顯微技術(shù)作業(yè)-課后作業(yè)A.doc

生物電子顯微技術(shù)作業(yè) 課后作業(yè)A1. 上網(wǎng)搜索或查閱其他資料，列表簡(jiǎn)要說(shuō)明你認(rèn)為能用于生物形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能觀察研究的所有方法。以及這些方法的應(yīng)用實(shí)例。 顯微技術(shù)方法應(yīng)用實(shí)例 解剖顯微鏡 主要應(yīng)用于在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛用于切片操作和顯微外科手術(shù)一、光學(xué)顯微鏡 復(fù)式顯微鏡 用于觀察軟木及其他植物組織 1、 偏光顯微鏡 用于研究所謂透明與不透明各向異性材料的一種顯微鏡。凡具有雙折射的物質(zhì)，在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚，當(dāng)然這些物質(zhì)也可用染色法來(lái)進(jìn)行觀察，但有些則不可能，而必須利用偏光顯微鏡。反射偏光顯微鏡是利用光的偏振特性對(duì)具有雙折射性物質(zhì)進(jìn)行研究鑒定的必備儀器, 可用以做單偏光觀察，正交偏光觀察，錐光觀察。 檢術(shù)方式：1、正相鏡檢又稱無(wú)畸變鏡檢，其特點(diǎn)是使用低倍物鏡，不用伯特蘭透鏡（BertrandLens）,被研究對(duì)象可直接用偏振光研究。同時(shí)為使照明孔徑變小，推開(kāi)聚光鏡的上透鏡。正相鏡檢用于檢查物體的雙折射性。2、錐光鏡檢又稱干涉鏡檢，研究在偏振光干涉時(shí)產(chǎn)生的干涉圖樣，這種方法用于觀察物體的單軸或雙軸性。在該方法中，用強(qiáng)會(huì)聚偏振光束照明。 2、暗視場(chǎng)顯微鏡 使用特殊的暗視場(chǎng)聚光鏡使照明光線偏移而不進(jìn)入物鏡，只有樣品的散射光進(jìn)入物鏡。因而在暗背景上得到亮的像，與暗視場(chǎng)照明相反，照明的光線直接到達(dá)成像平面的，稱明視場(chǎng)照明。暗視場(chǎng)顯微鏡主要用于觀察結(jié)構(gòu)和折射率變化有關(guān)的物體，如硅藻、放射蟲類、細(xì)菌等具有規(guī)律結(jié)構(gòu)的單細(xì)胞生物以及細(xì)胞中的線狀結(jié)構(gòu)，如鞭毛、纖維等。用暗視場(chǎng)顯微鏡還可觀察到物鏡分辨極限以下的質(zhì)點(diǎn)，但不適用于觀察染色的標(biāo)本。3、相差顯微技術(shù)正置相差顯微鏡相差顯微鏡有暗相差和明相差之分。這種顯微鏡最大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。倒置相差顯微鏡倒置相差顯微鏡，是相差顯微鏡和倒置顯微鏡的結(jié)合，即既具有倒置顯微鏡的倒置觀察方式，同時(shí)，成像原理則與相差顯微鏡成像原理相一致?？梢院芊奖愕貙?duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞進(jìn)行觀察。且相差系統(tǒng)的觀察效果遠(yuǎn)好于一般光學(xué)觀察系統(tǒng)。如果安裝了顯微操作系統(tǒng)，則可以利用機(jī)械臂對(duì)細(xì)胞甚至染色體進(jìn)行精細(xì)地操作，如核移植、基因?qū)?、染色體顯微切割等。微分干涉差顯微能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，特別是一些較大的細(xì)胞器，如核、線粒體等，立體感特別強(qiáng)，適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進(jìn)行。4、熒光顯微技術(shù)熒光顯微鏡 熒光顯微鏡是以紫外線為光源， 用以照射被檢物體， 使之發(fā)出熒光， 然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。 細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光。全內(nèi)反射熒光顯微鏡全內(nèi)角反射熒光顯微鏡，利用光線全反射后在介質(zhì)另一面產(chǎn)生衰逝波的特性，激發(fā)熒光分子以觀察熒光標(biāo)定樣品的極薄區(qū)域，觀測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍通常在200 nm以下。因?yàn)榧ぐl(fā)光呈指數(shù)衰減的特性，只有極靠近全反射面的樣本區(qū)域會(huì)產(chǎn)生熒光反射，大大降低了背景光噪聲干擾觀測(cè)標(biāo)的，故此項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面物質(zhì)的動(dòng)態(tài)觀察。熒光顯微CCD 熒光顯微CCD 是與熒光顯微鏡密切相關(guān)的數(shù)碼攝像產(chǎn)品，一方面它可以將熒光顯微鏡拍攝的顯微攝影產(chǎn)品通過(guò)usb接口傳輸?shù)诫娔X中，便于圖像的采集研究，另一方面，通過(guò)熒光顯微鏡CCD我們可以拍攝到比單純使用熒光顯微鏡更好的圖片。熒光顯微鏡CCD可以連接熒光顯微鏡組成顯微成像系統(tǒng)。 活體體內(nèi)熒光成像系統(tǒng)活體生物熒光成像技術(shù)是指在小的哺乳動(dòng)物體內(nèi)利用報(bào)告基因-熒光素酶基因表達(dá)所產(chǎn)生的熒光素酶蛋白與其小分子底物熒光素在氧、Mg2+離子存在的條件下消耗ATP發(fā)生氧化反應(yīng), 將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢?jiàn)光能釋放。然后在體外利用敏感的CCD設(shè)備形成圖像。熒光素酶基因可以被插入多種基因的啟動(dòng)子(promoter), 成為某種基因的報(bào)告基因, 通過(guò)監(jiān)測(cè)報(bào)告基因從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的監(jiān)測(cè)。5、聚焦顯微鏡激光共焦掃描顯微鏡 （confocal laser scanning microscopy） 激光共聚焦掃描顯微鏡是用激光作掃描 光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的 激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn) 即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。 由于激光束的波長(zhǎng)較短，光束很細(xì)，所以共焦 激光掃描顯微鏡有較高的分辨率，大約是普 通光學(xué)顯微鏡的3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描 限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這 些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過(guò)計(jì)算機(jī)分 析和模擬，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。激 光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形 態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析。 它的主要特點(diǎn)是：以激光作為光源。采用 共焦成像系統(tǒng)。掃描、顯示及記錄系統(tǒng)。激 光具有發(fā)散角小、方向性好的優(yōu)點(diǎn)，光束通過(guò) 聚焦后落在樣品（如細(xì)胞等）的不同深度；在 不同方向、不同深度的平面上進(jìn)行聚焦掃描， 從而得到一系列不同層次的清晰圖像。平面 間隔最小約600800nm；利用微機(jī)圖像合成 系統(tǒng)可重建細(xì)胞的三維圖像，可以更精確地 檢測(cè)、識(shí)別組織或細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)及其變 化雙光子共焦激光掃描顯微鏡 雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80 至 100 兆赫。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是最高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測(cè)效率。雙光子熒光顯微鏡有很多優(yōu)點(diǎn)：1）長(zhǎng)波長(zhǎng)的光比短波長(zhǎng)的光受散射影響較小容易穿透標(biāo)本；2）焦平面外的熒光分子不被激發(fā)使較多的激發(fā)光可以到達(dá)焦平面，使激發(fā)光可以穿透更深的標(biāo)本；3）長(zhǎng)波長(zhǎng)的近紅外光比短波長(zhǎng)的光對(duì)細(xì)胞毒性小；4）使用雙光子顯微鏡觀察標(biāo)本的時(shí)侯，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，雙光子顯微鏡比單光子顯微鏡更適合用來(lái)觀察厚標(biāo)本、更適合用來(lái)觀察活細(xì)胞、或用來(lái)進(jìn)行定點(diǎn)光漂白實(shí)驗(yàn)。二、超高分辨率成像技術(shù)1、Fluorescence imaging with one-nanometer accuracyFLONA可以追蹤1.5納米范圍內(nèi)的單個(gè)分子的位置。2、Photoactivatable localization microscopyPALM，可以將熒光顯微鏡的分辨率大大提高，可達(dá)到20nm。而PALM能做到這一點(diǎn)的原因是它每次只激發(fā)成像少數(shù)幾個(gè)甚至只有一個(gè)分子，這樣就不會(huì)有受制于分辨率了。在定位單個(gè)熒光分子之后便要數(shù)據(jù)處理再將它們一個(gè)個(gè)的組合成原來(lái)的樣子。3、Stochastic optical reconstruction microscopySTORM是一種超分辨率數(shù)字顯微鏡系統(tǒng)的新技術(shù)，該技術(shù)將“隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微術(shù)”（哈弗大學(xué)授權(quán)）與尼康的Eclipse Ti研究級(jí)倒置顯微鏡結(jié)合在了一起。N-STORM能夠顯著提高分辨率可達(dá)到傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡分辨率的十倍或者更多，N-STORM可采集納米級(jí)的二維或三維多光譜圖像，橫向分辨率接近20nm軸向分辨率也接近50nm。N-STORM將光學(xué)顯微鏡的分辨能力延伸到了前所未有的分子水平。遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率; 通過(guò)重疊單分子圖像構(gòu)建超分辨率的影像; 以超高的分辨率獲取三維信息; 獨(dú)特的多色彩技術(shù);甚至可以進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。三、電子顯微技術(shù)1、透射電子顯微鏡在光學(xué)顯微鏡下無(wú)法看清小于0.2µm的細(xì)微結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)。要想看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長(zhǎng)更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。1932年Ruska發(fā)明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡，電子束的波長(zhǎng)要比可見(jiàn)光和紫外光短得多，并且電子束的波長(zhǎng)與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說(shuō)電壓越高波長(zhǎng)越短。目前TEM的分辨力可達(dá)0.2nm。2、掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM ）主要是利用二次電子信號(hào)成像來(lái)觀察樣品的表面形態(tài)，即用極狹窄的電子束去掃描樣品，通過(guò)電子束與樣品的相互作用產(chǎn)生各種效應(yīng)，其中主要是樣品的二次電子發(fā)射。二次電子能夠產(chǎn)生樣品表面放大的形貌像，這個(gè)像是在樣品被掃描時(shí)按時(shí)序建立起來(lái)的，即使用逐點(diǎn)成像的方法獲得放大像。四、探針顯微技術(shù)1、原子力顯微鏡 原子力顯微鏡（Atomic Force Microscope ，AFM）一種可用來(lái)研究包括絕緣體在內(nèi)的固體材料表面結(jié)構(gòu)的分析儀器。它通過(guò)檢測(cè)待測(cè)樣品表面和一個(gè)微型力敏感元件之間的極微弱的原子間相互作用力來(lái)研究物質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)及性質(zhì)。將一對(duì)微弱力極端敏感的微懸臂一端固定，另一端的微小針尖接近樣品，這時(shí)它將與其相互作用，作用力將使得微懸臂發(fā)生形變或運(yùn)動(dòng)狀態(tài)發(fā)生變化。掃描樣品時(shí)，利用傳感器檢測(cè)這些變化，就可獲得作用力分布信息，從而以納米級(jí)分辨率獲得表面結(jié)構(gòu)信息。通過(guò)觀察細(xì)胞表面形態(tài)和三維結(jié)構(gòu)，可以獲得細(xì)胞的表面積、厚度、寬度和體積等的量化參數(shù)等。例如，利用AFM可以對(duì)細(xì)胞表面形態(tài)的改變、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及分子間作用力進(jìn)行研究。2、掃描隧道顯微鏡 掃描隧道顯微鏡（scanning tunnel microscope，STM ）作為一種掃描探針顯微術(shù)工具，掃描隧道顯微鏡可以讓科學(xué)家觀察和定位單個(gè)原子，它具有比它的同類原子力顯微鏡更加高的分辨率。此外，掃描隧道顯微鏡在低溫下（4K）可以利用探針尖端精確操掃描隧道顯微鏡縱原子，因此它在納米科技既是重要的測(cè)量工具又是加工工具。五、特殊顯微技術(shù)1、冷凍蝕刻技術(shù) 冷凍蝕刻技術(shù)是在冷凍斷裂技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的更復(fù)雜的復(fù)型技術(shù)。如果將冷凍斷裂的樣品的溫度稍微升高，讓樣品中的冰在真空中升華，而在表面上浮雕出細(xì)胞膜的超微結(jié)構(gòu)。當(dāng)大量的冰升華之后，對(duì)浮雕表面進(jìn)行鉑一碳復(fù)型，并在腐蝕性溶液中除去生物材料，復(fù)型經(jīng)重蒸水多次清洗后，撈在載網(wǎng)上作電鏡觀察。該技術(shù)是研究膜與膜蛋白的理想實(shí)驗(yàn)方法。2、X射線晶體學(xué) X射線晶體學(xué)是一門利用X射線來(lái)研究晶體中原子排列的學(xué)科。更準(zhǔn)確地說(shuō)，利用電子對(duì)X射線的散射作用，X射線晶體學(xué)可以獲得晶體中電子密度的分布情況，再?gòu)闹蟹治霁@得原子的位置信息，即晶體結(jié)構(gòu)。（以下論述以高分子材料的X射線晶體學(xué)為主）由于所有的原子都含有電子，并且X射線的波長(zhǎng)范圍為0.00110納米（即0.01100埃），其波長(zhǎng)與成鍵原子之間的距離（12埃附近）可比，因此X射線可用于研究各類分子的結(jié)構(gòu)。但是，到目前為止還不能用X射線對(duì)單個(gè)的分子成像，因?yàn)闆](méi)有X射線透鏡可以聚焦X射線，而且X射線對(duì)單個(gè)分子的衍射能力非常弱，無(wú)法被探測(cè)。而晶體（一般為單晶）中含有數(shù)量巨大的方位相同的分子，X射線對(duì)這些分子的衍射疊加在一起就能夠產(chǎn)生足以被探測(cè)的信號(hào)。從這個(gè)意義上說(shuō)，晶體就是一個(gè)X射線的信號(hào)放大器。X射線晶體學(xué)將X射線與晶體學(xué)聯(lián)系在一起，從而可以對(duì)各類晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，特別是蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)。3、Optical Tweezer是一種通過(guò)激光束移動(dòng)微小透明物體的裝置。其中把持物體的區(qū)域也稱為光阱(optical trap)，相應(yīng)的技術(shù)稱作光學(xué)捕捉(optical trapping)。這種技術(shù)可以用于移動(dòng)細(xì)胞或病毒顆粒，把細(xì)胞捏成各種形狀，或者冷卻原子。 4、倒置顯微鏡倒置顯微鏡（inverted microscope）組成和普通顯微鏡一樣，只不過(guò)物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。 六、放射性射線技術(shù) 1、核磁共振技術(shù)原子核有自旋運(yùn)動(dòng)，在恒定的磁場(chǎng)中，自旋的原子核將繞外加磁場(chǎng)作回旋轉(zhuǎn)動(dòng)， 叫進(jìn)動(dòng)(precession)。進(jìn)動(dòng)有一定的頻率，它與所加磁場(chǎng)的強(qiáng)度成正比。如在此基礎(chǔ)上再加一個(gè)固定頻率的電磁波，并調(diào)節(jié)外加磁場(chǎng)的強(qiáng)度，使進(jìn)動(dòng)頻率與電磁波頻率相同。這時(shí)原子核進(jìn)動(dòng)與電磁波產(chǎn)生共振，叫核磁共振。核磁共振時(shí)，原子核吸收電磁波的能量，記錄下的吸收曲線就是核磁共振譜(NMR-spectrum)。由于不同分子中原子核的化學(xué)環(huán)境不同，將會(huì)有不同的共振頻率，產(chǎn)生不同的共振譜。記錄這種波譜即可判斷該原子在分子中所處的位置及相對(duì)數(shù)目， 用以進(jìn)行定量分析及分子量的測(cè)定，并對(duì)有機(jī)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。 2、放射自顯影技術(shù)放射自顯影的原理是利用放射性同位素所發(fā)射出來(lái)的帶電離子(或粒子)作用于感光材料的鹵化銀晶體，從而產(chǎn)生潛影，這種潛影可用顯影液顯示，成為可見(jiàn)的像，因此，它是利用鹵化銀乳膠顯像檢查和測(cè)量放射性的一種方法。放射性核素的原子不斷衰變，當(dāng)衰變掉一半時(shí)所需要的時(shí)間稱為半衰期。各種放射性核素的半衰期長(zhǎng)短不同(表)，在自顯影實(shí)驗(yàn)中多選用半衰期較長(zhǎng)者。對(duì)于半衰期較短的核素，應(yīng)選用較快的樣品制備方法，所用劑量也應(yīng)加大。七、分子生物學(xué)技術(shù) 1、生物信息學(xué)技術(shù)生物信息學(xué)（Bioinformatics）是在生命科學(xué)的研究中，以計(jì)算機(jī)為工具對(duì)生物信息進(jìn)行儲(chǔ)存、檢索和分析的科學(xué)。它是當(dāng)今生命科學(xué)和自然科學(xué)的重大前沿領(lǐng)域之一，同時(shí)也將是21世紀(jì)自然科學(xué)的核心領(lǐng)域之一。其研究重點(diǎn)主要體現(xiàn)在基因組學(xué)（Genomics）和蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）兩方面，具體說(shuō)就是從核酸和蛋白質(zhì)序列出發(fā)，分析序列中表達(dá)的結(jié)構(gòu)功能的生物信息。 2、DNA雜交 分類學(xué)上不同物種的DNA分子之間可以進(jìn)行分子雜交，但是，遠(yuǎn)緣物種的DNA分子之間進(jìn)行雜交分子的可能性遠(yuǎn)比近緣物種的要小得多。例如，細(xì)菌與真核細(xì)胞DNA分子之間形成雜交分子的可能性很??；不同細(xì)菌的 DNA分子之間雜交時(shí)，能形成某些互補(bǔ)片段；人的DNA分子與小鼠的 DNA分子之間雜交時(shí)，只有少量的人DNA單鏈和小鼠DNA單鏈能形成雜交分子，而且只是部分堿基配對(duì)。但是，人與鼠之間的DNA 雜交分子的形成，比人與酵母之間DNA雜交分子的形成要容易。在生物進(jìn)化過(guò)程中，DNA中的堿基序列也發(fā)生了變化。兩種生物的DNA單鏈之間互補(bǔ)程度越高，通過(guò)分子雜交形成雙螺旋片段的程度也就越高，二者的親緣關(guān)系就越近；反之，親緣關(guān)系就越遠(yuǎn)。所以，可以通過(guò)DNA分子雜交技術(shù)來(lái)鑒定物種之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。 3、生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)是通過(guò)縮微技術(shù)，根據(jù)分子間特異性地相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過(guò)程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。2.你認(rèn)為哪些設(shè)備、技術(shù)和方法比較有用？哪些是比較新的或者是你比較感興趣的？答：我認(rèn)為一些比較傳統(tǒng)的技術(shù)，比如普通光學(xué)顯微鏡，相差顯微鏡，普通的熒光技術(shù)我們都已經(jīng)可以很好地進(jìn)行應(yīng)用，但是對(duì)于一些比較尖端的生命科學(xué)領(lǐng)域的研究來(lái)說(shuō)，這些傳統(tǒng)的技術(shù)已經(jīng)不能夠得到滿足。生命科學(xué)在觀察領(lǐng)域的發(fā)展一直在往微觀與動(dòng)態(tài)觀察努力，對(duì)于我們來(lái)說(shuō)，最好的情況是可以看清生命的動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)，那么會(huì)為生命科學(xué)帶來(lái)很多的發(fā)展。比如在以上表格中的第五大類的特殊顯微技術(shù)都是比較新的技術(shù)，這些技術(shù)的特點(diǎn)都是深入到單分子的層次，與電子顯微鏡不同的是，他們有希望發(fā)展成為新一代地可以讓學(xué)者直接觀察分子層次生命活動(dòng)的可能。 再比如說(shuō)，超高分辨率成像技術(shù)中的STORM技術(shù)是一種超分辨率數(shù)字顯微鏡系統(tǒng)的新技術(shù)，該技術(shù)將“隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微術(shù)”（哈弗大學(xué)授權(quán)）與尼康的Eclipse Ti研究級(jí)倒置顯微鏡結(jié)合在了一起。N-STORM能夠顯著提高分辨率可達(dá)到傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡分辨率的十倍或者更多，N-STORM可采集納米級(jí)的二維或三維多光譜圖像，橫向分辨率接近20nm軸向分辨率也接近50nm。N-STORM將光學(xué)顯微鏡的分辨能力延伸到了前所未有的分子水平。遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率; 通過(guò)重疊單分子圖像構(gòu)建超分辨率的影像; 以超高的分辨率獲取三維信息; 獨(dú)特的多色彩技術(shù);甚至可以進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察?？傊@些新型的顯微技術(shù)為生命科學(xué)的發(fā)展帶來(lái)了新的曙光。3.記錄并向老師和同學(xué)推薦你認(rèn)為比較好的參考書或網(wǎng)站。答：本文很多內(nèi)容來(lái)自網(wǎng)絡(luò)，比如維基百科、百度百科。這些百科類網(wǎng)站可以為我們提供最方便的途徑來(lái)了解一種技術(shù)的最基本信息。 我推薦兩個(gè)網(wǎng)站：/ NCKI知網(wǎng)空間，/ 生物秀網(wǎng)站和/ 中國(guó)生物技術(shù)信息網(wǎng)。這三個(gè)網(wǎng)站中對(duì)于生命科學(xué)領(lǐng)域的大部分基本問(wèn)題都有較為詳細(xì)的介紹。 還有幾篇文獻(xiàn)關(guān)于以上幾種特殊技術(shù)的文獻(xiàn)和書：FLONA: Ahmet Yildiz et al. Science. Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm LocalizationPALM: Eric Betzig et.al. Science. Imaging Intracellular Fluorescent Protein at Nanometer Resolution.STORM: Mark Bates et al. Science. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes.Optical tweezer: Sophie Dumont et al. Nature. RNA translocation and unwinding mechanism ofHCV NS3 helicase and its coordination by ATP生物信息學(xué)應(yīng)用技術(shù)，主編王祿山，高培基等。課后作業(yè)B1. 簡(jiǎn)述普通超薄切片的樣品制備過(guò)程及注意事項(xiàng)。答： 超薄切片的步驟包括：(1)取材和固定；(2)脫水和滲透；(3)包埋和聚合；(4)定位與修塊；(5)切片；（6）染色；（7）觀察。注意事項(xiàng)：(1) 取材時(shí)要做到四個(gè)字，即準(zhǔn)、快、輕、優(yōu)。 準(zhǔn)：準(zhǔn)確竊取所有部分的橫切面和縱切面，為切片打好基礎(chǔ)。 快：取材操作要迅速，盡快投入固定過(guò)程，以免材料變質(zhì)。 輕：取材操作要輕切、輕壓、輕捏，刀片要鋒利而且清潔，減少損傷和污染。 優(yōu)：選取優(yōu)質(zhì)材料，使用新鮮、優(yōu)質(zhì)的固定液和取材工具。 所取組織的體積要小，一般不超過(guò)1mm1mm1mm。也可將組織修成1mm1mm2mm大小長(zhǎng)條形。因?yàn)楣潭▌┑臐B透能力較弱，組織塊如果太大，塊的內(nèi)部將不能得到良好的固定。(2) 雙重固定的操作：取材前固定洗滌后固定洗滌脫水。洗滌是必須的過(guò)程，前固定后的洗滌目的是洗去還原性的前固定劑，以免減弱后固定劑的效力；后固定劑后的洗滌是為了防止后固定劑使洗脫劑氧化變黑，從而影響固定效果。(3) 選用不同固定劑需要注意的事項(xiàng) 戊二醛：一般以磷酸緩沖液配制。戊二醛是還原劑，不能與鋨酸等氧化劑混用，也不能用醋酸巴比妥緩沖液配制。最好在臨用前配制，用棕色瓶盛，4冰箱中保存，固定12h以上可能出現(xiàn)贗像。 甲醛：使用前新配，不宜久放。一般使用2-4%的濃度，固定時(shí)間在30min到幾小時(shí)內(nèi)，固定溫度以4為佳。 鋨酸：對(duì)于碳水化合物和核酸的固定能力不強(qiáng)。因此常與醛類固定劑做雙重固定，一般作后固定劑。鋨酸是劇毒品，連續(xù)吸入其蒸氣0.5ug即可永久喪失嗅覺(jué)，對(duì)皮膚和黏膜都用刺激作用。配制時(shí)需格外小心，戴好口罩、防護(hù)眼鏡，在通風(fēng)處配制，廢液要密封后集中處置，不能亂倒。(4)脫水時(shí)是將脫水劑配成不同的梯度濃度，逐級(jí)脫水。系列脫水劑用蒸餾水或重蒸水配制即可，不需要再用緩沖液。 常用脫水劑：乙醇和丙酮，甲醇、乙二醇、叔丁醇、聚乙二醇、環(huán)氧丙烷等也常使用。(5)將未聚合的包埋劑完全引入浸潤(rùn)材料后，一高溫或紫外線照射等條件處理，使之聚合硬化，制成能夠營(yíng)業(yè)進(jìn)行切片的包埋塊(6)制備超薄切片要使用特制超薄切片機(jī)（大多是根據(jù)精密機(jī)械推進(jìn)或金屬熱膨脹推進(jìn)原理制成）和特殊的切片刀（用斷裂的玻璃板制成的玻璃刀或用天然金剛石研磨而成的金剛石刀）。先將樹(shù)脂包埋塊中含有生物材料的部分，用刀片在立體顯微鏡下修整成細(xì)小的金字塔形，再用超薄切片機(jī)切成厚度適中（500 埃左右）的超薄片，切片應(yīng)依次相互聯(lián)接形成切片帶。切片帶漂浮于裝在切片機(jī)上的水槽中的水面上。2.何謂超薄切片？何謂半薄切片？制作半薄切片有什么研究意義？ 答：超薄切片（ultrathin section）：用于透射電鏡觀察的極薄標(biāo)本切片，厚約0.05 m。通常標(biāo)本用樹(shù)脂包埋，用超薄切片機(jī)制備?？捎糜赥EM觀察，進(jìn)行一般超微結(jié)構(gòu)、電鏡細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡、電鏡放射自顯影、x-射線微區(qū)元素分析等觀察。是由石蠟切片技術(shù)衍發(fā)而來(lái)，其主要技術(shù)原理和步驟都與石蠟切片的制作過(guò)程相似，只是對(duì)固定、包埋和染色藥品、載片工具、切片機(jī)、刀具等進(jìn)行了改進(jìn)，使之達(dá)到固定相更加精細(xì)，包埋劑硬度更高、透明度更好等要求，以利于進(jìn)行切片和觀察。半薄切片：由于光鏡切片可薄至0.52m，故而又稱半薄切片。半薄切片（厚度0.60.8m）的制備，在如今是一種常用制樣手段。由于半薄切片圖像的清晰度、分辨率遠(yuǎn)優(yōu)于石蠟切片，視野也大于超薄切片，所以有利于獲得高質(zhì)量的光鏡圖像。同時(shí)，半薄切片，也是電鏡超薄切片技術(shù)中一種有效的定位方法。半薄切片被應(yīng)用于各個(gè)方面，如，胚胎學(xué)，病理學(xué)，等等。可算是應(yīng)用廣泛，是目前較為普遍的一種切片方式。半薄切片制備中的一些關(guān)鍵技術(shù)如切片，撈片，脫脂，染色等也不同于石蠟切片和超薄切片，有其特點(diǎn)和難點(diǎn)。3.常規(guī)電子染色有哪些主要方法、技術(shù)要點(diǎn)和注意事項(xiàng)？電鏡細(xì)胞化學(xué)染色與常規(guī)染色有什么不同？ 常規(guī)電子染色方法： 電子顯微鏡主要是依賴散射電子成像，為了增強(qiáng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的電子反差，需要對(duì)切片進(jìn)行染色。染色是依據(jù)各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)與染色劑（重金屬鹽）結(jié)合的選擇性，而形成不同的對(duì)電子散射能力，從而產(chǎn)生借以區(qū)別各種結(jié)構(gòu)的反差。電子染色方法分塊染色和切片染色兩種：塊染色法，在脫水劑中加入染色劑，在脫水過(guò)程中對(duì)組織塊進(jìn)行電子染色。切片染色法，最常用，即將載有切片的金屬載網(wǎng)漂浮或浸沒(méi)在染色液中染色。也可使用有微處理機(jī)控制的染色機(jī)進(jìn)行自動(dòng)化染色。一般切片染色所使用的染色劑為金屬鈾鹽和鉛鹽的雙重染色。為顯示某種特殊結(jié)構(gòu)，則可采用與該結(jié)構(gòu)有特異性結(jié)合的選擇性染色劑。負(fù)染色研究以蛋白質(zhì)為主要成分的顆粒狀材料的最常用方法。以某些在電子束轟擊下穩(wěn)定而又不與蛋白質(zhì)相結(jié)合的重金屬鹽類作為負(fù)染色劑，使之在支持膜上將顆粒材料包圍，形成具有高電子散射能力的背景，襯托出低電子散射能力的顆粒的形態(tài)細(xì)節(jié)。其所成的電子顯微像的反差與常規(guī)電子染色相反，即暗的背景和亮的顆粒形態(tài)的所謂陰性反差。負(fù)染色方法簡(jiǎn)便，所獲得的顆粒的電子顯微圖像反差強(qiáng)，分辨率也高于超薄切片，可廣泛用于研究蛋白質(zhì)分子、細(xì)菌鞭毛、蛋白質(zhì)結(jié)晶，以及生物膜及分離的細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)，特別適用于蛋白質(zhì)大分子及病毒顆粒結(jié)構(gòu)的三維重建研究。常用的負(fù)染色劑有醋酸鈾、磷鎢酸鈉或磷鎢酸鉀、硅鎢酸、銅酸銨及甲酸鈾等。用液滴法或噴霧法將顆粒材料的懸液加在載網(wǎng)的支持膜上，然后滴加負(fù)染色劑溶液。或?qū)㈩w粒的懸液與負(fù)染色劑按一定濃度混合滴加或噴撒到支持膜上，吸去多余液體，待干燥后，即可用電鏡觀察。樣品顆粒在支持膜上的均勻分散是成功的關(guān)鍵之一。染色劑溶液的 pH 則是成功的另一關(guān)鍵。一般染色劑的 pH 應(yīng)在中性偏酸范圍（pH 57），但對(duì)不同種類的顆粒材料和染色劑，最適 pH 也不盡相同。常規(guī)電子染色的技術(shù)要點(diǎn)：一般流程為：醋酸雙氧鈾染色清洗檸檬酸鉛染色清洗晾干1) 醋酸雙氧鈾染色將干凈培養(yǎng)皿中加入溶解的石蠟(到培養(yǎng)皿容積的1/3即可)，冷卻凝固，制成蠟盤；在蠟盤上滴加染液，制成數(shù)排小液滴；在每個(gè)小液滴上放一片載網(wǎng)（有切片的一面朝下），室溫下染色20-60分鐘；用鑷子夾住載網(wǎng)邊緣，用剪尖的小濾紙片吸掉多余染液；在重蒸餾水中緩緩抖動(dòng)洗滌，換1-2次新重蒸餾水再洗；用滴管吸取重蒸餾水輕輕沖洗2) 檸檬酸鉛染色稱取硝酸鉛1.33g，檸檬酸鈉1.76g，依次放入50mL容量瓶中，加約30mL重蒸餾水，震搖30分鐘，使之形成乳白色懸濁液(形成檸檬酸鉛)；懸濁液中加入8mL 1mol/L的氫氧化鈉溶液，使溶液變透明；重蒸餾水至50mL定容。充分搖動(dòng)使之混合(pH12)；過(guò)濾到棕色試劑瓶中，密封瓶口，4冰箱保存。注意事項(xiàng)： 1) 鉛鹽有毒。鉛溶液很容易與二氧化碳反應(yīng)形成碳酸鉛沉淀，在染色過(guò)程中極易造成對(duì)切片的污染 2) 染色人員戴好口罩，室內(nèi)通風(fēng)或增氧，禁止閑雜人員入室參觀、聊天。 3) 以小液滴法染色20-40分鐘，方法與鈾染色相同。滴加染液和擺放銅網(wǎng)時(shí)要盡量并住呼吸，操作完成后立即蓋好培養(yǎng)皿蓋。 4) 將銅網(wǎng)放入0.1mol/L的氫氧化鈉溶液中漂洗1-2秒鐘，除去樣品上多余的染液；然后按與鈾染色法相同的方法清洗載網(wǎng)。吸去多余水分后，將載網(wǎng)放在鋪有濾紙的干凈培養(yǎng)皿中晾干。(加蓋防塵)5)防止鉛染色污染：防止材料過(guò)多接觸CO2。以氫氧化鈉顆粒吸附CO2；染液配制中迅速操作，避免干擾；防止染液吸入過(guò)多的造成污染；染液密封、低溫儲(chǔ)藏。 電鏡細(xì)胞化學(xué)