組織工程支架制備有哪些方法.ppt

一 纖維支架纖維支架是組織工程研究中最早采用的細(xì)胞外基質(zhì)替代物之一 主要由PGA或其共聚物等結(jié)晶性聚合物纖維構(gòu)成 利用紡織技術(shù)將直徑10 15 m的纖維制成織物或無(wú)紡物 其孔隙率高達(dá)97 比表面積高達(dá)0 05 m 1 但存在力學(xué)強(qiáng)度較差 承壓時(shí)會(huì)坍塌的缺點(diǎn) 三 支架制備技術(shù) 改進(jìn) 1 霧化或噴霧涂曾采用PLLA或PLGA溶液涂覆織物的方法 可使相鄰纖維間形成物理連結(jié) 從而使纖維支架穩(wěn)定 耐壓 2 熱處理溶出PGA纖維浸在PLLA CH2Cl2溶液中溶劑揮發(fā)后PGA嵌入到PLLA中加熱到兩種聚合物熔點(diǎn)以上 PLLA熔點(diǎn)低 先熔化 充滿PGA纖維網(wǎng)絡(luò)所有空洞 PLLA防止纖維網(wǎng)塌陷作用 交叉點(diǎn)的PGA纖維熔融后物理纏結(jié)在一起 用氯仿溶出PLLA通過(guò)織物提高機(jī)械性能 類似孔結(jié)構(gòu) 纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)加工示意圖A PGAB PLLA 二 多孔支架 松質(zhì)骨結(jié)構(gòu) 1 粒子致孔法最常用的是溶液澆注 粒子浸濾聚合物溶液與均一的鹽晶混合溶劑揮發(fā)后形成固體的聚合物 鹽復(fù)合物浸沒(méi)在水中去除鹽可控孔隙率達(dá)93 厚度 2mm 當(dāng)鹽晶含量為70 90 時(shí) 有均勻的聯(lián)孔結(jié)構(gòu) 致孔劑粒子可采用氯化鈉 酒石酸鈉和檸檬酸鈉等水溶性無(wú)機(jī)鹽或糖粒子 也可用石蠟粒子或冰粒子 溶液澆鑄 粒子浸濾法制備多孔支架時(shí)易形成致密的皮層 若澆鑄后不斷地振動(dòng)至大部分溶劑揮發(fā) 可防止粒子沉降 抑制表面皮層的形成 非溶劑聚沉 粒子致孔法簡(jiǎn)單 適用性廣 孔隙率和孔尺寸易獨(dú)立調(diào)節(jié) 是一個(gè)通用的方法 得到了廣泛的應(yīng)用 但致孔時(shí)往往需用到有機(jī)溶劑 形成氣體的鹽致孔水溶性致孔劑致孔冰晶致孔 GuopingChen etal Developmentofbiodegradableporousscaffoldsfortissueengineering MaterialsScienceandEngineering 2001 C17 63 9 Morphologyofcross sectionsofPLLAsponges 2 熱致相分離 TIPS 相分離法是指將聚合物溶液 乳液或水凝膠在低溫下冷凍 冷凍過(guò)程中發(fā)生相分離 形成富溶劑相和富聚合物相 然后經(jīng)冷凍干燥除去溶劑而形成多孔結(jié)構(gòu)的方法 因而 相分離法又往往稱為冷凍干燥法 按體系形態(tài)的不同可簡(jiǎn)單地分為乳液冷凍干燥法 溶液冷凍干燥法和水凝膠冷凍干燥法 均向聚合物溶液 高溫 低溫淬火熱力學(xué)狀態(tài)參數(shù) 溶液濃度 冷凍溫度 冷凍時(shí)間和冷凍速率等 液 液相分離相圖 PorousPDLLA BioglassscompositescaffoldspreparedbyTIPS bimodalandanisotropicporestructurescomposedoftubularmacroporesof100 m interconnectedwithmicroporesof10 50 mindiameter 冷卻到L S相平衡線以下干燥 溶液冷凍干燥 WhangK etal Anovelmethodtofabricatebioabsorbablescaffolds Polymer1995 36 837 42 乳液冷凍干燥 Ming HuaHo etal Preparationofporousscaffoldsbyusingfreeze extractionandfreeze gelationmethods Biomaterials2004 25 129 38 溫度低于溶液凝結(jié)點(diǎn) Morphologyofthechitosanandalginatescaffolds 水凝膠冷凍干燥 明膠 藻酸鹽和殼聚糖等水凝膠 不同溫度下 多步相分離粗化 提高孔尺寸 連通性 相分離 冷凍干燥法孔尺寸往往偏小 但該法避免了高溫 因而得到了研究者的重視 改進(jìn) 3 氣體發(fā)泡法 1 超臨界流體技術(shù) 物理發(fā)泡法 該法將聚合物壓成片 浸泡在高壓二氧化碳中直至飽和 甚至超臨界狀態(tài) 然后降至常壓 氣體的熱力學(xué)不穩(wěn)定性導(dǎo)致氣泡成核和增長(zhǎng) 形成多孔支架 超臨界二氧化碳 SCCO2 無(wú)殘留溶劑制備非晶相聚合物支架 優(yōu)點(diǎn) 不使用有機(jī)溶劑 因?yàn)闅埩粼谥Ъ苤械挠袡C(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞有害 反應(yīng)體系可以在比較低的溫度下進(jìn)行 30 40 C 便于藥物和生長(zhǎng)因子的粘附 缺點(diǎn) 支架的孔隙率和孔徑不可控 由氣體在固體中溶解 釋放過(guò)程的形態(tài)決定 連通率低 10 30 閉孔結(jié)構(gòu) 可聯(lián)合粒子浸濾法改進(jìn) 2 化學(xué)發(fā)泡法化學(xué)發(fā)泡法來(lái)制備多孔支架 采用的化學(xué)發(fā)泡劑主要為碳酸鹽類化合物 將聚合物溶液 碳酸氫銨粒子混合物加入到模具中 待溶劑部分揮發(fā)后直接浸入熱水中發(fā)泡 最后經(jīng)冷凍干燥可得到多孔支架 該法得到的多孔支架孔隙率超過(guò)90 孔相連性好 孔尺寸約100 500 m 并避免了表面皮層的形成 4 微球聚集法 將可降解聚合物微球加入模具中 加熱至玻璃化溫度以上 保持一定時(shí)間后冷卻 脫模可制得燒結(jié)微球支架 熱處理時(shí)微球相互接觸處由于鏈運(yùn)動(dòng)而連結(jié)在一起 冷卻至室溫后該結(jié)構(gòu)被固定下來(lái) 因而得到多孔的燒結(jié)微球支架 FabricationprocessofacompositeofPLAGAandBG Thecompositewaspreparedina3 D porousscaffoldbymicrospheresintering PVA LUetal JBiomedMaterRes64A 465 474 2003 微球緊密堆積產(chǎn)生的孔隙成為支架的孔 孔尺寸范圍為37 150 m 與微球尺寸成正比 孔隙率則隨微球尺寸增大略有增加 為31 39 孔相連性很好 該法優(yōu)點(diǎn)在于孔相連性好 孔尺寸易調(diào)控 力學(xué)強(qiáng)度大 微球可包裹藥物 生長(zhǎng)因子 進(jìn)行可控釋放 缺點(diǎn)則在于孔尺寸偏小 孔隙率亦低 5 靜電紡絲 優(yōu)點(diǎn) 操作簡(jiǎn)單 制品比表面積大缺點(diǎn) 耗時(shí)長(zhǎng) 效率低 可控性差 纖維難以排布規(guī)則 6 3D印刷澆鑄聚合物粉基礎(chǔ) 如 PLGA 按希望的分布點(diǎn) 印 微米體積的溶劑液滴 氯仿 當(dāng)溶劑揮發(fā)時(shí)凝結(jié)的粉固化重復(fù)以上操作 建立3D結(jié)構(gòu)搖出未凝結(jié)的粉精確性結(jié)構(gòu)型微孔聚合物或陶瓷支架 Typicalmorphologiesofporouspolymerfoamsproducedbysolidfreeformfabricationtechnique 快速成型法可一步形成支架的外形和相連的多孔結(jié)構(gòu) 是一種一體化制備方法 優(yōu)點(diǎn) 成型時(shí)間短 利于自動(dòng)化大規(guī)模生產(chǎn) 可根據(jù)個(gè)體的不同 迅速制備出具有個(gè)體特征的三維多孔支架 可制備各個(gè)部位具有不同孔結(jié)構(gòu)的支架以適應(yīng)復(fù)合組織的不同要求 缺點(diǎn) 支架孔隙率偏低 通常小于80 改進(jìn) 7 相連管狀孔道支架將糖纖維等水溶性纖維材料預(yù)先構(gòu)建成具有特定結(jié)構(gòu)的三維 負(fù) 支架 負(fù) 支架經(jīng)水蒸汽處理后形成連結(jié) 將聚合物溶液滴在 負(fù) 支架上 冷凍使聚合物溶液凝膠化 用水浸出糖纖維冷凍干燥脫除溶劑 得到的多孔支架具有預(yù)先設(shè)計(jì)的相連管狀孔道結(jié)構(gòu) 孔隙率高達(dá)90 以上 并具有納米纖維孔壁結(jié)構(gòu) 負(fù) 支架的構(gòu)建既可手工完成 也可用快速成型技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化 與通常的快速成型技術(shù)不同的是 首先形成的是最終的多孔支架的 負(fù) 復(fù)制品 該支架的相連管狀孔道結(jié)構(gòu)更有利于支架內(nèi)的傳質(zhì)過(guò)程 其納米纖維孔壁結(jié)構(gòu)則更有利于細(xì)胞粘附 支架設(shè)計(jì)及制備技術(shù) 表 三維支架制備技術(shù) 三 注射型組織再生支架 軟支架 可注射型支架是將一種具有流動(dòng)性的生物相容性良好的材料與異體或自體細(xì)胞復(fù)合后注射到機(jī)體缺損部位 或直接注人體內(nèi) 材料到達(dá)缺損部位后能在原位形成具有一定機(jī)械強(qiáng)度 形狀并且可與體液進(jìn)行交換的支架 支架通過(guò)注射完成植入 故可降低手術(shù)難度 減少手術(shù)創(chuàng)傷 特別適用于微創(chuàng)傷的修復(fù) 高長(zhǎng)有 馬列 醫(yī)用高分子材料 P229 234 洪奕等 注射型組織再生支架的研究進(jìn)展 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志 2007 24 2 463 465 可注射型支架在組織工程中應(yīng)用的示意圖 水凝膠具有在一定條件下可保持流動(dòng)狀態(tài)而在外部的物理或化學(xué)刺激下可形成一定形狀和強(qiáng)度的體型材料的特性 因此成為可注射型支架的首選材料 水凝膠作為可注射型支架優(yōu)點(diǎn) 具有良好生物相容性 水溶液環(huán)境有利于保護(hù)細(xì)胞以及營(yíng)養(yǎng)物和分泌產(chǎn)物的運(yùn)輸 易用細(xì)胞粘附配體進(jìn)行改性 水凝膠作為可注射型支架缺點(diǎn) 水凝膠的操作不易控制 機(jī)械強(qiáng)度較低 消毒困難 1 溫敏型水凝膠類可注射支架 溫敏型水凝膠是指當(dāng)一定濃度的溶液在溫度升高或降低到一定值時(shí)可迅速形成凝膠 可分為升溫型水凝膠和降溫型水凝膠 由于溫敏型水凝膠只需通過(guò)改變溫度就可凝膠化 大大降低了外界物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的影響 因此用于可注射型支架具有一定的優(yōu)越性 例如 降溫型 瓊脂 升溫型 PEO 膠原 PNIPAm接枝明膠 2 交聯(lián)型水凝膠類可注射支架指在添加助劑或者引發(fā)劑后 分子鏈間發(fā)生交聯(lián)形成水凝膠 交聯(lián)方式有共價(jià)鍵交聯(lián) 離子鍵交聯(lián)等 交聯(lián)也可通過(guò)光引發(fā)來(lái)進(jìn)行 如 聚反丁烯二酸丙二醇酯 PPF 通過(guò)主鏈上的雙鍵和含雙鍵的單體或低聚物進(jìn)行交聯(lián)原位形成凝膠 為減小溫度 添加交聯(lián)劑及引發(fā)劑 對(duì)細(xì)胞的活性的影響 可采取微囊化復(fù)合改進(jìn) 如 Payne等將骨髓間質(zhì)成骨干細(xì)胞微囊化后種植在水凝膠以保持細(xì)胞活性 3 復(fù)合水凝膠型可注射型支架以水凝膠為載體的可注射型支架主要用于骨修復(fù) 一般是采用微粒與水凝膠材料以適當(dāng)比例共混 保持流動(dòng)性 然后將混合物注射到缺損部位后凝膠化 目前報(bào)道最多的是以羥丙基甲基纖維素水凝膠與具生物活性的磷酸鈣 BCP 復(fù)合以制備可注射型骨替代物一 纖維素類水凝膠是一類升溫型水凝膠 可以通過(guò)纖維素濃度來(lái)控制凝膠化的溫度范圍 組織修復(fù)中的可注射型材料 PPF 聚反丁烯二酸丙二醇酯 可注射型支架研究中存在的問(wèn)題 如何提高水凝膠的強(qiáng)度凝膠化的可控性對(duì)于預(yù)制備降溫型 交聯(lián)型等水凝膠時(shí)與細(xì)胞的復(fù)合問(wèn)題等 MicrospheresBiodegradablePLGAmicrosphereshavebeenstudiedfordeliveryofchondrocytesforcartilageengineering Non porousPLGAmicrospherescouldbeusedas i amicrocarrierforcellexpansioninvitro 130 priortouseasan ii injectablecarrierforcartilageregenerationinvivo 131 133 Werecentlyreportedthathighlyporousmicrospheres 200 minoveralldiameterand 30 minporediameter couldbepreparedbyagasfoamingmethod 29 Theseporousscaffoldmicrospherescouldbeusedformicrocarriersuspensioncultureofcells aswellasinjectionofthecell microsphereconstructsintoatissuedefectsite Fig 5 Theseinjectableandporousmicrosphereswouldprovideagreatadvantageforcelltherapyinmanyaspects Priortoinjection theporousstructure 30 m wouldallowsufficientcellseedinginandoutofthematrix Afterinjectioninvivo theporousmatrixwouldpermitinfiltrationofcellsandin growthoftissuefromthehost facilitatingtheregenerationprocess H J Chung T G Park AdvancedDrugDeliveryReviews59 2007 249 262 Fig 5 Useofinjectableporousscaffoldmicrospheresforcartilagetissueengineeringasanexample Primarychondrocytesareseededwithinporousscaffoldmicrospheres expandedinvitro andtheninjectedoralternativelyimplantedasaculturedtissueintoacartilagedefectsite 軟骨細(xì)胞 四 天然組織工程支架 天然支架是利用天然材料本身存在的疏松或多孔狀結(jié)構(gòu) 通過(guò)一定的制備方法得到的多孔支架材料 例如 利用直接或完全替代的原理 用其它個(gè)體的骨組織的無(wú)機(jī)部分作為支架材料 異種骨異體骨 脫鈣骨 凍干骨 海珊瑚 五 組織工程支架的發(fā)展 不同材料間的復(fù)合生長(zhǎng)因子的引入物理結(jié)構(gòu)上的仿生化 多層次 理想組織工程支架模式圖 生物材料表面改性方法 生物大分子的表面固定化 將具有生物活性的大分子通過(guò)物理吸附 包埋或化學(xué)鍵合的方法固定在材料的表面 生物活性大分子 ECM黏附蛋白 纖連蛋白 層連蛋白 ECM多糖及其類似物 透明質(zhì)酸 殼聚糖 細(xì)胞黏附多肽 RGD 細(xì)胞活性因子 注 RGD系含有精氨酸 甘氨酸 天冬氨酸的促進(jìn)細(xì)胞粘附的寡肽 8 4組織工程中的微膠囊技術(shù) 一 微膠囊概論微膠囊是指以高分子膜為外殼 其中包有被保護(hù)或被密封的物質(zhì)的微小包囊物 就像魚(yú)肝油丸那樣 外面是一個(gè)明膠膠囊 里面是液態(tài)的魚(yú)肝油 經(jīng)過(guò)這樣處理 魚(yú)肝油由液體變成了固體 微膠囊的顆粒直徑要比傳統(tǒng)的魚(yú)肝油丸小得多 尺寸范圍在零點(diǎn)幾微米至幾千微米之間 一般為5 200 m 單核 多核 多核 不規(guī)則外形 雙璧 微膠囊簇 含微膠囊之微膠囊 微膠囊內(nèi)被包裹的物質(zhì)通常稱為芯 core 核 nucleus 或填充物 fill 外壁稱為皮 skin 殼 shell 或保護(hù)膜 protectivefilm 微膠囊中所包裹的物質(zhì) 可以是液體 固體粉末 也可是氣體 由于應(yīng)用目的和制造工藝不同 微膠囊的大小 形狀可有很大變化 其包裹形式也有多種 常見(jiàn)的有 生物微膠囊的概念將酶 蛋白質(zhì)和激素等生物活性物質(zhì)或微生物 動(dòng)植物細(xì)胞包封在親水性的選擇性透過(guò)膜中 形成的球狀微膠囊 稱之為生物微膠囊 1957年 Chang首次報(bào)道生物活性物質(zhì)的微囊化 ChangTMS Hemoglobincorpuscles ResearchReportforHonoursPhysiology MedicalLibrary McGillUniversity 1957 60年代中期 Chang又指出了生物微膠囊在臨床及其他生物學(xué)應(yīng)用上的可行性 ChangTMS Semipermeablemicrocapsules Science 1964 146 524 525 通過(guò)微膠囊膜的選擇透過(guò)作用 使囊外大于某一分子量的物質(zhì)不能擴(kuò)散進(jìn)入 而生物環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)成分和囊內(nèi)生物活性物質(zhì)或細(xì)胞分泌的小分子產(chǎn)物可以自由出入微膠囊 從而達(dá)到免疫隔離目的 生物微膠囊示意圖 方法 1 把需要的細(xì)胞密封在半透膜中2 植入密封裝置或與體內(nèi)連接3 細(xì)胞分泌物 治療4 當(dāng)治療完成時(shí)裝置取出或斷開(kāi)連接 80年代初 人工胰腺 將微囊化技術(shù)與組織細(xì)胞移植相結(jié)合 制備了具有良好生物相容性的海藻酸鈉 聚賴氨酸微膠囊作為免疫隔離工具 包埋豬胰島細(xì)胞形成人工細(xì)胞 并移植入糖尿病大鼠體內(nèi) 結(jié)果表明該人工細(xì)胞成功地調(diào)節(jié)了血糖水平 代行了大鼠胰腺功能 LimF SunAM Science 1980 210 908 909 90年代以來(lái) 醫(yī)學(xué)界開(kāi)始嘗試以微膠囊作為基因重組細(xì)胞的免疫隔離和運(yùn)載工具 利用重組細(xì)胞的代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能 治療相關(guān)疾病 目前 微膠囊的應(yīng)用研究還涉及藥物控制釋放 動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞和酶的固定化 以及生化物質(zhì)分離等領(lǐng)域 二 生物微膠囊的種類及其制備 生物微膠囊在應(yīng)用上必須滿足如下條件 對(duì)生物物質(zhì)沒(méi)有毒害作用 生物相容性好 但不支持細(xì)胞粘附 也不刺激細(xì)胞過(guò)渡生長(zhǎng) 良好的傳質(zhì)性質(zhì) 生物活性物質(zhì) 信息物質(zhì) 細(xì)胞產(chǎn)物