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生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義天津醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系2005年實(shí)驗(yàn)一 自抗凝血中提取哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、了解核酸的基本特性。2、掌握DNA提取和鑒定的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理核酸的分離與提取是分子生物學(xué)研究中很重要的基本技術(shù),核酸樣品的質(zhì)量可能直接關(guān)系到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成敗。核酸包括DNA、RNA兩種分子,在真核細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)相結(jié)合的狀態(tài)存在(DNA與組蛋白形成核小體,再折疊纏繞成染色體),真核生物基因組DNA為雙鏈線性分子,存在于細(xì)胞核內(nèi)?;蚪MDNA的提取需經(jīng)過(guò)DNA的釋放(破膜)、DNA與蛋白質(zhì)的分離,DNA的沉淀等過(guò)程。分離純化核酸的總原則:1、 保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的(核苷酸序列)的完整性,全部的遺傳信息均儲(chǔ)存在一級(jí)結(jié)構(gòu)中。2、 排除其它分子的污染。a) 對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子。b) 生物大分子:蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)。c) 其它核酸分子:RNA.三、實(shí)驗(yàn)試劑 1、TKM緩沖液10 mmol/L Tris-HCl pH 7.6 (Tris 三羥甲基氨基甲烷)10 mmol/L KCl2 mmol/L EDTA4 mmol/L MgCl2 2、TE緩沖液10 mmol/L Tris-HCl1 mmol/L EDTA pH 8.0 3、10SDS 4、飽和氯化鈉四、實(shí)驗(yàn)步驟1、取0.5ml EDTA抗凝的全血于清潔的1.5ml Eppendorf離心管中。2、加入0.5ml TKM緩沖液,13l Triton X-100(終濃度為1.2),顛倒混勻。在臺(tái)式離心機(jī)上離心,5,000rpm10分鐘。(低滲破紅細(xì)胞膜)。3、 傾去上清液,在離心管中加入1.0ml TKM緩沖液,混勻后離心,5,000rpm10分鐘,重復(fù)步驟3兩次。(清洗)4、于沉淀中加入200l TKM緩沖液和15l 10SDS(終濃度為0.7),混勻后于55保溫20分鐘。(破白細(xì)胞膜)注:此步中可加入少量蛋白酶K。5、于離心管中加入75l 飽和(6mol/L)氯化鈉溶液(終濃度為1.2 mol/L),混勻。13,000 rpm離心5分鐘。(沉淀蛋白質(zhì))6、小心吸取上清液約240l轉(zhuǎn)移至另一潔凈的1.5ml Eppendorf離心管中。加入750l 95的冷乙醇(終濃度為71),80放置30min。離心1,5000 rpm20分鐘,最好在4。(沉淀DNA)7、小心吸去上清,加入1.0 ml 75的冷乙醇,洗滌沉淀,相同條件再離心一次。(脫鹽)8、棄去上清,用Parafilm膜封口,在膜上扎孔后置37溫箱中干燥,以去除殘余的乙醇。9、將干燥后的DNA溶于50l TE緩沖液中,置20冰箱中備用;也可將干品置20冰箱中備用,使用前用30l重蒸水溶解。10、 OD260/OD280的測(cè)定。五、注意事項(xiàng)為保證核酸分離的完整性和純度,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意以下事宜:1、 量簡(jiǎn)化操作步驟,縮短提取過(guò)程,以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞。2、 少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解,避免過(guò)酸、過(guò)堿對(duì)磷酸二酯鍵的破壞。3、 減少物理因素的核酸的降解,如機(jī)械剪切力(強(qiáng)力高速的震蕩)、高溫(破壞化學(xué)鍵,常規(guī)操作溫度為04,可降低核酸酶的活性,減少核酸的生物降解)。4、 防止核酸的生物降解,核酸酶消化磷酸二酯鍵,破壞一級(jí)結(jié)構(gòu)。其中DNA酶,需要二價(jià)金屬離子的激活(Mg2),使用二價(jià)金屬離子鰲合劑EDTA,基本上可抑制DNA酶的活性。實(shí)驗(yàn)二 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及DNA的瓊脂糖凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握PCR反應(yīng)的原理,學(xué)習(xí)PCR的方法,熟悉PCR擴(kuò)增儀的使用。2、了解PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化及引物設(shè)計(jì)。3、掌握瓊脂糖凝膠電泳的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)是Karry Mullis于1985年創(chuàng)立的一種通過(guò)體外酶促擴(kuò)增獲取大量特異DNA片段的方法。PCR技術(shù)是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸(dNTP)存在的條件下,依賴(lài)于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng),模擬天然DNA的復(fù)制機(jī)制。PCR的特異性取決于引物和模板的特異性結(jié)合。PCR的全過(guò)程是以變性、退火、延伸三步反應(yīng)為一周期,通過(guò)若干輪的循環(huán)完成的,其中每一步的轉(zhuǎn)換是通過(guò)改變反應(yīng)溫度來(lái)控制。1、變性(denaturation) 模板DNA在95左右的高溫條件下雙鏈間的氫鍵斷裂,雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA并游離于反應(yīng)液中。2、退火(annealing) 熱變性后將溫度降低,人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物分別與模板DNA擴(kuò)增區(qū)域的兩端準(zhǔn)確配對(duì)結(jié)合,形成局部雜交鏈。3、延伸(extension)在四種dNTP底物及Mg2存在的條件下,DNA聚合酶在最適作用溫度下可將脫氧單核苷酸從引物3端摻入,并沿著模板以新合成的DNA單鏈的53方向延伸合成新DNA,以上三個(gè)步驟為一循環(huán),每一循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一循環(huán)的模板。如圖所示,理論上PCR合成的數(shù)量經(jīng)過(guò)每輪循環(huán)都將增加一倍,應(yīng)按2n的指數(shù)方式遞增。PCR經(jīng)30輪循環(huán)后,PCR擴(kuò)增量應(yīng)達(dá)到230個(gè)拷貝,約109個(gè)拷貝,但由于DNA聚合酶的質(zhì)量、待擴(kuò)增片斷的序列及反應(yīng)體系的條件等諸多因素的影響,實(shí)際擴(kuò)增效率比預(yù)期的要低,一般可達(dá)106107個(gè)拷貝。三、實(shí)驗(yàn)流程1、目的基因的PCR擴(kuò)增2、PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)四、實(shí)驗(yàn)試劑1、Taq DNA聚合酶:5 U/l。2、dNTP:4種dNTP按等比例混合,每種2.5mmol/L。3、MgCl2:,與緩沖液混在一起,無(wú)需單獨(dú)配置。4、PCR引物:稀釋為一定的濃度,擴(kuò)增時(shí)用量為12l反應(yīng)體積。5、緩沖液:10PCR緩沖液濃度如下,使用時(shí)按比例稀釋?zhuān)?50500mmol/L KCl100500mmol/L Tris-Cl (pH 8.4)0.5% Tween-201mg/L BSA6、瓊脂糖凝膠:根據(jù)待分離樣品分子質(zhì)量的大小選擇不同濃度的凝膠。7、溴化乙錠(10mg/ml)在20ml雙蒸水中溶解0.2g溴化乙錠,混勻后4避光保存,溴化乙錠是一種誘變劑,操作時(shí)應(yīng)注意安全。8、上樣Buffer: 0.25的溴酚藍(lán),使用時(shí)需加入一定濃度的甘油或蔗糖聚蔗糖,以使樣品沉入加樣槽。五、實(shí)驗(yàn)步驟1、PCR反應(yīng)體系總體積25l(10buffer 2.5l,Mg2+ 1.5l,ddH2O 13.5l,primer A 2l,primer B 2l),模板DNA 1l,Taq酶1.5l)。 2、循環(huán)參數(shù)設(shè)定(1)95 1min 62 1min 72 1min 72延伸7min(2)反應(yīng)體系終止后。2瓊脂糖電泳(溴化乙錠染色)a、用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈,放在水平桌面上,并架好梳子。b、根據(jù)核酸分子質(zhì)量的大小配置不同濃度的瓊脂糖凝膠,一般200400bp的DNA片段,可配置1.21.7濃度的瓊脂糖用于電泳。c、在錐形瓶中配置0.5TAE電泳緩沖液100ml,稱(chēng)取一定量的瓊脂糖粉放入沸水浴中或微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻至60(需要時(shí)可加入溴化乙錠),倒入電泳槽中,待凝固。d、向電泳槽中倒入配置好的凝膠,其量以沒(méi)過(guò)膠面2mm為宜,小心移去梳子。如樣品孔內(nèi)有氣泡,應(yīng)設(shè)法除去。e、 在DNA樣品中加入0.2體積的上樣緩沖液,混勻后,加入樣品孔內(nèi)。f、接通電源,一般紅色為正極,黑色為負(fù)極,DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)(靠近加樣孔的一端為負(fù))。電壓為15V/cm(長(zhǎng)度以?xún)蓚€(gè)正極之間的距離計(jì)算)。g、根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置,判斷是否終止電泳。一般200400bp的PCR產(chǎn)物50V電壓,電泳2040分鐘即可。h、溴化乙錠染色后,紫外燈上觀察電泳帶的及其位置,并與標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量核酸比較擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。實(shí)驗(yàn)三 質(zhì)粒的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)質(zhì)粒DNA的基本知識(shí)。2、掌握質(zhì)粒的小量快速提取法。二、實(shí)驗(yàn)原理 質(zhì)粒(plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小在1200kb之間,具有雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中。質(zhì)粒具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力,能使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù),表達(dá)它攜帶的遺傳信息。質(zhì)??瑟?dú)立游離在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),也可整合到細(xì)菌染色體中,它離開(kāi)宿主細(xì)胞就不能存活,它所控制的許多生物學(xué)功能也賦予宿主細(xì)胞某些特殊的表型。所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟:培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增;收集和裂解細(xì)菌;分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁,十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, SDS)也可使細(xì)胞壁裂解,經(jīng)溶菌酶和陰離子去污劑(SDS)處理后,細(xì)菌DNA附著在細(xì)胞壁碎片上,離心時(shí)易被沉淀出來(lái),而質(zhì)粒DNA則留在上清液中。用乙醇沉淀,即可得到質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA分子量一般在106107道爾頓范圍內(nèi)。在細(xì)胞內(nèi),共價(jià)閉環(huán)DNA(covalently closed circular DNA,簡(jiǎn)稱(chēng)cccDNA)常以超螺旋形式存在。若兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,這種松弛型的分子叫作開(kāi)環(huán)DNA(open circular DNA, 簡(jiǎn)稱(chēng)ocDNA)。在電泳時(shí),同一質(zhì)粒如以cccDNA形式存在,它比其開(kāi)環(huán)和線狀DNA的泳動(dòng)速度都快,因此在本實(shí)驗(yàn)中,質(zhì)粒DNA在電泳凝膠中可能呈現(xiàn)3條區(qū)帶。三、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑1、儀器與耗材微量移液器、微量離心管(又稱(chēng)Eppendorf管)、常用玻璃器皿、臺(tái)式高速離心機(jī)、分光光度計(jì)、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)等。2、材料大腸桿菌DH53、試劑(1)pH8.0 G.E.T 緩沖液(50mmol/L葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl)。 (2)pH 4.8乙酸鉀溶液(60ml5mol/L KAc,11.5ml冰乙酸,28.5ml H2O)(3)酚/氯仿(11,V/V):酚需在160重蒸,加入抗氧化劑8-羥基喹啉,使其濃度為0.1%,并用Tris-HCl緩沖液平衡兩次。氯仿中加入異戊醇,氯仿/異戊醇(241,V/V)。(4)pH 8.0 TE緩沖液:10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,其中含有RNA酶(RNase)20g/ml。(5)TAE緩沖液:稱(chēng)取Tris10.88g、醋酸5.52g和EDTA 0.72g,用蒸餾水溶解后,定容至200ml,用前稀釋10倍。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、細(xì)菌的培養(yǎng)、質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增和收集:(1)挑取瓊脂平板上的單一菌落,接種至20ml LB液體培養(yǎng)液中,37,300轉(zhuǎn)/分振搖過(guò)夜。(2)取1ml上述菌液于1.5ml Eppendorf管中,6000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘,棄上清并重復(fù)1次,共收集2ml菌液。(3)倒掉菌液上淸,將Eppendorf管倒置于濾紙上空干,同時(shí)配置溶液。2、細(xì)菌菌體的裂解和初步純化:(1)在上述Eppendorf管中加入冰浴后的溶液100l,劇烈振蕩混勻。(2)加入室溫放置的溶液200l,顛倒混勻,此時(shí)溶液會(huì)變澄清,冰上放置3分鐘。(3)加入冰浴后的溶液150l,顛倒混勻,此時(shí)溶液中會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘,將上淸移至另一干凈1.5ml Eppendorf管中(約有400l)。(4)每管加等體積的“酚:氯仿”(下層有機(jī)相),劇烈震蕩混勻后12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘,將上淸液移至另一干凈1.5ml Eppendorf管中(約300l)。(5)每管加入2.5倍體積95乙醇(600l)室溫靜置30分鐘后12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。(6)倒掉上淸后將管底倒置于高壓過(guò)的濾紙上控干。(7)加入50l TE(含無(wú)DNA酶的RNA酶20l/ml)溶解質(zhì)粒DNA,短暫震蕩5分鐘后,可進(jìn)行內(nèi)切酶實(shí)驗(yàn)或20存儲(chǔ)。3、電泳鑒定空質(zhì)粒載體大小位置1瓊脂糖電泳鑒定質(zhì)粒大小位置,觀察沒(méi)有經(jīng)過(guò)酶切的質(zhì)粒是否有松弛環(huán)狀質(zhì)粒DNA、線性質(zhì)粒DNA及超螺旋狀態(tài)質(zhì)粒DNA上下三條帶出現(xiàn)。附:DNA的瓊脂糖凝膠電泳:1、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的基本方法。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度離心法)所無(wú)法分離的DNA片段。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。 瓊脂糖可以制成各種形狀、大小和孔隙度的凝膠。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。瓊脂糖主要在DNA電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)中,中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽(yáng)極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定: (1)DNA的分子大小: 線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移越慢。 (2)瓊脂糖濃度一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍瓊脂糖濃度線性DNA分子的分離范圍0.30.60.70.91.21.512.05601200.8100.570.960.230.12(3)DNA分子的構(gòu)象 分子量相同,構(gòu)象不同的DNA分子在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的,超螺旋DNA移動(dòng)最快,而線狀雙鏈DNA移動(dòng)最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶,難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起,還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí),可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收,用同一種限制性?xún)?nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。 (4)電源電壓 在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加,不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng),片段越大,因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大,所加電壓不得超過(guò)5v/cm。 (5)嵌入染料的存在 熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA,使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15。 (6)離子強(qiáng)度影響 電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒(méi)有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動(dòng),在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。 對(duì)于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸,TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲(chǔ)于室溫。 (7)制備步驟a、瓊脂糖凝膠的制備:稱(chēng)取0.6g瓊脂糖,置于三角瓶中,加入50 ml TAE緩沖液,經(jīng)沸水浴加熱全部融化后,取出搖勻,此為1.2%的瓊脂糖凝膠。b、膠板的制備:取橡皮膏(寬約1cm)將有機(jī)玻璃板的邊緣封好,水平放置,將樣品槽板垂直立在玻璃板表面。將冷卻至65左右的瓊脂糖凝膠液,小心倒入凝膠液,使膠液緩慢展開(kāi),直到在整個(gè)玻璃板表面形成均勻的膠層,室溫下靜置30 min,待凝固完全后,輕輕拔出樣品槽模板,在膠板上即形成相互隔開(kāi)的樣品槽。用滴管將樣品槽內(nèi)注滿(mǎn)TBE緩沖液以防止干裂,制備好膠板后立即取下橡皮膏,將膠板放在電泳槽中使用。c、加樣:用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內(nèi)。每次加完一個(gè)樣品,要用蒸餾水反復(fù)洗凈微量加樣器,以防止相互污染。d、加完樣品后的凝膠板,立即通電。樣品進(jìn)膠前,應(yīng)使電流控制在20mA,樣品進(jìn)膠后電壓控制在6080V,電流為4050 mA。當(dāng)指示前沿移動(dòng)至距離膠板12cm處,停止電泳。e、將電泳后的膠板在EB染色液中進(jìn)行染色以觀察在瓊脂糖凝膠中的DNA條帶。實(shí)驗(yàn)四 限制性核酸內(nèi)切酶分析及DNA的回收一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 了解限制型核酸內(nèi)切酶的性質(zhì)及酶切反應(yīng)的條件。2、 掌握DNA回收的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1、限制性?xún)?nèi)切酶的反應(yīng)條件 a、緩沖系統(tǒng):多數(shù)生物技術(shù)公司的產(chǎn)品目錄中均提供了關(guān)于何種酶適合于何種緩沖液的資料。為了簡(jiǎn)化操作,有人提出了“通用緩沖液”的反應(yīng)體系,組成如下:Tris-HCl 50 mmol/L pH8.0MgCl2 10 mmol/L二硫蘇糖醇(DDT) 1 mmol/L牛血清白蛋白 100g/mlNaCl 0g/L (低鹽緩沖液)NaCl 50g/L (中鹽緩沖液)NaCl 100g/L (高鹽緩沖液)b、反應(yīng)體積:一般不少于20l,過(guò)少的反應(yīng)體積在加入各種組分時(shí),容易產(chǎn)生誤差。商品化的限制性?xún)?nèi)切酶溶液中含有50(V/V)的甘油作為防凍劑,酶切體系中酶的用量不宜超過(guò)總體積的1/10,因?yàn)楦视秃咳舫^(guò)5,則會(huì)抑制內(nèi)切酶的活性。 c、反應(yīng)溫度:大多數(shù)常用的反應(yīng)溫度為37,相當(dāng)一部分酶在反應(yīng)溫度升高時(shí)不穩(wěn)定。d、反應(yīng)時(shí)間:由于商品形式提供的限制性?xún)?nèi)切酶只是相對(duì)純的制劑,并不是絕對(duì)不含其它雜酶,若反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),有可能出現(xiàn)雜酶活力。因此,在使用時(shí)要避免長(zhǎng)時(shí)間的酶解反應(yīng),一般可選擇11.5h,最長(zhǎng)不要超過(guò)3h。2、影響限制性?xún)?nèi)切酶酶解反應(yīng)的因素a、DNA純度:純度越高,酶解效率越高。b、DNA分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型:環(huán)狀、超螺旋DNA分子的酶切率,線性DNA分子,甲基化修飾作用可以阻礙DNA分子的切割。c、反應(yīng)體系:緩沖體系、pH值,Mg2濃度、NaCl濃度。d、溫度和時(shí)間:一般為37,在保證酶切效率的前提下盡量避免長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)。e、酶及酶量:選用高質(zhì)量制劑,不要高濃度的酶,防止雜酶活性產(chǎn)生。3、限制性?xún)?nèi)切酶的應(yīng)用方法 a、小量酶解反應(yīng):主要用于質(zhì)粒的酶切鑒定,典型的反應(yīng)是20l體積中含0.21.0g DNA。 b、大量酶解體系:主要應(yīng)用于大量制備基因片斷,一般反應(yīng)體積在50100l,DNA用量在1030g。三、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑(一)儀器 水平式電泳裝置,電泳儀,臺(tái)式高速離心機(jī), 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀, 照相支架, 照相機(jī)及其附件。 (二) 試劑 1、5TBE電泳緩沖液。2、6電泳載樣緩沖液:0.25 溴粉藍(lán),40(w/v) 蔗糖水溶液,貯存于 4。 3、溴化乙錠(EB)溶液母液:將EB配制成10mg/ml,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲(chǔ)于室溫即可。 四、實(shí)驗(yàn)步驟(一)DNA酶切反應(yīng) 1、將清潔干燥并經(jīng)滅菌的Eppendorf管(最好0.5ml)編號(hào),用移液器分別加入DNA1g和相應(yīng)的10限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)緩沖液2l,再加入重蒸水使總體積為19l,將管內(nèi)溶液混勻后加入1l酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機(jī)短暫離心一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵,要防止錯(cuò)加,漏加。使用限制性?xún)?nèi)切酶時(shí)應(yīng)盡量減少其離開(kāi)冰箱的時(shí)間,以免活性降低。 2、混勻反應(yīng)體系后,將Eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?7水浴保溫2-3小時(shí),使酶切反應(yīng)完全。 3、每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻或加熱,以終止反應(yīng),置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?(二)瓊脂糖凝膠電泳1、加樣:取10l酶解液與2l 6載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過(guò)樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭,以防止互相污染,注意上樣時(shí)要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。 2、電泳:加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源??刂齐妷罕3衷?0-80V,電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí),停止電泳。 五、注意事項(xiàng)1、酶切時(shí)所加的DNA溶液體積不能太大,否則DNA溶液中其他成分會(huì)干擾酶反應(yīng)。 2、酶活力通常用酶單位(U)表示,酶單位的定義是:在最適反應(yīng)條件下,1小時(shí)完全降解1mg 1DNA的酶量為一個(gè)單位,但是許多實(shí)驗(yàn)制備的DNA不像l DNA那樣易于降解,需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過(guò)量的酶是不合適的,除考慮成本外,酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。 3、市場(chǎng)銷(xiāo)售的酶一般濃度很大,為節(jié)約起見(jiàn),使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液(1)進(jìn)行稀釋。另外,酶通常保存在50%的甘油中,實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下,否則,酶活性將受影響。 4、觀察DNA離不開(kāi)紫外透射儀,可是紫外光對(duì)DNA分子有切割作用。從膠上回收DNA時(shí),應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間并采用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈(300-360nm),以減少紫外光切割DNA。 5、EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性,配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專(zhuān)門(mén)處理后才能清洗或丟棄。 6、當(dāng)EB太多,膠染色過(guò)深,DNA帶看不清時(shí),可將膠放入蒸餾水沖泡,30分鐘后再觀察點(diǎn)擊排行?!靖戒洝?、限制性核酸內(nèi)切酶作用及分類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)限制性酶)是一類(lèi)識(shí)別雙鏈DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶,以?xún)?nèi)切方式水解DNA的磷酸二酯鍵,產(chǎn)生5-P和3-OH末端。1952年Luria等及1953年Bertani等研究噬菌體時(shí)發(fā)現(xiàn)了宿主控制性現(xiàn)象。Arber及其同事用放射性同位素標(biāo)記證明,噬菌體在新品系中的損害伴隨有其DNA的降解,但宿主自已的DNA并不降解,據(jù)此他們提出了限制- 修飾酶假說(shuō)。對(duì)于一個(gè)宿主細(xì)胞,限制性酶及DNA甲基化酶是其細(xì)胞中的一對(duì)酶,它們對(duì)DNA底物可以有相同的識(shí)別順序,但有相反的生物功能,限制性酶的功能是在DNA分子內(nèi)部拆卸水解,甲基化酶是對(duì)所識(shí)別DNA分子的修飾,經(jīng)修飾后就可逃避限制性酶的識(shí)別及切割。甲基化酶只修飾宿主自身的DNA,從而避免了限制性酶對(duì)自身DNA的破壞。 限制性酶主要分為三種類(lèi)型:型限制酶為復(fù)合功能酶,具有限制-修飾兩種功能,但在DNA鏈上沒(méi)有固定的切割位點(diǎn),一般在離識(shí)別位點(diǎn)1kb到幾kb的地方隨機(jī)切割,不產(chǎn)生特異性片段。型酶與型酶基本相似,不同的是型酶在識(shí)別位點(diǎn)之外,有特異性的切割位點(diǎn),但這兩類(lèi)酶對(duì)DNA酶切分析的意義不大,通常所說(shuō)的限制性?xún)?nèi)切酶是指型酶,它能夠識(shí)別與切割DNA鏈上的特定的核苷酸序列,產(chǎn)生特異性的DNA片段。2、識(shí)別序列及消化產(chǎn)物的末端結(jié)構(gòu)限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列,大部分具有雙軸對(duì)稱(chēng)性結(jié)構(gòu)或稱(chēng)迴文序列,如EcoRI的識(shí)別序列為: GAATTC CTTAAG這種結(jié)構(gòu)又稱(chēng)為雙重對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)。G表示酶的識(shí)別序列,箭頭表示酶切口。大部分酶的識(shí)別序列長(zhǎng)度為4-6個(gè)核苷酸。4核苷酸序列在DNA鏈中出現(xiàn)頻率高,對(duì)一隨機(jī)排列的DNA分子來(lái)說(shuō),出現(xiàn)幾率為1/44,因此4核苷酸識(shí)別序列的限制性酶在DNA鏈上切點(diǎn)多,產(chǎn)生片段的數(shù)目多,長(zhǎng)度短。對(duì)于5和6核苷酸識(shí)別序列的酶,出現(xiàn)頻率分別為1/45和1/46 ,因此,6核苷酸的特異性序列在DNA中出現(xiàn)頻率低,而8核苷酸識(shí)別位點(diǎn)在DNA鏈中出現(xiàn)機(jī)率更低(1/48 )。一部分限制性酶具有非典型的雙軸對(duì)稱(chēng)性序列,其迴文識(shí)別序列被一個(gè)或幾個(gè)其它核苷酸所間隔,如Bgl的識(shí)別序列是: AGATCT TCTAGA另外有些限制性酶(約10種,如BbV等),其識(shí)別序列不表現(xiàn)為迴文結(jié)構(gòu),它們降解雙鏈DNA時(shí),酶切點(diǎn)大部分不在識(shí)別序列內(nèi),而是與識(shí)別序列相距5至13個(gè)核苷酸殘基不等。 限制性酶切片段的末端結(jié)構(gòu):限制性酶不但有特定的識(shí)別序列,并且任何一種酶切割DNA鏈時(shí),總是水解核苷酸3和5-磷酸二酯鍵的3位磷酸酯鍵,使產(chǎn)物的5端帶磷酸單酯基團(tuán),而3末端則為游離羥基。一種酶的全部水解產(chǎn)物具有相同末端的結(jié)構(gòu)。根據(jù)酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),產(chǎn)物的末端可分為粘性末端和平末端兩類(lèi)。粘性末端指酶切后DNA片段末端帶有1-4個(gè)核苷酸殘基的單鏈結(jié)構(gòu),且片段兩端突出的單鏈具有互補(bǔ)性。突出的單鏈因部位的不同,又可分為5-與3-粘性末端兩種,突出的單鏈帶5磷酸單酯的稱(chēng)5-粘性末端;突出的單鏈含3-羥基則稱(chēng)3-粘性末端。平末端指酶切后,片段為齊頭末端結(jié)構(gòu)。在DNA體外重組時(shí),粘性末端是DNA連接酶的高效底物,有很高的連接效率。 限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)環(huán)狀質(zhì)粒DNA有多少切口,就能產(chǎn)生多少酶切片段,因此鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù),就可以推斷酶切口的數(shù)目,從片段的遷移率可以大致判斷酶切片段大小的差別。用已知分子量的線狀DNA為對(duì)照,通過(guò)電泳遷移率的比較,就可以粗略推測(cè)分子形狀相同的未知DNA的分子量。實(shí)驗(yàn)五 大腸桿菌感受態(tài)的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程及其在分子生物學(xué)研究中的意義;2、學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌感受細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株,即不含限制性?xún)?nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R,M),它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(competence cell)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀(如抗生素的抗性)。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng),即可篩選出轉(zhuǎn)化子(transformant,即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高,但CaCl2 法簡(jiǎn)便易行,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿(mǎn)足一般實(shí)驗(yàn)的要求,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí),可加入占總體積15的無(wú)菌甘油于-70保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛。本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH5a菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pUC18質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pUC18質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr ),可通過(guò)Amp抗性來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后,可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出,進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。三、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑(一)儀器和材料恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、電熱恒溫水浴、分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、離心管、移液器、Eppendorf管、E.coli DH5、pUC18質(zhì)粒DNA等。(二)實(shí)驗(yàn)試劑1、LB液體培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨 10g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 5gNaCl 10g攪拌,使溶質(zhì)完全溶解,用5mol/L NaOH(約0.2ml)調(diào)節(jié)pH值7.4,加入去離子水至總體積為1L,高壓蒸汽15磅滅菌20分鐘。2、LB瓊脂平板培養(yǎng)基在LB培養(yǎng)液中加入1.5的瓊脂,高壓蒸汽15磅滅菌20分鐘。3、氨芐青霉素儲(chǔ)液稱(chēng)取50mg氨芐青霉素,溶于1ml水中,通過(guò)0.22um濾器除菌,配得氨芐青霉素儲(chǔ)液。4、LBA平板培養(yǎng)基:將配好的LB瓊脂平板培養(yǎng)基高壓滅菌后,冷卻至60左右,加入氨芐青霉素,使終濃度為50g/ml,搖勻后鋪板。5、0.1mol/L CaCl2:稱(chēng)取1.10g CaCl2(無(wú)水、分析純),溶解在100ml無(wú)菌雙蒸水中,滅菌處理后,避光儲(chǔ)存于4冰箱。四、實(shí)驗(yàn)步驟(一)受體菌的培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的E.coli DH5單菌落,接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中,37下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右,直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)至OD6000.5左右。(二)感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( CaCl2 法)1、將受體菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線,37培養(yǎng)16小時(shí)。(具體操作為用滅菌接種環(huán)取大腸桿菌一環(huán),涂在培養(yǎng)基平板表明靠近皿邊的位置上,然后用接菌環(huán)從這里開(kāi)始往返在培養(yǎng)基表面劃線,注意不可劃破表面,線條盡可能靠近,末端可以發(fā)育成單個(gè)菌落。)2、在平板上挑取一單菌落,菌落直徑大小約為12mm,接種于含50mlLB的300ml錐形瓶中,37 300r/min強(qiáng)烈震蕩培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁后,每隔2030分鐘測(cè)一次OD600,當(dāng)0.6時(shí),停止培養(yǎng),此時(shí)細(xì)胞的濃度達(dá)到5107個(gè)細(xì)胞/ml,細(xì)菌為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期。3、將1ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到1.5ml Eppendorf管離心管中,在冰上放置10分鐘,然后4000r/min,4離心10分鐘。4、棄上淸,倒置離心管流盡剩余液體,每個(gè)管中各加入0.2ml冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置15分鐘。然后4000r/min,4離心5分鐘,回收細(xì)胞。5、棄上淸,每1ml的原培養(yǎng)液再加入40l冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液,小心懸浮細(xì)胞,冰上放置片刻后即制成感受態(tài)細(xì)胞懸液。6、分裝于微量離心管中(每管1ml),放置于冰上,24小時(shí)內(nèi)可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。(可將細(xì)胞在4放置1224小時(shí),感受態(tài)細(xì)胞可以加入終濃度為10的滅菌甘油,置于70凍存)。(三)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化1、在40l上述感受態(tài)細(xì)胞懸液中,加入1l pUC18質(zhì)粒DNA溶液,其含量不超過(guò)50ng,此管為轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)組。2、將上述各樣品輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后,于42水浴中保溫2分鐘,熱休克,促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物,然后迅速置于冰浴中冷卻3分鐘。3、在上述試管中加入160l LB液體培養(yǎng)基,則總體積約為0.2ml,該溶液稱(chēng)為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液?;靹颍?7水浴溫浴15分鐘以上,使受菌體恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài),并使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗藥性,即細(xì)菌中的質(zhì)粒表達(dá)抗生素抗性蛋白。注意:1)為了獲得高感受性細(xì)胞,應(yīng)選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞OD600不應(yīng)高于0.6,并且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需將細(xì)胞置于冰上。2)細(xì)胞在冷凍后即使獲得了感受性,而在80幾小時(shí)后感受性達(dá)到最高值。至少幾個(gè)月均能維持高水平的感受態(tài)。(四)抗生素平板篩選轉(zhuǎn)化體1、將上述培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液搖勻后,進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)椒ㄒ?jiàn)下表:試管號(hào) 1 2 3 原液 1號(hào) 2號(hào)加入的樣品液(ml) 0.05 0.05 0.05 LB液體培養(yǎng)基(ml) 0.45 0.45 0.45 稀釋濃度 101 102 103 稀釋倍數(shù) 101 102 1032、分別取上述稀釋度的各樣品培養(yǎng)液200l,鋪于含抗菌素LB平板培養(yǎng)基上,涂勻。3、室溫下放置20分鐘,待溶液被培養(yǎng)基完全吸收后,倒置平皿,于37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12小時(shí),待菌落生長(zhǎng)良好而又未互相重疊時(shí),停止培養(yǎng)。五、檢出轉(zhuǎn)化體和計(jì)算轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計(jì)每個(gè)培育皿中的菌落數(shù),在含抗菌素培養(yǎng)液平皿中長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化體,根據(jù)此培育皿中菌落數(shù)則可計(jì)算出轉(zhuǎn)化體總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率,計(jì)算公式如下:轉(zhuǎn)化體總數(shù)菌落數(shù)稀釋倍數(shù)實(shí)驗(yàn)六 蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 了解聚丙烯酰胺凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)原理,掌握其操作規(guī)程。2、 掌握電泳法分離蛋白質(zhì)。二、實(shí)驗(yàn)原理聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)電泳樣品的電荷,分子大小及形狀的差別分離物質(zhì)。這種介質(zhì)既具有分子篩效應(yīng),又具備靜電效應(yīng),所以分辨力高于瓊脂糖凝膠電泳。聚丙烯酰胺單體(Acr)和交聯(lián)劑N,N亞基雙丙稀酰胺(Bis)在催化劑N,N,N ,N四甲基乙二胺(TEMED)和過(guò)硫酸銨(AP)存在的條件下,交叉連接形成三維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠交聯(lián)形成的小孔的孔徑大小主要與以下因素有關(guān):(1)交聯(lián)度(C),即雙丙稀酰胺占丙稀酰胺總計(jì)的質(zhì)量比??讖诫S著二者比率的增大而減小,比率接近1:20,孔徑達(dá)到最小值。一般實(shí)驗(yàn)常用比率為1:29??煞蛛x大小相差3的多肽。(2)濃度(T),即灌膠時(shí)所用丙稀酰胺和雙丙稀酰胺的總的百分濃度,一般根據(jù)所需分離的范圍選擇濃度。515的丙稀酰胺所灌制凝膠的分離范圍如下: 丙稀酰胺濃度() 線性分離范圍(KDa)15 124310 16287.5 36945.0 57212 注:雙丙稀酰胺:丙稀酰胺1:29選擇T和C的經(jīng)驗(yàn)性公式:C=6.50.3T丙稀酰胺凝膠常規(guī)灌制于兩塊封閉的平板之間,然后進(jìn)入垂直電泳。主要是因?yàn)檠跄芤种票□0返木酆戏磻?yīng),在密封的雙玻璃平板的夾層中灌膠后,僅有頂層的部分凝膠與空氣中的氧接觸,從而大大減弱了氧對(duì)聚合的抑制作用。聚丙烯酰胺凝膠電泳按其使用凝膠的孔徑和緩沖系統(tǒng)的不同,可分為連續(xù)電泳和不連續(xù)電泳。不連續(xù)電泳因其分辨率高、上樣量大而受到廣泛應(yīng)用。不連續(xù)電泳的凝膠按孔徑大小不同分為濃縮膠與分離膠。濃縮膠(concentrating gel)又稱(chēng)堆積膠(stacking gel),凝膠濃度較小,孔徑相對(duì)較大。把較稀釋的樣品加在濃縮膠上,經(jīng)過(guò)大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶,使樣品在分離膠中得以高分辨率的分離。分離膠(separation gel,resolving gel)又稱(chēng)電泳膠(running gel),通??讖捷^小,通過(guò)選擇合適的凝膠濃度,使樣品組分得以很好的分離。分離膠又可分為均一膠和梯度膠。濃縮膠和分離膠常使用相同的緩沖系統(tǒng),但pH不同。前者用pH6.8的Tris-HCl,后者用pH8.8的Tris-HCl,前者凝膠濃度常用45,后者則根據(jù)被分離樣品的情況而定。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、玻璃板洗干凈,將玻璃板和硅膠條裝好。2、根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求配置不同濃度的分離膠,同時(shí)根據(jù)不同的電泳槽所需的凝膠體積,按比例調(diào)整各成分的量。溶液成分不同體積聚丙烯酰胺凝膠(12)中各成分的添加量(ml)5 10 15 20 25 30 40 50水1.63.34.96.68.29.913.216.530丙稀酰胺2.04.06.08.010.012.016.020.01.5mmol/L Tris(pH8.8)1.32.53.85.06.37.51012.510SDS0.050.10.150.200.250.30.40.510%AP0.050.10.150.200.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02注:在小燒杯中混勻所加液體,立即使用,TEMED最后加入。3、用加樣器將膠緩慢注入兩玻璃板空隙中,不時(shí)輕敲玻璃板讓氣泡上浮,直至距加樣孔底1cm處。4、在膠的表面緩慢加100l水,等待膠的聚合。凝膠聚合后,可以看到凝膠和水之間有一層明顯的分界線,標(biāo)志凝膠已聚合,這是由于光線透過(guò)透明介質(zhì)不同密度不同折射率的區(qū)域時(shí),光學(xué)折射產(chǎn)生的波紋。倒去水,用濾紙吸去殘余水分。5、配置濃縮膠。溶液成分不同體積分離膠(5)中各成分的添加量(ml)1 2 3 4 5 6 7 8水0.681.42.12.73.44.15.56.830丙稀酰胺0.170.330.50.670.831.01.31.71.5mmol/L Tris(pH8.8)0.130.250.380.50.630.761.01.2510%AP0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01注:在小燒杯中混勻所加液體,立即用加樣器加入兩塊玻璃板之間。6、立即插入適當(dāng)?shù)氖猃X,注意勿使梳齒下帶進(jìn)氣泡,梳頂部應(yīng)比玻璃板頂部略高些。7、室溫下聚合0.5小時(shí),若凝膠明顯回縮,再添些丙稀酰胺溶液,梳齒下出現(xiàn)明顯的折光線時(shí),標(biāo)志聚合反應(yīng)已經(jīng)完成。將兩塊玻璃板連同凝膠一起取出,前后翻轉(zhuǎn),重新裝好電泳槽,用記號(hào)筆表明加樣孔的位置。8、將夾有凝膠的玻璃板放入電泳槽中,檢查是否有泄漏。在電泳裝置的上緩沖液室和下緩沖液室加入1Tris甘氨酸電泳緩沖液,注意使上緩沖液室中的電泳緩沖液剛好淹沒(méi)凝膠的加樣孔格。9、小心取出梳子,避免撕裂聚丙烯酰胺加樣孔格。立即用1Tris甘氨酸電泳緩沖液沖洗孔格。沖洗孔格這一操作不能省略,因?yàn)槭嶙尤〕龊?,梳子上吸附的和膠頂部尚未聚合的丙稀酰胺會(huì)流入孔格內(nèi),再聚合后使孔格底部不整齊,導(dǎo)致以后電泳帶型的不整齊。10、用加樣器將已與上樣緩沖液混好的蛋白質(zhì)樣品等體積(約10l)加入到樣品孔中。11、接通電源,正極與下層緩沖液室相連,選擇電壓為30V(約15mA)電泳10min至溴酚蘭染料進(jìn)入凝膠,然后將電壓調(diào)至60V(約30mA)電泳24h,至溴酚蘭泳出凝膠,電泳過(guò)高將引起升溫,導(dǎo)致帶型彎曲。12、關(guān)閉電源,撤去導(dǎo)線。取出玻璃模具,平放于桌上,小心將上面的玻璃板從角上輕輕掀開(kāi),去除兩側(cè)墊條,切去膠的一角作為標(biāo)記。13、染色(1)將聚丙烯酰胺凝膠放在塑料容器中并以35倍體積的固定液(冰乙酸/甲醇/水(102070)覆蓋,在旋轉(zhuǎn)搖床中緩慢搖動(dòng)至少15min。(2)傾去固定液,以考馬斯亮藍(lán)染色液(0.25g考馬斯亮藍(lán)溶解于90ml甲醇/水(11)和10ml冰醋酸中)覆蓋凝膠,并緩慢搖動(dòng)3040min。(3)傾去染色液,用約50ml ddH2O沖洗凝膠。(4)傾去固定液,以脫色液(30%甲醇與10%乙酸混合液)覆蓋凝膠,緩慢搖動(dòng)2h,傾去脫色液,再加入新脫色液同時(shí)至獲得藍(lán)色條帶及干凈的背景,凝膠可放在7乙醇或水中保存。實(shí)驗(yàn)七 蛋白質(zhì)免疫印跡分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)印跡免疫分析的原理、應(yīng)用等基本知識(shí)。2、掌握蛋白質(zhì)印跡免疫分析的基本操作和結(jié)果分析。二、基本原理Western免疫印跡(Western Blot)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相支持膜上,然后利用相應(yīng)抗體進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。蛋白質(zhì)印跡免疫分析的過(guò)程包括 蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳分離后,在電場(chǎng)作用下將凝膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上; 經(jīng)封閉后再用待檢蛋白質(zhì)的抗體與之結(jié)合; 經(jīng)洗滌后,再將濾膜與二級(jí)試劑(放射性標(biāo)記或辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)抗免疫球蛋白抗體)結(jié)合,進(jìn)一步洗滌后,通過(guò)放射自顯影或原位酶反應(yīng)來(lái)確定抗原抗體抗抗體復(fù)合物在濾膜上的位置和豐度。該技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測(cè)定特異敏感等諸多優(yōu)點(diǎn),具有從復(fù)雜混合物中對(duì)特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測(cè)的優(yōu)越性。該技術(shù)的靈敏度能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的固相放射免疫分析的水平而無(wú)需對(duì)靶蛋白進(jìn)行放射性標(biāo)記。 目前,Western blot廣泛用于蛋白質(zhì)研究、基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué)的研究。三、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑(一)儀器轉(zhuǎn)移電泳儀,硝酸纖維素膜,濾紙,剪刀,手套,小尺圖1 BioRad蛋白質(zhì)電泳裝置圖2 BioRad蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移裝置(二)試劑1、SDS-PAGE試劑。 2、轉(zhuǎn)膜緩沖液:甘氨酸 2.9g,Tris 5.8g,SDS 0.37g,甲醇200ml,加ddH2O定容至1000ml。 3、 0.01M PBS(pH7.4):NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g,加ddH2O至1000ml。4、膜染色液:考馬斯亮蘭 0.2g,甲醇80ml,乙酸2ml,ddH2O118ml。包被液(5%脫脂奶粉,現(xiàn)配):脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。5、顯色液DAB(
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