隱球菌腦膜炎的實驗室檢測.doc

隱球菌腦膜炎的實驗室檢測首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院 王慧珠一、新型隱球菌的特點 新型隱球菌廣泛分布于自然界中，鴿子糞是主要傳染源。圓形、卵圓形，菌體為寬厚的莢膜包裹；不形成菌絲和孢子；出芽生殖。分 A 、 B 、 C 、 D 四個血清型。 A 型最多見。 致病菌屬包括 17 個種和 8 個變種，主要是新型隱球菌新生變種和格特變種，已報道引起人類疾病的還有淺黃隱球菌、淺白隱球菌和羅倫隱球菌，但是很少見。 二、致病性 新型隱球菌為條件致病菌，免疫功能低下者為高發(fā)人群，但也可發(fā)生在免疫功能正常人。白血病、惡性腫瘤、艾滋病、 SLE 、尿毒癥患者。長期廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑使用者更易感染。 隱球菌侵入肺部后，局部病變進展緩慢，病變輕微，常無臨床癥狀，但有 20% 以上的病例可由此經(jīng)血進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導致隱球菌性腦膜炎的發(fā)生。 三、臨床表現(xiàn) （一）起病緩慢、可呈亞急性，潛伏期 2-4 周。 （二）腦膜炎的表現(xiàn)：意識障礙，頭痛、發(fā)熱（以不規(guī)則熱多見） 。 （三）顱內(nèi)壓的表現(xiàn)，可有顱神經(jīng)損害。 （四）未經(jīng)治療病情逐漸惡化 （五）血常規(guī)正常 （六）腰穿：壓力增高明顯，腦脊液外觀透明或微混，白細胞輕中度增多（ 40-400/ul) ，以淋巴細胞為主。蛋白輕度升高，糖減低，氯化物輕中度減低。 四、其他部位隱球菌病 （一）肺隱球菌病 （二）皮膚隱球菌病 （三）骨隱球菌病 五、新型隱球菌對 CNS（中樞神經(jīng)系統(tǒng)） 具有親和力？ 機理可能和腦脊液中有隱球菌所需要的天門冬酰胺、肌酸內(nèi)酰胺等刺激真菌生長的營養(yǎng)因子有關。 六、特殊宿主的隱球菌病 隱球菌病是 AIDS 病人最重要的也是致命的真菌感染并發(fā)癥，在 AIDS 人群中，發(fā)病率可達 6% 10% ，而在中部非洲地區(qū)可高達 15% 30% ，這可能與發(fā)達國家對于 AIDS 合并機會感染控制水平有關，即早發(fā)現(xiàn)、早治療。 AIDS 病人患隱球菌病的臨床表現(xiàn)與其他免疫受損的病人相似，然而，感染部位常含有更多的菌體， 80% 以上的病人在做出診斷時已有腦膜炎或腦膜腦炎，且病變更廣泛。 AIDS 患者并發(fā)隱球菌病很少能治愈，常見持續(xù)感染和復發(fā)，有文獻報道 10%25% 的病人死于治療期間。 七、北京地壇醫(yī)院情況 我院 2009 年 1 月至 2011 年 12 月共確診 405 例 AIDS 患者，其中隱球菌腦炎患者為 53 例，感染率 13.1% 。 其中墨汁染色陽性 25 例（ 47.2% ），真菌培養(yǎng)陽性 23 例（ 43.4% ），抗原檢測陽性 53 例（ 100% ）。 通過單一或聯(lián)合治療，治愈 1 例（ 1.9% ），好轉(zhuǎn) 40 例（ 75.5% ），未愈 6 例（ 11.3% ），死亡 6 例（ 11.3% ）。 八、診斷 對于臨床上出現(xiàn) CNS 感染的癥狀、體征、腦脊液壓力明顯增高及糖含量明顯下降的患者，應高度警惕隱球菌腦膜炎的可能，尤其對具有免疫功能底下者、有養(yǎng)鴿或有鴿糞接觸史者，更應高度懷疑。實驗室檢查具有重要的診斷價值，包含涂片鏡檢、培養(yǎng)、隱球菌特異性抗原檢測和組織病理檢查發(fā)現(xiàn)隱球菌。 九、治療 隱球菌病的治療包括真菌藥物治療、對癥治療、免疫制劑治療、手術治療及原發(fā)病的治療等。 抗真菌治療：兩性霉素 B(0.5-0.8mg/kg/d) ，由 1mg/d 起漸加量，加入 500ml 葡萄糖液中避光靜脈緩慢滴 6h 以上；或 0.5-1mg 腦室引流管緩慢抽吸。氟胞嘧啶（ 25mg/kg ， q6h) 。氟康唑（ 200-400mg/d)/ 伊曲康唑（ 100mg bid) 。 十、治愈標準 連續(xù) 3 次 CSF 涂片鏡檢陰性或抗原 陰性 十一、實驗室檢查 （一） CSF 的涂片 革蘭氏染色 ：將臨床送檢的 CSF 標本 1500g 離心 5 分鐘，將沉淀物進行涂片、墨汁染色及真菌培養(yǎng)，用上清夜做新型隱球菌抗原的檢測。 一定要離心，容器要選擇能離心的無菌塑料試管，避免二次污染。 ppt14 的圖片顯示的是隱球菌革蘭氏染色鏡下形態(tài)，可見黑色的孢子，以及夾膜抗原。 （二） CSF 的 墨汁染色 1. 方法 （ 1 ）用離心后的沉淀物進行墨汁染色。 （ 2 ）墨汁與腦脊液比例一定要合適，一般選 1 ： 2 的比例。 （ 3 ）選用優(yōu)質(zhì)墨汁。 重視墨汁染色，墨汁染色陽性可以直接向臨床報告檢測到新型隱球菌。 2. CSF 的 墨汁染色隱球菌的形態(tài) 取可疑標本置玻片上，加 1 滴墨汁混勻后加蓋片鏡檢。墨汁染色檢測隱球菌對于早期診斷隱球菌性腦炎十分重要，但墨汁染色檢測隱球菌鏡下形態(tài)要注意與單核細胞的區(qū)別，隱球菌本身并不被染上墨汁，但在黑色背景下為 5-20m ，圓或卵圓形，有寬闊透明的莢膜，菌體周邊顯現(xiàn)為強的折光形成一個折光環(huán)，中心部分為折光性較強的顆粒狀或條狀物質(zhì)，也能見到單芽孢子，出芽孢子的頸粗細不一，當母子細胞尚未完全分離時同樣可見莢膜溝通，無假菌絲。 ppt17 的圖片顯示的是墨汁染色高倍鏡下隱球菌的形態(tài)，可見外圈為透明的莢膜，中間是核，實際工作中，在顯微鏡下會看到核仁。 ppt18 的圖片顯示的是將 ppt17 圖片中隱球菌的形態(tài)放大后的效果，可以看得更清晰，外圈是寬厚的莢膜，中間是核。 ppt19 的圖片顯示的是墨汁染色隱球菌和母孢子沒有完全分離時的形態(tài)。 ppt20 的圖片顯示的是隱球菌正以出芽的方式進行生殖。 ppt21 的圖片顯示的是墨汁染色中，墨汁和腦脊液的比例不合適，墨汁加的太多，造成莢膜不容易辨別。 3. 菌體計數(shù) 對中樞系統(tǒng)隱球菌患者，腦脊液菌體計數(shù)是判斷預后療效的重要指標。用血細胞計數(shù)板計數(shù)，在低倍鏡下觀察，按白細胞計數(shù)法計數(shù)。 （三） CSF 的真菌培養(yǎng)、鑒定、及藥敏試驗 1. 真菌培養(yǎng)及鑒定 （ 1 ）培養(yǎng)基內(nèi)可加氯霉素，但不可加放線菌酮，因后者抑制本菌生長。 （ 2 ）新型隱球菌 的 菌落特征 ： SDA25 奶油色酵母菌落，有時黃色或帶粉色。 （ 3 ） 顯微鏡特征 : SDA25 球菌或橢圓形酵母菌細胞，第一代培養(yǎng)物有時可見小的莢膜。繼代培養(yǎng)物不見莢膜。 （ 4 ） 生理生化檢測：用沙氏培養(yǎng)基上分離出的純菌落制成 0.5 個麥氏單位懸液，充填 API20cAUX 真菌鑒定條（購自生物梅里埃公司），置 35 培養(yǎng) 24-72h 后進行判度。 2. 藥敏試驗 用 ATB FUNGUS3 真菌藥敏試劑條（購自生物梅里埃公司）進行藥敏測定 。 （四） 隱球菌抗原的檢測 1. 試劑 （ 1 ）進口試劑 大部分是用美國 ImmunoMycologics 有限公司生產(chǎn)的隱球菌抗原乳膠檢測試劑盒進行檢測。 該試劑在國內(nèi)還沒有拿到注冊證，只能用于科研，并且試劑十分昂貴，凝集的結(jié)果要注意判讀。 （ 2 ）國產(chǎn)試劑 已有國內(nèi)公司拿到注冊證的試劑。 2. 試驗原理 用抗隱球菌抗體包被的乳膠顆粒和腦脊液中存在的隱球菌夾膜多糖抗原的標本反應，發(fā)生凝集，對血清標本使用裂解酶處理，減少非特異性干擾。標本類型包括 CSF 、血清（肺隱球菌病及其它隱球菌?。?、支氣管盥洗液等。 3. 臨床意義 新型隱球菌抗原的檢測非常重要，對于早期診斷隱球菌腦炎有重要價值，臨床上一部分病人在就診初期未能及時得到病原學證據(jù)，成為本病容易漏診的最常見原因。目前國外已用乳膠凝集試驗代替了一般的墨汁染色，使診斷的敏感性和特異性明顯提高，可以達到 95% 以上。 隱球菌感染的金標準是真菌培養(yǎng)，但敏感性不高，并且隱球菌經(jīng)過抗生素治療后很難再培養(yǎng)出來，墨汁染色雖然方法簡便，但受菌量多少影響較大，并且治療后菌體出現(xiàn)退行變，不易辨別。 隱球菌抗原的檢測不受送檢標本中菌體數(shù)量的限制，亦不受藥物治療的影響，可作為活性感染的證據(jù)。而新型隱球菌抗原滴度的改變對于臨床治療療效的觀察非常重要。 （五） 其它標本隱球菌的檢測 1. 支氣管灌洗液 用 50ml 離心管對標本進行離心，用沉淀物進行涂片、墨汁染色、真菌培養(yǎng)。 2. 血培養(yǎng) （ 1 ）抽取 10ml 血液放到需氧血培養(yǎng)瓶中 （ 2 ）血培養(yǎng)瓶報警后的處理 血培養(yǎng)瓶如報警后，抽取培養(yǎng)物進行 涂片，注意鏡下細菌形態(tài)。 ppt31 的圖片顯示的是隱球菌血培養(yǎng)涂片形態(tài)，可見許多真菌孢子黏在一起。 ppt32 的圖片顯示的也是隱球菌血培養(yǎng)涂片形態(tài)，可見許多真菌孢子，高度懷疑是隱球菌感染。 抽取血培養(yǎng)液進行墨汁染色，這樣做非常重要，可以立刻向臨床報告 , 能提前 4-5 天的時間報告。但要注意用血培養(yǎng)進行墨汁染色時，沒有用 CSF 進行墨汁染色時的鏡下形態(tài)好看，莢膜層要小一些，要注意觀察。 ppt34 ppt35 的圖片顯示的是血培養(yǎng)的墨汁染色形態(tài)，可見隱球菌的莢膜和核。 ppt36 的圖片顯示的是墨汁染色的比較，左側(cè)是用腦脊液做墨汁染色，可見隱球菌的莢膜非常寬大，右側(cè)是用血培養(yǎng)做墨汁染色，可見莢膜較窄。 （六） 組織病理檢測 有的病變主要由大量繁殖的隱球菌及其引起的炎性細胞浸潤構成。由于隱球菌的莢膜物質(zhì)有抑制中性粒細胞趨化作用，故浸潤的炎性細胞是單核細胞、淋巴細胞和漿細胞。損害顯示膠樣液化，囊腔內(nèi)有多量隱球菌。有的病變則表現(xiàn)為肉芽的形成，主要由單核細胞、上皮細胞和多核巨細胞等構成。此時隱球菌數(shù)目較少，且大部分被吞噬細胞吞入胞漿內(nèi)。在新鮮的病灶內(nèi)，菌體大小不等，小的居多，且容易見到單芽生孢子。在其他病灶內(nèi)，菌體較大，很少見到芽生狀態(tài)。