(zhǎng)發(fā)育、侵染致病機(jī)制等方面有許多特點(diǎn)，同時(shí)稻瘟病菌還可侵染大麥、小麥、粟等禾 本科植物，以及可以從葉、莖、根侵染水稻，引發(fā)同樣的癥狀【4 5 】，因此，它成為研究絲 狀真菌生長(zhǎng)發(fā)育和侵染致病機(jī)制的重要模式生物【6 7 】。 二十世紀(jì)八十年代后，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，科學(xué)工作者們明確了水稻與稻瘟病 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 菌的互作符合基因?qū)蚣僬f(shuō)，并從分子水平證明了這一互作機(jī)制【1 3 】。并且研究者們 普遍認(rèn)為稻瘟病也已成為研究植物病原真菌與寄主互作較為理想的模式系統(tǒng)之一【6 8 9 】。 z h u 等人通過(guò)不同水稻品種混栽增加遺傳多樣性以控制稻瘟病的研究，使得該病害系統(tǒng) 成為研究病害生態(tài)控制的理想模式【1 0 】。而在該研究系統(tǒng)中，與稻瘟病菌侵染相關(guān)的分子 遺傳學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究已取得較大的進(jìn)展【6 】。特別是該菌基因組全序列的測(cè)定，極大 地推進(jìn)了該菌的研究。至今，已報(bào)道了數(shù)十個(gè)與稻瘟病菌致病相關(guān)的基因，另外還有一 部分與生長(zhǎng)、產(chǎn)孢等形態(tài)分化過(guò)程有關(guān)的基因也已得到克隆和研究。這些研究為最終揭 示稻瘟病菌致病及與寄主互作的機(jī)理奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，同時(shí)也為該病的防治提供了理 論依據(jù)。 1 1 1 稻瘟病菌的生物學(xué)特性 稻瘟病菌的有性世代為m a g n a p o r t h eg r & e a ( h e b e r t ) b a r r ，屬于子囊菌亞門(mén)。無(wú)性世 代為p y r i c u l a r i ag r i s e a ( c o o k e ) s a c e ，稱(chēng)為灰梨孢( = p y r i c u l a r i ao r y z a ec a v ，稱(chēng)稻梨孢) ， 屬于半知菌亞門(mén)。稻瘟病菌侵染致病包括接觸、侵入、擴(kuò)展等過(guò)程。稻瘟病菌分生孢子 著落在寄主植物表面，依靠頂端的膠狀物緊緊地粘著在疏水植物組織表面，在有水珠的 條件下便很快萌發(fā)形成芽管，4 h 內(nèi)分化出附著胞 1 1 - 1 3 】。成熟附著胞壁內(nèi)層可以沉積大量 的黑色素，而在附著胞和植物表面間黑色素不沉淀或很少沉積。在附著胞朝向植物表面 的一端基部有附著胞小孔，由于黑色素的沉積使細(xì)胞壁上的孔徑小于l n m ，僅允許小分子 物質(zhì)通過(guò)，而甘油等有機(jī)分子不能通過(guò)，從而維持一定的滲透壓，即膨壓。h o w a r d 等 通過(guò)試驗(yàn)計(jì)算出稻瘟病菌的一個(gè)附著胞可以產(chǎn)生的壓強(qiáng)為6 - 8 m p a ，是汽車(chē)輪胎壓強(qiáng)的 3 0 4 0 倍【1 5 16 1 。有巨大膨壓的附著胞致使侵入栓有足夠的力量穿過(guò)寄主的角質(zhì)層，侵入 寄主組織內(nèi)部。已有試驗(yàn)表明，不產(chǎn)生黑色素、沒(méi)有甘油積累的附著胞突變體往往失去 侵染致病能力或需要通過(guò)人為造傷以后才能致病【1 3 1 4 】。 稻瘟病菌的侵入栓刺穿細(xì)胞壁進(jìn)入寄主表皮細(xì)胞，在侵入的最初細(xì)胞內(nèi)形成侵染菌 絲。在水稻葉片內(nèi)，侵染菌絲在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間迅速延伸，在接種的7 2 h 后，病原菌的 生物量已經(jīng)達(dá)到感染葉片的1 0 t 1 7 1 。稻瘟病菌侵入5 7 天后，水稻葉片上形成可見(jiàn)的灰 色病斑。病菌菌絲在病斑處產(chǎn)生分生孢子梗，從氣孔或直接穿透寄主表皮暴露到空氣中， 在分生孢子梗頂端形成無(wú)性分生孢子。有試驗(yàn)證明，稻瘟病菌每夜可向田間釋放 2 0 0 0 6 0 0 0 個(gè)孢子，并能持續(xù)2 周左右 18 1 。成熟的分生孢子，借風(fēng)傳播，可達(dá)2 0 k i n ，在 高達(dá)2 3 0 0 m 的高空也可收集到稻瘟病菌的分生孢子，分生孢子隨風(fēng)雨接觸到新的水稻植 株，開(kāi)始新輪的循環(huán)【1 9 】。 2 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 2 稻瘟病菌致病相關(guān)基因的研究現(xiàn)狀 在整個(gè)稻瘟病菌侵染水稻的過(guò)程中，病菌和寄主兩方面都有大量的基因參與【2 0 1 ，僅 病菌方面就包括如下三類(lèi)：一類(lèi)是與侵染有關(guān)的形態(tài)分化過(guò)程信號(hào)識(shí)別基因：第二類(lèi)是 與毒性相關(guān)的無(wú)毒基因、毒性決定因子等；第三類(lèi)是與病菌在侵入水稻組織后定殖和擴(kuò) 展有關(guān)的基因【2 1 1 。已有的大量研究主要集中在附著胞的分化以及侵染早期相關(guān)的基因， 弧m p g l 、p t h l i 、c p k a 、生c l 、m a g b 、p m k l 、a l b l 、r s y l 、b u f l 、p t h 2 、t p s l 、 p l s l 、m s t l 2 、m s t l l 、m s t 7 、m p s l 、c b p l 、g a s i 、g a s 2 、p d e l 、c y p l 、m h p l 等【6 2 2 2 3 1 。它們有的參與附著胞分化的信號(hào)傳導(dǎo)，如識(shí)別表面疏水信號(hào)的m p g l 、p 刀訂j 基因，進(jìn)行信號(hào)傳遞的c p k a 、m a c ，、m a g b 、p 紜j 、m s t l l 、m s t 7 等基因，這些 基因識(shí)別的信號(hào)經(jīng)g 蛋白，激活細(xì)胞內(nèi)的c a m p 和m a p k 蛋白激酶等信號(hào)途徑，決定 了該菌附著胞的形成【2 3 2 5 2 6 1 。它們有的參與形成附著胞的正常功能，如黑色素合成基 因a l b l 、b u f l 和r s y l ，肉毒堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因p t h 2 和海藻糖合成酶基因t p s l 等與 附著胞中膨壓的形成有關(guān)；p l s l 、嬲”2 、m p s i 、g s j 、g 舵、p d e l 、c y p l 等基因 與侵入栓的形成和功能有關(guān)【6 2 7 之9 1 。m h p l 為最新報(bào)道的與病菌疏水性表面形成有關(guān)的 基因，該基因的突變會(huì)影響病菌侵染相關(guān)形態(tài)的發(fā)育，并使病菌的侵染和定殖能力下降 【2 2 1 。此外，l i 等考察了稻瘟病菌中與酵母p a k 激酶基因s t e 2 0 類(lèi)似的c h m l 和m s t 2 0 基因，發(fā)現(xiàn)c h m l 基因與病菌附著孢的形成和穿透寄主有關(guān)，但與酵母中不同的是， c h m l 并沒(méi)有調(diào)控稻瘟病菌的p m k l 激酶【3 0 1 。 盡管己鑒定到幾十個(gè)稻瘟菌無(wú)毒基因 7 , 3 1 1 ，但是，也許是受到克隆基因難度的限制， 迄今只有五個(gè)無(wú)毒基因p w l 2 、a v r l c 0 3 9 、a v r p i t a 、a c e l 和a v r - p i z t 已經(jīng)克隆 3 2 - 3 5 , 1 0 5 。其中無(wú)毒基因a v r - p i t a 的結(jié)構(gòu)及其與水稻抗病基因p i t a 的互作功能得到了深 入的研究【3 _ 4 ，3 6 1 。a v r p i t a 編碼一個(gè)金屬蛋白酶，盡管尚無(wú)直接的生化依據(jù)，但只要改 變?cè)摻饘俚鞍酌附Y(jié)構(gòu)域中的一個(gè)氨基酸，它就不能與抗病基因p i t a 互作【3 】。功能分析表 明，a v r p i t a l 7 6 直接與水稻細(xì)胞內(nèi)的p i t a 蛋白的富亮氨酸區(qū)域( l r d ) 結(jié)合，激發(fā)尸婦 調(diào)控的防衛(wèi)反應(yīng)，從而導(dǎo)致水稻的抗病反應(yīng)。 關(guān)于稻瘟病菌穿透組織后定殖發(fā)展階段的基因調(diào)控則研究的很少。b a l h a d e r e 和 t a l b o t 發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌p 型a t p 酶的基因p d e l 與侵入菌絲的發(fā)育和最終在細(xì)胞內(nèi)的定 殖有關(guān)2 9 1 ；m h p l 基因的突變也使病菌的侵染和定殖能力下降【捌；而a t p 驅(qū)動(dòng)的輸出 泵蛋白基因a b c l 與病菌的親和性互作密切相關(guān)1 2 1 。另外，甲硫氨酸和組氨酸的合成， 以及金屬硫因叫e t a l l o t m o n e i n ) 等也與稻瘟病菌的侵染過(guò)程有關(guān)【3 7 r3 8 1 。不過(guò)，這方面的 堡壟壟簽奎蘭堡主堂垡笙苧 研究離認(rèn)識(shí)稻瘟病菌在植物組織內(nèi)定殖擴(kuò)展的調(diào)控機(jī)理還差很遠(yuǎn)。 因此，盡管對(duì)稻瘟病菌的生長(zhǎng)、侵入、發(fā)病等各個(gè)階段已展開(kāi)了較為系統(tǒng)的研究， 并取得了一些重大的研究進(jìn)展，但對(duì)稻瘟病菌致病過(guò)程的分子機(jī)理仍然未完全弄清楚， 特別是稻瘟病菌侵入后在寄主體內(nèi)如何與寄主發(fā)生互作，并導(dǎo)致病菌的定殖與擴(kuò)展，最 終形成感病反應(yīng)的研究非常稀少。近年來(lái)，雖然有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用m r n a 差異顯示、 c d n a 抑制消減雜交( s s h ) 、s a g e 、基因芯片和表達(dá)序列標(biāo)簽( e s t ) 分析的方法來(lái)研究 水稻與稻瘟菌互作的相關(guān)基因，得到了大量的信息【3 9 4 8 1 。但這些研究獲得的信息中，有 些由于采用人工培養(yǎng)或人造疏水性表面代替植物接種，得到的信息與來(lái)源于真正的與寄 主互作還存在差異，特別是無(wú)法找到病菌中特異參與定殖與擴(kuò)展的基因。 1 2 植物抗病的機(jī)理及水稻抗稻瘟病基因的研究 1 2 1 植物抗病的機(jī)理 植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)遭到一些病原微生物( 包括真菌、細(xì)菌和病毒等) 的危害。 病原物侵染寄主植物的能力是病原物與寄主植物協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果，有很多植物在進(jìn)化過(guò) 程中還出現(xiàn)抵抗病原菌侵染的能力，即為寄主植物的抗病性。目前對(duì)植物的抗病機(jī)理流 行著兩種學(xué)說(shuō)： 一種是f l o r l 9 7 1 年提出的“基因?qū)颉奔僬f(shuō)( g e n e f o r - g e n eh y p o t h e s i s ) 。主要用來(lái)解 釋植物抗病基因和病原菌之間的特異性相互作用。其廣為接受的觀點(diǎn)是受體激發(fā)子模 型，即病原物入侵寄主后，病原菌無(wú)毒基因( a v o 的產(chǎn)物被寄主相對(duì)應(yīng)的抗性基因( r ) 產(chǎn) 物識(shí)別后，激活了侵染點(diǎn)細(xì)胞的過(guò)敏性反應(yīng)( h y p e r s e n s i t v er e s p o n s e ，h r ) ，導(dǎo)致這些細(xì)胞 快速地程序性死亡，使侵染的病原物生長(zhǎng)繁殖受到抑制，被控制在這些細(xì)胞中【4 9 1 。這一 假說(shuō)一直以來(lái)得到廣泛的肯定和補(bǔ)充。但是多數(shù)已經(jīng)克隆的抗病基因產(chǎn)物和其對(duì)應(yīng)的無(wú) 毒基因產(chǎn)物尚未證實(shí)能直接發(fā)生作用。 另一種假說(shuō)是v a nd e rb i e z e n 等1 9 9 8 年提出的防衛(wèi)假說(shuō)( g u a r dh y p o t h e s i s ) ，該假說(shuō) 認(rèn)為病原為了使周?chē)h(huán)境更有利于自身侵染、繁殖，釋放了一類(lèi)效應(yīng)子( e f f e c t o r s ) ，效應(yīng) 子能夠作用并修飾寄主的某些目標(biāo)( t a r g e t ) 蛋白，抗病蛋白則作為防衛(wèi)( g u a r d e r ) 蛋白，通 過(guò)與這些目標(biāo)蛋白的互作啟動(dòng)寄主的抗病反應(yīng)【5 0 , 5 1 】。防衛(wèi)假說(shuō)的提出徹底改變了我們過(guò) 去對(duì)抗病基因功能的認(rèn)識(shí)，抗病蛋白不再是被動(dòng)地等待無(wú)毒蛋白的結(jié)合，而是主動(dòng)的， 時(shí)時(shí)刻刻地從各個(gè)方面監(jiān)控由病原物引發(fā)的自身生理變化過(guò)程，迅速啟動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)。 1 2 2 水稻抗稻瘟病菌基因的研究現(xiàn)狀： k i y o s a w a 等通過(guò)遺傳分析，先后在粳稻中的8 個(gè)位點(diǎn)( p i k 、p i a 、p i i 、p i z 、p i t a 、p i b 、 4 福建農(nóng)林大學(xué)碩士掌位論文 p i t 、p i s h ) 鑒定了1 3 個(gè)抗病基因儼f a 、p i - i 、p i - k 、p i k a 、p i ，k m 、p i k s 、p i 砌、p i - z 、 尸，捌、p i ，t a 、p i t a 2 、p i b 和p i - t ) ，并在此基礎(chǔ)上確立了一套單基因鑒別品種，它由1 2 個(gè)品種組成，每個(gè)品種包含一個(gè)己知的抗稻瘟病基因，這套單基因鑒別品種大大提高了 對(duì)稻瘟病生理小種的鑒別能力【5 2 1 。 y u 等先后利用近等基因系鑒定t - - 個(gè)稻瘟病抗性基因，p i - 1 似 p i 一1 1 、p i 一2 ( 0p i - z 哥 和p i - 4 ( t ) p i 趔并分別定位于第1 1 、6 和1 2 染色體上 5 3 , 5 4 1 ；i m b e 等鑒定并將p i 2 0 基 因定位到水稻的第1 2 號(hào)染色體上【5 5 】；n a q v i 等利用r a p d 和r f l p 技術(shù)在重組自交系 中還定位了第5 號(hào)染色體上的抗稻瘟病基因p f j d 5 6 1 。朱立煌等利用r a p d 技術(shù)，在 水稻第8 染色體上首次發(fā)現(xiàn)稻瘟病抗性基因，即尸唧扣，j 俐，它離r a p d 標(biāo)記b p l 2 7 a 的遺傳距離為1 4 9 c m e 5 7 1 。w a n g 等利用重組自交系c 0 3 9 m o r o b e r e k a n 定位了兩個(gè)來(lái)自 粳稻的稻瘟病抗性基因p i - 5 ( t ) 和p i - 7 ( t ) ，分別在第4 染色體上，位于r f l p 標(biāo)記r g 4 9 8 和r g 7 8 8 之間；和第1 1 染色體上，位于標(biāo)記r g l 6 和r g l 0 3 a 間。另外，他們還發(fā)現(xiàn) 了1 0 個(gè)控制部分抗性的q t l ，位于第8 條染色體上，它們控制著病斑的大小、數(shù)量和 病葉的面積，這是首次對(duì)稻瘟病微效抗性基因進(jìn)行定位【5 8 】。 1 9 9 5 年，中國(guó)水稻所的鄭康樂(lè)等利用r f l p 技術(shù)從品種紅腳占中定位了抗稻瘟病基 因p i h 一，例，位于第1 2 染色體上，距離r f l p 標(biāo)記r g 8 6 9 為5 1 c m 5 9 】。日本m i y a m o t o 等發(fā)現(xiàn)源于秈稻品種的抗稻瘟病基因p i - b 位于第2 染色體的近末端，與r f l p 標(biāo)記r z l 2 3 及r a p d 標(biāo)記b 1 共分離。他們還找到了兩個(gè)標(biāo)記r z 2 1 3 和g 1 2 3 4 。前者位于靠近端粒 的一邊距r a p d 標(biāo)記b 11 9c m 處，后者位于距著絲點(diǎn)的一邊r a p d 標(biāo)記b 1 只有0 5 c m 處。因此，他們不僅找到了p i b 兩側(cè)的標(biāo)記，而且找到了與目的基因完全共分離的標(biāo)記， 為該基因克隆奠定了基礎(chǔ) 矧。w a n g 等在1 9 9 9 年克隆了該基因。r y b k a 等用r f l p 和 r a p d 標(biāo)記定位了來(lái)源于秈稻品種t a d u k a n 的兩個(gè)抗稻瘟病基因p i - t a 和p i t a 2 ，它們被 定位在第1 2 染色體距離著絲點(diǎn)非常近的中部，且緊密連鎖。他們還發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因與 標(biāo)記x n p b 2 8 9 和x n p b l 9 6 共分離【6 1 1 。w u 等從1 4 4 0 個(gè)r a p d 引物擴(kuò)增產(chǎn)物中篩選出 1 8 個(gè)條帶，均與尸正，口連鎖，并且構(gòu)建了基因所在區(qū)域的精密圖譜。b r y a n 等在2 0 0 0 年 克隆了p i - t a 基剛6 2 1 。p a n 等1 9 9 8 年從云南的品種m a o w a n g u 中鑒定到p i l 3 、p i l 42 個(gè) 基因盼6 4 1 。b e r r u y e r 等2 0 0 3 年從i r 6 4 中鑒定到p i 3 3 基因；2 0 0 4 年，c h e n 等從 中國(guó)的秈稻品種地谷中鑒定并作圖了2 個(gè)基因p i d l 和p i d 2 觚6 7 1 。 迄今為止，通過(guò)性狀標(biāo)記或分子標(biāo)記( 微衛(wèi)星標(biāo)記，s s r ，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 r f l p 等) 技術(shù)，已經(jīng)有超過(guò)6 0 個(gè)稻瘟病抗性基因被定位到染色體上。 目前已經(jīng)克隆的基因有：p i b 、p i t a 、p i 2 、p i 9 、p i d 2 和尸切六個(gè)基因。 氣 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 其中，由p i b 基因編碼的蛋白質(zhì)，是由1 2 5 1 個(gè)氨基酸殘基組成的含一個(gè)核苷酸結(jié) 合位點(diǎn)( n u c l e o t i d eb i n d i n gs i t e ，n b s ) 和富含亮氨酸重復(fù)( 1 e u c i n e r i c hr e p e a t s ，e r r ) 的蛋白 質(zhì)。其n 端的n b s 區(qū)有激酶l a 、2 和3 a 結(jié)構(gòu)域的重復(fù)單位，l r r 的中部有8 個(gè)成簇的 胱氨酸殘基68 6 9 1 。p i b 基因在水稻中以多拷貝形式存在，目前該基因的抗病機(jī)理尚不清 楚。 而尸扣幻基因編碼的蛋白，是富含l r r 序列的細(xì)胞質(zhì)膜受體蛋白，由9 2 8 個(gè)氨基酸 殘基組成。它在水稻中以單拷貝形式存在【7 0 1 。并且根據(jù)j i a 等的研究還發(fā)現(xiàn)，p i t a 基因 的抗病機(jī)制遵循基因?qū)虻膶W(xué)說(shuō)，即它編碼的產(chǎn)物與稻瘟病菌中相應(yīng)的無(wú)毒基因 a v r p i t a 表達(dá)產(chǎn)物能相互作用引發(fā)抗病反應(yīng)【7 1 】。 研究證明，尸忍位于第6 染色體上，抗譜廣且完全顯性基因，是一個(gè)基因簇成員【7 2 。7 5 1 。 p i 2 編碼一個(gè)由1 0 3 2 個(gè)氨基酸組成的n b s l r r 蛋白。根據(jù)尸刀的序列信息，在品種 t o f i d e l 中發(fā)現(xiàn)了它的等位基因p i z - t ，也編碼n b s l r r 蛋白，但是由1 0 3 3 個(gè)氨基酸組 成。兩個(gè)基因在編碼的三個(gè)連續(xù)組成的l r r 結(jié)構(gòu)域中有八個(gè)氨基酸不同【7 6 1 。 p i 9 也同樣是位于第6 染色體上的一個(gè)廣譜抗性的基因，和尸f 2 屬于同一個(gè)基因家族。 編碼n b s l r r 蛋白，由1 0 3 2 個(gè)氨基酸組成。p i 2 和p i 9 的克隆為從分子水平上解釋稻 瘟病基因簇的形成和進(jìn)化提供t i f f _ 據(jù)【7 7 1 。q u 等認(rèn)為抗性是由l r r 結(jié)構(gòu)域決定的【7 引。 1 3 基因芯片技術(shù)及其應(yīng)用 基因芯片又稱(chēng)d n a 芯片，是專(zhuān)門(mén)用于核酸檢測(cè)的生物芯片。它是指在固相載體上 按照特定的排列方式固定上大量序列己知的d n a 片段，形成d n a 微矩陣。將樣品基 因組d n a 或r n a 通過(guò)體外逆轉(zhuǎn)錄、p c r 或r t - p c r 擴(kuò)增等技術(shù)摻入標(biāo)記分子后，與位 于微陣列上的已知序列雜交，通過(guò)激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，檢測(cè)雜 交信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的比較和綜合分析后，即可獲得樣品中大量基因序列 特征或基因表達(dá)特征信息。由于其檢測(cè)基因的高通量性，基因芯片在基因的表達(dá)和調(diào)控， 疾病的診斷和檢測(cè)、新基因功能的確定等各個(gè)方面得到了日益廣泛的應(yīng)用7 9 棚】。 基因芯片檢測(cè)的最基本原理同s o u t h e r nb l o t 、n o r t h e r nb l o t 一樣，都是基于堿基互 補(bǔ)的核酸分子雜交。他們的區(qū)別是：s o u t h e r nb l o t 、n o r t h e r nb l o t 中把樣本的d n a 或 r n a 固定到( 固相) 膜上，再用標(biāo)記好的探針進(jìn)行雜交；基因芯片則是把大量的已知序列 的基因探針有序地固定在固相介質(zhì)上，再把樣品中總的靶基因進(jìn)行標(biāo)記，與帶有探針的 芯片進(jìn)行常規(guī)的分子雜交，因此可以大規(guī)模高通量的進(jìn)行基因序列的研究【8 2 】。 1 3 1 基因芯片的種類(lèi)： 6 堡堡奎莖奎蘭堡主蘭垡笙莖 由于載體材料、制備方法、所用d n a 的種類(lèi)及用途等方面的不同?；蛐酒笾?可分為一下幾類(lèi)： 就基因芯片所用的載體材料的不同，可分為玻璃芯片、濾膜芯片、硅芯片、陶瓷芯 片等。目前，玻璃芯片由于其熒光背景低、材料易得和應(yīng)用方便等優(yōu)點(diǎn)，而在國(guó)際上得 到廣泛應(yīng)用。 按照芯片的制備方法的不同，可以分為以下兩類(lèi)：一類(lèi)是在基質(zhì)上直接原位合成寡 核苷酸的點(diǎn)陣；另一類(lèi)是用微量點(diǎn)樣技術(shù)將d n a 片段直接點(diǎn)至基質(zhì)上。根據(jù)芯片載體 上所點(diǎn)的d n a 種類(lèi)不同，可以分為寡核苷酸芯片和e d n a 芯片兩種： 寡核苷酸芯片是以寡核苷酸為探針，是人工合成的，一般以原位合成方式固定到載 體上，具有密集程度高、可合成任意序列的寡聚核苷酸等特點(diǎn)，適用于d n a 序列測(cè)定、 s n p 分析等。但是選擇這種：簽片，要求研究者對(duì)基因有充分的了解，即基因的位置和長(zhǎng) 度有一定的認(rèn)識(shí)。由于合成寡聚核苷酸長(zhǎng)度在1 5 7 0 m e r 左右，因而特異性差，而且隨 長(zhǎng)度的增加，合成的錯(cuò)誤率也會(huì)增高。同時(shí)寡核苷酸芯片也可通過(guò)直接點(diǎn)樣制備，但固 定率較d n a 芯片差。寡核苷酸芯片主要用于點(diǎn)突變和測(cè)序等，也可用于表達(dá)譜研究【8 3 8 4 】 a e d n a 芯片的探針是e d n a ，由于e d n a 就是與m r n a 互補(bǔ)的d n a ，因此被認(rèn)為 是真實(shí)表達(dá)的基因。是將微量e d n a 片段在玻璃等載體上按矩陣密集排列并固化，基因 點(diǎn)樣密度較傳統(tǒng)載體，如混合纖維素濾膜或尼龍膜的點(diǎn)樣密度要高得多，可達(dá)到每張載 玻片6 萬(wàn)個(gè)基因。e d n a 芯片最大的優(yōu)點(diǎn)是靶基因檢測(cè)特異性非常好，目前許多實(shí)驗(yàn)室 和制藥公司都用此類(lèi)芯片。e d n a 芯片主要用于一般的檢測(cè)芯片和表達(dá)譜研究8 5 ，8 6 1 。 按基因芯片的用途可分為表達(dá)譜芯片、診斷芯片、指紋圖譜芯片、測(cè)序芯片和毒理芯片 等。 1 3 2 基因芯片的應(yīng)用： 基因芯片技術(shù)產(chǎn)生以后，由于其檢測(cè)的快速和高通量性，便得到了廣泛的應(yīng)用，并 不斷發(fā)展。最初在醫(yī)學(xué)研究、藥物篩選等方面開(kāi)始應(yīng)用，后又逐步擴(kuò)展到動(dòng)物、植物、 昆蟲(chóng)和微生物等領(lǐng)域。已經(jīng)用于基因差異表達(dá)檢測(cè)、突變體檢測(cè)、基因組多態(tài)性分析、 基因文庫(kù)作圖和雜交測(cè)序等方面的研究。基因芯片主要應(yīng)用于以下幾方面。 1 3 2 1 基因表達(dá)水平的檢測(cè) 常規(guī)檢測(cè)基因表達(dá)的方法不僅工作量大，而且存在著一次僅能檢測(cè)少量基因以及靈 敏度不高等局限性，而基因芯片技術(shù)可以高敏感度地定量、定性檢測(cè)基因表達(dá)水平，既 可以同時(shí)比較不同標(biāo)本基因表達(dá)水平的差異，也能夠提供某一基因或一群基因的表達(dá)模 7 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 式與其他基因表達(dá)模式相互間關(guān)聯(lián)的信息。目前多是將不同來(lái)源、不同組織、不同時(shí)期、 不同外界條件下m r n a 或c d n a 與芯片雜交，從而獲得相應(yīng)的基因表達(dá)譜。 s c h e n a 等人首次使用e d n a 基因芯片檢測(cè)擬南芥( ar a b i d o p s i st h a l i a n a ) 中不同基因表 達(dá)和表達(dá)水平的差異，用4 5 個(gè)擬南芥e d n a ( 1 4 個(gè)完全序列和3 1 個(gè)e s t 序列) 和3 個(gè)對(duì) 照( 分別來(lái)源于不同種屬的人類(lèi)a c h 受體、鼠糖皮質(zhì)激素受體和酵母t r p 4 的c d n a ) 構(gòu) 建成的微陣列，同時(shí)用麗絲胺( 1 i s s am i n e ) 和熒光素( f l u o r e s c e i n ) 分別標(biāo)記探針，探針與微 陣列雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組中均未檢測(cè)到雜交信號(hào)，說(shuō)明該微陣列的特異性很高； 在根和葉組織中檢測(cè)到2 6 個(gè)基因的表達(dá)存在差異，其中參與葉綠素合成的c a b i 基因 在葉組織中的表達(dá)水平較根組織中的表達(dá)水平高5 0 0 倍【8 7 1 。s h i n j i 等用不同鹽濃度處理 水稻耐鹽品種( v a r p o k k a l i ) 的根并構(gòu)建c d n a 文庫(kù)，得到1 7 2 8 個(gè)片段組成的c d n a 微陣 列，結(jié)果顯示，在鹽脅迫l 小時(shí)內(nèi)約有1 0 的序列表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，隨著時(shí)間的 增長(zhǎng)，對(duì)照和處理的差異在持續(xù)數(shù)小時(shí)后變小，一周后處理中在l 小時(shí)內(nèi)表達(dá)升高的序 列恢復(fù)到對(duì)照水平，說(shuō)明隨著植株對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)，基因的表達(dá)情況也在發(fā)生著動(dòng)態(tài)變 化【8 8 】。j a c e o u d 等則將基因芯片技術(shù)應(yīng)用于水稻品種資源的遺傳多樣性分析【8 9 1 。r u u s k a 等等利用c d n a 微陣列芯片檢測(cè)擬南芥種子在發(fā)育過(guò)程的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)淀粉合成相關(guān) 基因在幼嫩種子中的表達(dá)十分活躍，而隨著種子逐漸成熟這些基因的表達(dá)量逐漸減小 9 0 l 。l u 等結(jié)合c d n a 微陣列和s s h 技術(shù)，分離并鑒定了一個(gè)與稻瘟病親和與非親和性 反應(yīng)有關(guān)的新基因 9 1 1 。m i s s o n 等使用a f f y m e t r i x 的a t h l 芯片測(cè)定擬南芥短期、中期和 長(zhǎng)期磷缺乏的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在短期磷缺乏情況下，7 2 個(gè)基因被誘導(dǎo)表達(dá)，4 個(gè)基 因沉默，隨著磷元素的缺乏，基因被誘導(dǎo)表達(dá)的數(shù)量逐漸增多【9 2 1 。c a s u 等利用a f f y m e t r i x 基因芯片研究甘蔗莖細(xì)胞壁代謝和發(fā)育基因表達(dá)，檢測(cè)到了1 1 9 個(gè)高度表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本， 并發(fā)現(xiàn)了一些與纖維素合成相關(guān)的基因 9 3 1 。k l o o s t e r m a n 等構(gòu)建了含1 ，3 1 5 c d n a 的馬鈴 薯基因芯片，研究馬鈴薯塊莖發(fā)育【9 4 】。 c a r l s s o n 等利用擬南芥花器官特異c d n a 芯片研究甘藍(lán)型油菜c m s 的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)保 持系與不育系之間的基因表達(dá)差異很大，其中一些在花藥或花粉中表達(dá)的基因在c m s 中不表達(dá)，與細(xì)胞壁形成有關(guān)的基因表達(dá)在c m s 材料中受到了抑制【9 5 1 。c e r c o s 等用含 7 , 0 0 0 個(gè)基因的c d n a 芯片研究克里曼丁桔( c i t r u sc l e m e n t i n a ) 果實(shí)發(fā)育和成熟時(shí)的基因 表達(dá)變化，揭示了在果實(shí)成熟過(guò)程中檸檬酸及細(xì)胞質(zhì)酸性下降的分子機(jī)理1 9 6 。p u t h o f f 等利用基因芯片分析了擬南在不同胞囊線蟲(chóng)侵染下基因表達(dá)譜的變化，他們發(fā)現(xiàn)，用甘 蔗胞囊線蟲(chóng)( h e t e r o d e r as c h a c h t i i ) 侵染擬南芥時(shí)，1 2 8 個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生變化而用大豆胞 囊線蟲(chóng)( h g l y c i n e s ) 侵染時(shí)僅1 2 個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生變化，并且這1 2 個(gè)基因包含在前面的 8 福建農(nóng)林大學(xué)頓士學(xué)位論文 1 2 8 個(gè)基因中【9 7 1 。m a r a s c h i n 等利用與胚發(fā)育相關(guān)的表達(dá)標(biāo)簽制作的芯片，揭示了大麥 孤雄生殖的分子機(jī)理【9 8 1 。n 等利用含8 , 0 9 5 個(gè)油菜基因的芯片研究經(jīng)寡聚糖 ( o l i g n c h i t o s a n ) 處理后的油菜基因表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)共3 9 3 個(gè)基因表達(dá)發(fā)生改變，其中， 2 5 7 個(gè)沉默，1 3 7 個(gè)上調(diào)表達(dá)】。n e g i s h i 等還以包含有8 9 8 7 條水稻c d n a 克隆的微陣 列研究了大麥根部鐵元素脅迫的表達(dá)譜變化，并獲得了一批鐵元素脅迫相關(guān)的基因【1 0 0 。 愛(ài)荷華州立大學(xué)利用這種高通量工具對(duì)2 0 0 0 0 個(gè)玉米e s t 序列的37 端進(jìn)行了研究。這 些研究為研究物種的基因組表達(dá)及相互關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)和豐富的數(shù)據(jù)庫(kù)資源。并且在 差異表達(dá)基因的研究方面，由于基因芯片的敏感性和高通量性，很好地解決了普通的消 減雜交和差異篩選技術(shù)中存在的富集和扣除之間的矛盾，還可以同時(shí)對(duì)大量基因的表達(dá) 差異進(jìn)行對(duì)比分析。 1 3 2 2 功能相關(guān)基因的檢測(cè) 生物的很多生理過(guò)程不是單基因控制的，而是由一系列直接或間接作用的功能相關(guān) 基因，相互作用的結(jié)果?；蛐酒夹g(shù)通過(guò)平行監(jiān)測(cè)眾多基因表達(dá)模式進(jìn)行功能分析， 有助全面了解生物在特殊處理和不同環(huán)境脅迫下較為完整的基因表達(dá)情況，從而找到與 特定功能相關(guān)的基因情況。 饒志明等( 2 0 0 2 ) 用2 2 0 0 條來(lái)源于受稻瘟病菌處理的水稻e s t 序列制備成c d n a 微 陣列，分析了抗稻瘟病近等基因系g 2 0 5 和g 7 1 受稻瘟病菌脅迫后基因表達(dá)的差異，檢 測(cè)到3 8 個(gè)差異表達(dá)克隆，其功能涉及到病程相關(guān)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境脅迫及光合作用和 糖代謝等方面，基本構(gòu)成了從信號(hào)傳導(dǎo)到主動(dòng)和被動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)的復(fù)雜防衛(wèi)系統(tǒng)【1 0 l 】。 1 3 2 3 尋找新基因 生物體的發(fā)育分化及對(duì)環(huán)境因子刺激所產(chǎn)生的應(yīng)答反應(yīng)等一系列生命活動(dòng)過(guò)程均由 基因來(lái)調(diào)控。利用基因芯片技術(shù)可以從表達(dá)序列水平對(duì)生物基因組進(jìn)行快速、高通量研 究，如尋找動(dòng)植物抗病、生物抗藥性、植物抗旱和抗寒以及高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)相關(guān)基因，有利 于新基因的發(fā)現(xiàn)和利用。h a r o n i 等從草莓中分離了1 7 0 1 個(gè)c d n a 片段構(gòu)建微陣列，研 究草莓果實(shí)不同成熟期果實(shí)顏色與成熟度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)有4 0 1 個(gè)基因在綠、白和紅色果 實(shí)中表達(dá)顯著差異，通過(guò)r n a 雜交發(fā)現(xiàn)新基因，其中草莓乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因( s t r a wb e r r y a l c o h o la c y l tr a ns e r f a s e ，s a a t ) ，在草莓成熟時(shí)特殊風(fēng)味合成中起很重要的作用 1 0 2 1 。 9 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 1 試驗(yàn)材料 2 材料與方法 2 1 1 供試菌株及植物 稻瘟病菌g u y l l 菌株由法國(guó)d i d i e r t h a r r e a u 博士提供； 稻瘟病菌7 0 1 5 菌株由美國(guó)普渡大學(xué)徐金榮博士贈(zèng)送； 水稻品種為c 0 3 9 近等基因系( c 0 3 9 n i l s ) 2 1 2 培養(yǎng)基 菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基：酵母完全培養(yǎng)基( c m ) ( 酵母粉6 嘰，水解酪蛋白6 9 l ，蔗糖1 0 9 l ，瓊 脂粉2 0g l ) ；酵母液體培養(yǎng)基( c m ) ( 酵母粉6 9 l ，水解酪蛋白6 9 l ，蔗糖l o g l ) ； 產(chǎn)孢培養(yǎng)基：米糠培養(yǎng)基( 米糠3 0 9 l ，瓊脂粉2 0 9 l ，p h6 。o ) 。 2 1 3 生化試劑 p c r 試劑( 1 0 xt a qb u f f e r 、d n t p 、t a q 酶) ，其它常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，引物由福州 博鴻生物技術(shù)有限公司合成。t r i z o l 總r n a 提取試劑( 天根生化科技有限公司) ；基因芯 片試驗(yàn)所需試劑( 詳見(jiàn)附件) ；r t - p c r 試驗(yàn)所用試劑采用p r o r n e g a 公司的r t - p c r 試劑盒。 基因芯片采用a g i l e n t 公司的m a g n a p o r t h eg r i s e a2 0o l i g om i c r o a r r a yk i t ，它包含了 1 5 ，1 7 0 個(gè)mg r & e a 探針，和6 , 3 2 5 水稻探針，每個(gè)探針由6 0 個(gè)核苷酸組成。 2 2 試驗(yàn)方法 2 2 1 稻瘟病菌菌絲體獲得 切取在酵母完全培養(yǎng)基上活化好的g u y ll 菌絲塊，轉(zhuǎn)移至酵母液體培養(yǎng)基中，于2 5 1 2 、1 3 0 r p m 振蕩培養(yǎng)4 8 h 一7 2 h ，后用經(jīng)高壓蒸汽滅菌過(guò)的濾紙片過(guò)濾收集菌絲體。 2 2 2 稻瘟病菌侵染水稻后病葉的獲得 用米糠培養(yǎng)基培養(yǎng)稻瘟病菌菌絲，待菌絲長(zhǎng)滿平板時(shí)，刮除菌絲，置于2 5 ( 2 光照培 養(yǎng)3 d ，用無(wú)菌水洗脫分生孢子，經(jīng)兩層擦鏡紙過(guò)濾分生孢子懸浮液，將濃度調(diào)整至l 1 0 6 個(gè)m l ，噴霧接種3 葉1 心的水稻植株，2 5 ( 2 黑暗保濕2 4 h 后，移到相對(duì)濕度8 0 以上 的人工氣候培養(yǎng)室培養(yǎng)。以同樣處理，但接種清水的為對(duì)照。于接種后的4 8 h 、7 2 h 、9 6 h 分別取樣，迅速投入液氮，至一8 0 ( 2 冰箱待用。 2 2 3 總r n a 的提取( t r l z o l l 1 0 望堡奎簽奎蘭墮主堂垡笙莖 提取g u y l l 菌絲體和稻瘟病菌孢子接種水稻后不同時(shí)間段水稻葉片的總r n a ，具 體方法如下： ( 1 ) 將收集的菌絲和水稻葉片用液氮研磨成粉末( 在研磨過(guò)程中注意保持組織處于冷凍狀 態(tài)) ，轉(zhuǎn)k 2 m l 離心管中，按每1 0 0 m g 樣品加入1 m lt r i z o l ，振蕩混勻，室溫靜置5 m i n ； ( 2 ) 然后加入0 2 倍體積的氯仿，蓋子蓋緊后劇烈振搖1 5 秒使混勻，室溫放置3 m i n ，4 。c 1 2 ，0 0 0 r p m 離心1 0 分鐘，離心后形成下層紅色的酚氯仿相，中間相和上層無(wú)色水相； ( 3 ) 將上層水相轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管( 水相的體積大約為所用t r i z o l 體積的6 0 ) ，加入 o 8 倍體積的異丙醇，混勻，靜置1 5 m i n ( 或更久) ，4 c1 2 ，0 0 0 r p m 離心1 0 m i n ，棄上清； ( 4 ) = l j n n 7 0 酒精，顛倒離心管數(shù)次以洗去沉淀所含鹽分。如沉淀較大可用t i p 頭先將沉 淀打散。然后4 7 , 0 0 0 r p m 離心1 0 分鐘，棄上清； ( 5 ) 室溫涼置5 1 0 m i n ，然后加入適量的無(wú)r n a s e 的水溶解； ( 6 ) j 口e k 0 5ul1 0 m g m ld n a s ei 于3 7 。c 反應(yīng)1 h ； ( 7 ) 反應(yīng)結(jié)束后，加入無(wú)r n a 酶的水，將體系擴(kuò)大至5 0 01 al ，加入等體積的水飽和酚：氯 仿：異戊醇( 2 5 ：2 - 4 ：1 ) ； ( 8 ) 4 c1 2 ，0 0 0 r p m 離心1 0 m i n ； ( 9 ) 轉(zhuǎn)移上清至另一干凈的無(wú)r n a 酶的離心管中，加入2 5 倍體積冰凍無(wú)水乙醇和0 1 倍體 積3 mn a a c ( p h5 2 ) ，混勻，- 2 0 放置過(guò)夜； ( 1 0 ) 4 1 2 ，0 0 0 r p m 離心1 0 m i n ； ( 1 1 ) 棄上清，加入7 0 酒精洗沉淀2 次，晾干5 1 0 m i n ，加入適量的無(wú)r n a s e 的水溶解沉 淀。 ( 1 2 ) 用分光光度計(jì)分析r n a 濃度，1 瓊脂糖電泳檢測(cè)r n a 的純度。 2 2 41 瓊脂糖電泳檢測(cè)r n a 的純度 ( 1 ) 配置用d e p c 處理的電泳緩沖液5 0 t a e ，高壓滅菌后待用； ( 2 ) 使用電