初始污染菌檢測(cè)講義修訂.ppt

2008年5月 1 一次性使用醫(yī)療用品初始污染菌檢測(cè) 江蘇省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所一次性器具室 2008年5月 2 微生物基礎(chǔ)知識(shí) 微生物基礎(chǔ)知識(shí)無(wú)菌技術(shù)初始污染菌檢測(cè)關(guān)鍵步驟致病菌檢查 2008年5月 3 2008年5月 4 微生物基礎(chǔ)知識(shí) 微生物與微生物學(xué) 自然界中存在著一個(gè)數(shù)量極其龐大 個(gè)體微小和結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的生物類群 即微生物 微生物大多數(shù)為單細(xì)胞 必須借助光學(xué)顯微鏡放大千倍或電子顯微鏡放大數(shù)萬(wàn)倍才能肉眼可見的一類微小生物的統(tǒng)稱 微生物學(xué)是研究微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu) 分類 生理代謝 遺傳變異 生態(tài)分布和微生物與人類 動(dòng)植物關(guān)系等的一門學(xué)科 我們對(duì)微生物深入研究的目的在于更好地開發(fā)微生物資源 充分利用微生物有利于人類生活方面 控制微生物的有害方面 使之更好地為人類服務(wù) 2008年5月 5 微生物的分類 2008年5月 6 細(xì)菌形態(tài)特征 細(xì)菌個(gè)體形態(tài) 細(xì)菌是一類細(xì)胞細(xì)而短 細(xì)胞直徑約0 5 m 0 5 5 m 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單 細(xì)胞壁堅(jiān)韌以二等分裂方式繁殖和水生性較強(qiáng)的原核微生物 分布廣泛 形態(tài)圖 細(xì)菌菌落形態(tài) 單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖后 會(huì)形成以母細(xì)胞為中心的一堆肉眼可見 有一定形態(tài)構(gòu)造的子細(xì)胞集團(tuán) 這就是菌落 細(xì)菌菌落常表現(xiàn)為濕潤(rùn) 粘稠 光滑 較透明 易挑取 質(zhì)地均勻以及菌落正反面或邊緣與中央部位顏色一致等 細(xì)菌的菌落特征因種而異 可作為鑒定細(xì)菌種的依據(jù) 菌落圖 2008年5月 7 細(xì)菌形態(tài)特征 2008年5月 8 細(xì)菌形態(tài)特征 粘質(zhì)沙雷氏菌的菌落特征 2008年5月 9 細(xì)菌形態(tài)特征 銅綠假單孢菌的菌落特征 2008年5月 10 細(xì)菌形態(tài)特征 金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)要求不高 在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好 需氧或兼性厭氧 最適生長(zhǎng)溫度37 C 最適生長(zhǎng)pH7 4 平板上菌落厚 有光澤 圓形凸起 直徑1 2mm 血平板菌落周圍形成透明的溶血環(huán) 2008年5月 11 細(xì)菌形態(tài)特征 金黃色葡萄球菌的單個(gè)菌落在Baird Parker瓊脂平板上呈圓形 表面光滑 凸起 濕潤(rùn) 直徑2 3mm 灰黑色至黑色 有光澤 常有淺色 非白色 的邊緣 周圍繞以不透明圈 沉淀 其外常有一清晰帶 當(dāng)用接種針觸及菌落時(shí)具有黃油樣粘稠感 2008年5月 12 細(xì)菌形態(tài)特征描述 大小 直徑形狀 圓形 假根形 不規(guī)則型隆起形狀 擴(kuò)展 苔狀 低凸 凸面 乳頭狀邊緣 整齊 波狀 裂葉狀 圓鋸齒狀 有緣毛表面狀態(tài) 光滑 皺褶 顆粒狀 龜裂狀 同心環(huán)狀表面光澤 閃光 不閃光 金屬光澤質(zhì)地 油脂狀 膜狀 脆透明程度 不透明 半透明 細(xì)菌菌落的常規(guī)描述 2008年5月 13 細(xì)菌形態(tài)特征 細(xì)菌基本結(jié)構(gòu) 莢膜 細(xì)胞壁 胞漿膜 核蛋白 核質(zhì) 2008年5月 14 細(xì)菌形態(tài)特征 革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較 脂多糖 LPS 包括脂蛋白A 核心多糖和特異性多糖三個(gè)部分 LPS對(duì)動(dòng)物具有毒性作用 它牢固地結(jié)合在細(xì)胞表面 只在菌體融解時(shí)才釋放 稱為細(xì)菌內(nèi)毒素 其中脂蛋白A是內(nèi)毒素的主要生物學(xué)活性組分 2008年5月 15 真菌形態(tài)特征 霉菌個(gè)體形態(tài) 霉菌亦稱絲狀真菌 是在分類學(xué)上很不相同的許多真菌的一部分 凡是生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀 蜘蛛網(wǎng)狀或絮狀菌絲體的真菌 統(tǒng)稱為霉菌 霉菌為真核微生物 其結(jié)構(gòu)比細(xì)菌復(fù)雜 酵母菌個(gè)體形態(tài) 酵母菌是單細(xì)胞真核微生物 酵母菌細(xì)胞的形態(tài)通常有球形 卵圓形 臘腸形 橢圓形 檸檬形或藕節(jié)形等 比細(xì)菌的單細(xì)胞個(gè)體要大得多 一般為1 5微米 5 30微米 酵母菌無(wú)鞭毛 不能游動(dòng) 酵母菌具有典型的真核細(xì)胞結(jié)構(gòu) 有細(xì)胞壁 細(xì)胞膜 細(xì)胞核 細(xì)胞質(zhì) 液泡 線粒體等 有的還具有微體 2008年5月 16 霉菌形態(tài)特征 由于霉菌的菌絲較粗而長(zhǎng) 因而霉菌的菌落較大 有的霉菌的菌絲蔓延 沒有局限性 其菌落可擴(kuò)展到整個(gè)培養(yǎng)皿 有的種則有一定的局限性 直徑1 2厘米或更小 菌落質(zhì)地一般比放線菌疏松 外觀干燥 不透明 呈現(xiàn)或緊或松的蛛網(wǎng)狀 絨毛狀或棉絮狀 菌落與培養(yǎng)基的連接緊密 不易挑取 菌落正反面的顏色和邊緣與中心的顏色常不一致 2008年5月 17 酵母菌形態(tài)特征 啤酒酵母的菌落 大多數(shù)酵母菌的菌落特征與細(xì)菌相似 但比細(xì)菌菌落大而厚 菌落表面光滑 濕潤(rùn) 粘稠 容易挑起 菌落質(zhì)地均勻 正反面和邊緣 中央部位的顏色都很均一 菌落多為乳白色 少數(shù)為紅色 個(gè)別為黑色 2008年5月 18 微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律 將少量單細(xì)胞純培養(yǎng)接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中 在適宜的條件下培養(yǎng) 定時(shí)取樣測(cè)定其細(xì)菌含量 可以看到以下現(xiàn)象 開始有一短暫時(shí)間 細(xì)菌數(shù)量并不增加 隨之細(xì)菌數(shù)目增加很快 既而細(xì)菌數(shù)又趨穩(wěn)定 最后逐漸下降 如果以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo) 以細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù)或生長(zhǎng)速度為縱坐標(biāo)作圖 可以得到一條曲線 稱為繁殖曲線 通常又稱為生長(zhǎng)曲線 生長(zhǎng)曲線代表了細(xì)菌在新的適宜的環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖直至衰老死亡全過程的動(dòng)態(tài)變化 根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖速率的不同 可將生長(zhǎng)曲線大致分為延遲期 對(duì)數(shù)期 穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)階段 規(guī)律的描述 規(guī)律示意圖 2008年5月 19 微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律 延遲期 少量細(xì)菌接種到新鮮培養(yǎng)基后 一般不立即進(jìn)行繁殖 生長(zhǎng)速度近于零 處于延遲期細(xì)菌細(xì)胞的特點(diǎn)是分裂遲緩 代謝活躍 對(duì)數(shù)期 對(duì)數(shù)期又稱指數(shù)期 這一階段突出特點(diǎn)是細(xì)菌數(shù)以幾何級(jí)數(shù)增加 代時(shí)穩(wěn)定 細(xì)菌數(shù)目的增加與原生質(zhì)總量的增加 與菌液混濁度的增加均呈正相關(guān)性 穩(wěn)定期 又稱恒定期或最高生長(zhǎng)期 處于穩(wěn)定期的微生物 新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等 整個(gè)培養(yǎng)物中二者處于動(dòng)態(tài)平衡 此時(shí)生長(zhǎng)速度又逐漸趨向零 衰亡期 穩(wěn)定期后如再繼續(xù)培養(yǎng) 細(xì)菌死亡率逐漸增加 以致死亡數(shù)大大超過新生數(shù) 群體中活菌數(shù)目急劇下降 出現(xiàn)了 負(fù)生長(zhǎng) 此階段叫衰亡期 2008年5月 20 微生物操作技術(shù) 無(wú)菌環(huán)境是前提 主要是指在微生物實(shí)驗(yàn)工作中 控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施 其中包括無(wú)菌環(huán)境設(shè)施 無(wú)菌實(shí)驗(yàn)器材等 統(tǒng)稱為無(wú)菌技術(shù) 無(wú)菌環(huán)境的應(yīng)用是一個(gè)完整的操作技術(shù)體系 若其中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)污染 那么其他環(huán)節(jié)雖是無(wú)菌操作 也將完全失去意義 無(wú)菌技術(shù)概念 無(wú)菌環(huán)境 無(wú)菌環(huán)境是指人們用物理的或化學(xué)的方法 在某一可控的空間內(nèi)使微生物數(shù)量降低到最低限度 接近于無(wú)菌的一種空間 2008年5月 21 試驗(yàn)環(huán)境的要求及無(wú)菌操作 環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行 陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)室 檢查間分離 嚴(yán)格按無(wú)菌操作 防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染 避免操作者自身被微生物感染 無(wú)菌操作在有潔凈級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行 與試驗(yàn)相關(guān)的金屬器械 玻璃器皿 稀釋劑等應(yīng)經(jīng)過滅菌處理 其他的材料應(yīng)經(jīng)過表面消毒 紫外線照射消毒后 再帶入實(shí)驗(yàn)室 2008年5月 22 無(wú)菌技術(shù) 技術(shù)培訓(xùn)和考核制度儀器和試劑的校對(duì)制度實(shí)驗(yàn)記錄制度結(jié)果質(zhì)疑和核對(duì)制度技術(shù)方法的規(guī)范制度 實(shí)驗(yàn)室安全制度 安全通則生物安全 微生物檢驗(yàn)質(zhì)量控制制度 2008年5月 23 無(wú)菌技術(shù) 菌種 菌種保藏原理 保藏的原則是根據(jù)微生物的菌種生理 生化特性 在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度 使細(xì)胞基本上處于休眠狀態(tài) 生長(zhǎng)繁殖受到抑制但又不至于死亡 以降低菌種的變異率 菌種保藏步驟 選擇典型菌落 確定菌體形態(tài) 選擇保藏方法 定期檢查 菌種保藏方法 2008年5月 24 無(wú)菌技術(shù) 瓊脂斜面低溫保存法 方法 適用范圍 特點(diǎn) 注意事項(xiàng) 將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面上 按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng) 待充分生長(zhǎng)后 把培養(yǎng)好的新鮮菌種管用牛皮紙包好 4度冰箱保藏 每隔1個(gè)月移種一次 繼續(xù)進(jìn)行保藏 本法適用與經(jīng)常使用的細(xì)菌 酵母菌等 1 優(yōu)點(diǎn) 簡(jiǎn)便 易推廣 一般不需要另選則保藏用培養(yǎng)基 對(duì)大多數(shù)都適用 2 缺點(diǎn) 保藏期短 傳代次數(shù)多 易變異和污染 1 保藏菌種的選擇 2 定期檢查 3 做好記錄 2008年5月 25 無(wú)菌技術(shù) 半固體石蠟保存法 方法 適用范圍 特點(diǎn) 注意事項(xiàng) 用石蠟讓培養(yǎng)物與空氣隔絕 以降低菌種的生理生化水平 并可防止水分蒸發(fā) 從而延長(zhǎng)菌種的保藏時(shí)間 本法適用與部分霉菌 酵母菌和放線菌等 對(duì)細(xì)菌的效果較差 1 優(yōu)點(diǎn) 簡(jiǎn)便 易推廣 1 液體石蠟的高度 2 定期檢查 3 做好記錄 2008年5月 26 無(wú)菌技術(shù) 斜面培養(yǎng)基接種技術(shù) 方法 左手持分離培養(yǎng)的平板培養(yǎng)基 右手持接種環(huán) 經(jīng)火焰燒灼 冷卻后在平板上挑取菌落 左手立即放下平板 換持斜面培養(yǎng)基 用右手小指和無(wú)名指拔出管塞 夾持于手指之間 將管口在火焰上通過兩三次 但勿燒燙 再迅速將挑取有菌的接種環(huán)伸進(jìn)斜面內(nèi) 從斜面的底部向上劃一條接種線 又自下而上蜿蜒接種成曲線 退出接種環(huán) 塞上管塞 接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌后放置 培養(yǎng)后 沿接種線長(zhǎng)出菌苔 非接種線的部位應(yīng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng) 2008年5月 27 無(wú)菌技術(shù) 分離技術(shù) 劃線分離法 分段劃線法 組段間接種環(huán)的滅菌 冷卻 2008年5月 28 無(wú)菌技術(shù) 金黃色葡萄球菌的保藏 一般為凍干粉劑 安瓿瓶密封包裝 選擇性培養(yǎng)基分離菌種 增菌性培養(yǎng) 選擇性培養(yǎng)基分離菌種 斜面接種 培養(yǎng) 低溫保藏 2008年5月 29 無(wú)菌技術(shù) 無(wú)菌器材 凡是檢驗(yàn)中使用的器材 能滅菌處理的 必須滅菌處理 如 玻璃器皿 吸管 培養(yǎng)基 稀釋劑 無(wú)菌衣 口罩等 在使用前必須經(jīng)過適當(dāng)方法滅菌 并在較潔凈的環(huán)境中保存?zhèn)溆?凡檢驗(yàn)用器材無(wú)法滅菌處理的 使用前必須經(jīng)消毒處理 如 無(wú)菌室的桌凳 天平 工作臺(tái)以及工作人員的手等 2008年5月 30 無(wú)菌技術(shù) 無(wú)菌操作 基本概念 無(wú)菌操作一般是指在無(wú)菌環(huán)境條件下 使用無(wú)菌制品或無(wú)菌器材進(jìn)行檢驗(yàn)或?qū)嶒?yàn)的過程中 能防止微生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法 操作目的 1 保證檢驗(yàn)物品不被環(huán)境中的微生物的污染 2 防止被檢微生物在操作中污染實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)環(huán)境 主要方面 1 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 2 實(shí)驗(yàn)中的操作 3 意外事故的處理 2008年5月 31 無(wú)菌技術(shù) 進(jìn)入無(wú)菌室的控制 1 定期檢查無(wú)菌環(huán)境的空氣是否符合規(guī)定 2 無(wú)菌室在使用前開啟紫外線燈30 60min進(jìn)行空氣消毒 3 在進(jìn)行接種傾注瓊脂平板均需在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)或接種罩內(nèi)操作3 檢查一切進(jìn)入無(wú)菌環(huán)境的器材滅菌 消毒的標(biāo)志物是否完備 4 洗手消毒 首先用肥皂涂在手上揉搓10 15s 肥皂雖不殺菌 有去污作用 然后用流水徹底沖洗 可有效除去手上大多數(shù)暫住菌 如連續(xù)洗2 3次 視手的污染程度 使殘余的微生物減少到最低水平 再用消毒液洗手 如洗必泰 苯扎溴銨 碘伏 乙醇 過氧乙酸等 5 操作人員將手部消毒后 再穿戴無(wú)菌工作服 包括鞋 帽 口罩等 嚴(yán)格的無(wú)菌服應(yīng)是戴帽套頭的無(wú)扣的上衣 頸部 臉部及袖口是緊口的 以保護(hù)身體 防止污染 一般的無(wú)菌衣是背開口 圍胸部 緊扣頸部與長(zhǎng)袖緊口的 以保護(hù)身體 防止污染 6 在進(jìn)入無(wú)菌室后 進(jìn)一步用浸有消毒液的棉球或泡沫塑料物消毒手 然后可進(jìn)行檢驗(yàn)或?qū)嶒?yàn)操作 2008年5月 32 無(wú)菌技術(shù) 檢驗(yàn)過程的控制 1 在所有操作中均不應(yīng)大幅度或快速動(dòng)作 以免攪動(dòng)空氣中塵埃微粒 2 使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放 避免破損 以防培養(yǎng)物擴(kuò)散 3 在近火焰區(qū)操作 4 使用金屬接種器具 用前 用后均需燃燒滅菌 5 應(yīng)用橡膠乳頭套在吸管上端 吸吹供試液或培養(yǎng)液等 切勿用嘴直接吸吹吸管 6 用注射器吸取樣品 培養(yǎng)物時(shí) 注射器內(nèi)應(yīng)無(wú)空氣 裝卸針頭時(shí)應(yīng)用滅菌的鑷子 從密封容器內(nèi)抽取液體時(shí) 應(yīng)注入無(wú)菌空氣 帶液體的針筒針頭應(yīng)向上傾斜 并用75 乙醇棉球 擠干 保護(hù)針頭根部 注射時(shí)勿用力過猛 以免內(nèi)容物噴出或針頭脫落使溢出液體污染滅菌器材或環(huán)境 7 當(dāng)滅菌瓶塞或試管塞掉落在工作臺(tái)上 一般不宜再用 應(yīng)另?yè)Q無(wú)菌塞 或通過火焰處理后再用 2008年5月 33 無(wú)菌技術(shù) 意外事故的控制 1 假定無(wú)菌衣受污染 應(yīng)脫下翻轉(zhuǎn)包裹 使污染部分包在內(nèi)部 送往消毒 經(jīng)滅菌后 洗滌再用 2 因偶然打破盛有培養(yǎng)物的器皿 致使病原性的菌毒種外溢 污染了工作室及操作者的衣物及體表時(shí) 當(dāng)事人應(yīng)冷靜 切勿亂動(dòng)以免擴(kuò)大污染面 應(yīng)喚他人用浸透消毒液的毛巾或紗布覆蓋于碎片上 或?qū)⑾疽旱乖谖廴緟^(qū) 浸沒一定時(shí)間 先從外至內(nèi)逐步清理污染源 最后將衣物徹底滅菌 清理時(shí)應(yīng)避免用手指收集玻璃碎片 以防污染皮膚 造成病原性微生物感染事故 3 對(duì)一般小面積的污染可自行處理 較大范圍的污染則請(qǐng)人協(xié)助 2008年5月 34 消毒滅菌技術(shù) 消毒disinfection 消毒基本概念 消毒是殺滅清除傳播媒介上病原微生物 但不能殺死芽孢等全部微生物 所以消毒是不徹底的 不能代替滅菌 消毒方法 見下頁(yè) 滅菌sterilization 滅菌基本概念 凡能殺滅物體中所有活的微生物的作用稱為滅菌 常用滅菌方法 濕熱滅菌法 干熱滅菌法 輻射滅菌法 氣體滅菌法等 2008年5月 35 消毒滅菌技術(shù) 2008年5月 36 消毒滅菌技術(shù) 2008年5月 37 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識(shí) 培養(yǎng)基的概念 培養(yǎng)基是人工配制的生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 即用人工的方法將多種物質(zhì)按各種微生物生長(zhǎng)繁殖的需要配成的一種混合營(yíng)養(yǎng)物 培養(yǎng)基的主要成份 培養(yǎng)基的分類 2008年5月 38 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識(shí) 培養(yǎng)基制備 常用儀器的準(zhǔn)備 2008年5月 39 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識(shí) 培養(yǎng)基制備 溶化 校正酸堿度 熱過濾 分裝 滅菌 1 先將卵磷脂加入少量蒸餾水低溫加熱溶解溶 再加吐溫80混勻 加入瓊脂 靜置15分鐘 高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH可比最終pH值調(diào)高0 2左右 滅菌后基本合適 營(yíng)養(yǎng)瓊脂 調(diào)PH7 1 7 4 營(yíng)養(yǎng)瓊脂一般采用121 103 42kPa蒸汽滅菌30min 液體培養(yǎng)基用濾紙過濾 固體培養(yǎng)基用紗布?jí)K中夾薄層脫脂棉過濾 2008年5月 40 細(xì)菌計(jì)數(shù) 基本概念 細(xì)菌數(shù)測(cè)定是微生物的定量檢查 對(duì)非規(guī)定滅菌產(chǎn)品中污染的活菌數(shù)量進(jìn)行測(cè)定 通常以每克或每毫升供試品作為計(jì)量單位 限制條件 平板菌落計(jì)數(shù)法的特點(diǎn)是先使細(xì)胞分散 定位 增生可見菌落后計(jì)數(shù) 它是一種有條件的計(jì)數(shù)法 其限制條件大致如下 以菌落數(shù)為基礎(chǔ) CFU colonyformingunits 一個(gè)菌落就是一個(gè)細(xì)菌形成單位 它可以由一個(gè)也可以由多個(gè)菌細(xì)胞形成 受特定培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件限制 有繁殖能力的菌細(xì)胞才能認(rèn)定 活菌 2008年5月 41 初始污染菌檢測(cè) 初始污染菌檢測(cè) 目前使用標(biāo)準(zhǔn)GB15980 一次性使用醫(yī)療衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 本標(biāo)規(guī)定了一次性使用醫(yī)療用品滅菌 消毒前 后的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 本標(biāo)準(zhǔn)對(duì)一次性使用醫(yī)療用品 包括滅菌的和消毒的一次性使用醫(yī)療用品 生產(chǎn) 裝配 包裝車間等生產(chǎn)過程和生產(chǎn)工人手提出衛(wèi)生的質(zhì)量控制 引用標(biāo)準(zhǔn) GB7918 2 GB8368 GB8369 中華人民共和國(guó)藥典 2008年5月 42 初始污染菌檢測(cè) 指標(biāo)含義 測(cè)定檢品細(xì)菌總數(shù)可用來(lái)判明檢品細(xì)菌污染的程度 以及生產(chǎn)單位所用的原料 工具設(shè)備 工藝流程 生產(chǎn)人員的衛(wèi)生狀況 是對(duì)檢品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)的綜合依據(jù) 方法主要步驟 采樣 供試液制備 培養(yǎng) 菌落計(jì)數(shù) 2008年5月 43 初始污染菌檢測(cè) 采樣方法 供試液制備 供試品是敷料 可以破壞性類可用無(wú)菌手續(xù)稱取10g 放入100ml滅菌生理鹽水中充分振蕩后取樣 作為1 10的供試液 2 供試品是液體取10ml加至100ml滅菌生理鹽水中充分振蕩后取樣 作為1 10的供試液 3 對(duì)供試品不能采用破壞性取樣可用浸有無(wú)菌生理鹽水拭子涂抹采樣 被采表面積為100cm2 加入滅菌生理鹽水100ml 作為1 10的供試液 4 可用破壞性方法取樣供試品 參照中華人民共和國(guó)藥典2005年規(guī)定進(jìn)行 5 采樣數(shù)量 各類產(chǎn)品每批隨機(jī)抽取10件樣品 6 檢驗(yàn)方法 將每樣取5份平行樣 參照GB7918 2規(guī)定進(jìn)行 2008年5月 44 初始污染菌檢測(cè) 7 結(jié)果計(jì)算公式 平均菌落數(shù) 稀釋倍數(shù)菌數(shù)菌數(shù) 每件次 或g 件次或重量 g 注意事項(xiàng) 供試品的取樣必須在萬(wàn)級(jí)環(huán)境中100級(jí)凈化條件下 無(wú)菌操作 防止污染 應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作 同時(shí)消除抑菌成份的干擾 2008年5月 45 初始污染菌檢測(cè) 供試液制備 推薦的制備方法 樣品制備 供試液制備 梯度稀釋 加樣 用滅菌剪刀將紗布剪成小塊 稱取10g 移入100ml稀釋劑中 保溫于45 水浴中5 10min 不時(shí)振搖 作為1 10供試液 供試液10倍遞減稀釋 盡量避免絲線等雜物的混入 1 每個(gè)稀釋級(jí)各吸取1ml至每個(gè)滅菌平皿 每個(gè)稀釋級(jí)注2個(gè)平皿 2 經(jīng)滅菌完畢的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻至45 50 時(shí) 傾注上述各個(gè)平皿15ml 另傾注一個(gè)不加樣品滅菌空平皿作空白對(duì)照 以順時(shí)針或逆時(shí)針方向快速轉(zhuǎn)動(dòng)平皿 使供試液與培養(yǎng)基充分混勻 紗布模擬 2008年5月 46 初始污染菌檢測(cè) 梯度稀釋 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 供試液 9mlNacl 9mlNacl 1 10 1 100 1 1000 2008年5月 47 2008年5月 48 初始污染菌檢測(cè) 培養(yǎng) 將已經(jīng)凝固的平板倒置于37 培養(yǎng)箱中 一般培養(yǎng)48 2h 菌落計(jì)數(shù) 計(jì)數(shù)方法 將平板置菌落計(jì)數(shù)器或從平板的背面直接以肉眼用標(biāo)記筆點(diǎn)計(jì) 以投射光襯以暗色背景 仔細(xì)觀察 計(jì)數(shù) 必要時(shí)可以借助于放大鏡 菌落計(jì)數(shù)器 菌落特征 形態(tài)特征 常為白色 灰白色或灰色 亦有淡褐色 淡黃色 如果培養(yǎng)基中加入0 1 TTC試劑 菌落為紅色 邊緣整齊或不整齊 表面有光滑 粗糙 皺褶 突起或扁平 大小差異很大 2008年5月 49 初始污染菌檢測(cè) 菌落計(jì)數(shù) 菌落計(jì)數(shù)基本規(guī)則 1 選取平均菌落數(shù)在30 300之間的稀釋級(jí)作為報(bào)告菌落數(shù)測(cè)定范圍 如只有1個(gè)稀釋級(jí)平均菌落數(shù)在30 300之間 則將稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告 2 如有兩個(gè)相鄰稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)在30 300之間 則先計(jì)算兩稀釋級(jí)菌落數(shù)的比值 高稀釋級(jí)的平均平板菌落數(shù) 稀釋倍數(shù)比值 低稀釋級(jí)的平均平板菌落數(shù) 稀釋倍數(shù)當(dāng)比值 2時(shí) 則以2個(gè)稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均值報(bào)告 當(dāng)比值 2時(shí) 則以低稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告 3 如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均在300以上 則按最高平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告 如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均在30以下 則按最低平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告 2008年5月 50 初始污染菌檢測(cè) 菌落計(jì)數(shù) 菌落計(jì)數(shù)基本規(guī)則 4 如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均不在30 300之間 則以最接近30或300的稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告 5 如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均無(wú)菌落生長(zhǎng)或最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)小于1時(shí) 應(yīng)報(bào)告菌數(shù)為 10個(gè) g或ml 6 如有3個(gè)稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均在30 300之間 則以后2級(jí)計(jì)算級(jí)間比值報(bào)告 7 菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告 菌落數(shù)在10以內(nèi)時(shí) 按實(shí)有數(shù)值報(bào)告 大于100時(shí) 采用二位有效數(shù)字 在兩位有效數(shù)值后面 應(yīng)以四舍五入法計(jì)算 在報(bào)告菌落數(shù)為 不可計(jì) 時(shí) 應(yīng)表明樣品的稀釋度 2008年5月 51 初始污染菌檢測(cè) 菌落計(jì)數(shù) 細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果及報(bào)告方法 2008年5月 52 控制菌的檢查 參照 藥典 2005版 GB15979 20021 大腸埃希菌BL增菌培養(yǎng) MUG培養(yǎng) 靛基質(zhì)試驗(yàn)具體檢查見表1 結(jié)果判斷MUG陽(yáng)性 靛基質(zhì)陰性 或MUG陰性 靛基質(zhì)陽(yáng)性 則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上 培養(yǎng)18 24小時(shí) 若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng) 或生長(zhǎng)的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征不符 判供試品未檢出大腸桿菌 若有可疑菌落 進(jìn)行IMVic 2008年5月 53 表3大腸埃希菌菌落形態(tài)特征 2008年5月 54 表1大腸桿菌的檢查 2008年5月 55 表2結(jié)果判斷 2008年5月 56 2 金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng) 平板 高鹽 劃線培養(yǎng) 觀察 血漿凝固酶試驗(yàn)具體檢查方法見表3 2008年5月 57 表3金黃色葡萄球菌的檢查 2008年5月 58 表4金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征 平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落不同于表4所列特征 判供試品未檢出金黃色葡萄球菌 平板上生長(zhǎng)的菌落與表4所列的菌落特征相符或疑似 應(yīng)挑選2 3個(gè)菌落 分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上