分子生物學(xué)實驗講義.doc

生化與分子生物學(xué)實驗講義天津醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系2005年實驗一 自抗凝血中提取哺乳動物細(xì)胞基因組DNA一、實驗?zāi)康?1、了解核酸的基本特性。2、掌握DNA提取和鑒定的方法。二、實驗原理核酸的分離與提取是分子生物學(xué)研究中很重要的基本技術(shù)，核酸樣品的質(zhì)量可能直接關(guān)系到后續(xù)實驗的成敗。核酸包括DNA、RNA兩種分子，在真核細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)相結(jié)合的狀態(tài)存在（DNA與組蛋白形成核小體，再折疊纏繞成染色體），真核生物基因組DNA為雙鏈線性分子，存在于細(xì)胞核內(nèi)?；蚪MDNA的提取需經(jīng)過DNA的釋放（破膜）、DNA與蛋白質(zhì)的分離，DNA的沉淀等過程。分離純化核酸的總原則：1、 保證核酸一級結(jié)構(gòu)的（核苷酸序列）的完整性，全部的遺傳信息均儲存在一級結(jié)構(gòu)中。2、 排除其它分子的污染。a) 對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子。b) 生物大分子：蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)。c) 其它核酸分子：RNA.三、實驗試劑 1、TKM緩沖液10 mmol/L Tris-HCl pH 7.6 （Tris 三羥甲基氨基甲烷）10 mmol/L KCl2 mmol/L EDTA4 mmol/L MgCl2 2、TE緩沖液10 mmol/L Tris-HCl1 mmol/L EDTA pH 8.0 3、10SDS 4、飽和氯化鈉四、實驗步驟1、取0.5ml EDTA抗凝的全血于清潔的1.5ml Eppendorf離心管中。2、加入0.5ml TKM緩沖液，13l Triton X-100（終濃度為1.2），顛倒混勻。在臺式離心機上離心，5,000rpm10分鐘。（低滲破紅細(xì)胞膜）。3、 傾去上清液，在離心管中加入1.0ml TKM緩沖液，混勻后離心，5,000rpm10分鐘，重復(fù)步驟3兩次。（清洗）4、于沉淀中加入200l TKM緩沖液和15l 10SDS（終濃度為0.7），混勻后于55保溫20分鐘。（破白細(xì)胞膜）注：此步中可加入少量蛋白酶K。5、于離心管中加入75l 飽和（6mol/L）氯化鈉溶液（終濃度為1.2 mol/L），混勻。13,000 rpm離心5分鐘。（沉淀蛋白質(zhì)）6、小心吸取上清液約240l轉(zhuǎn)移至另一潔凈的1.5ml Eppendorf離心管中。加入750l 95的冷乙醇（終濃度為71），80放置30min。離心1,5000 rpm20分鐘，最好在4。（沉淀DNA）7、小心吸去上清，加入1.0 ml 75的冷乙醇，洗滌沉淀，相同條件再離心一次。（脫鹽）8、棄去上清，用Parafilm膜封口，在膜上扎孔后置37溫箱中干燥，以去除殘余的乙醇。9、將干燥后的DNA溶于50l TE緩沖液中，置20冰箱中備用；也可將干品置20冰箱中備用，使用前用30l重蒸水溶解。10、 OD260/OD280的測定。五、注意事項為保證核酸分離的完整性和純度，實驗過程中應(yīng)注意以下事宜：1、 量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞。2、 少化學(xué)因素對核酸的降解，避免過酸、過堿對磷酸二酯鍵的破壞。3、 減少物理因素的核酸的降解，如機械剪切力（強力高速的震蕩）、高溫（破壞化學(xué)鍵，常規(guī)操作溫度為04，可降低核酸酶的活性，減少核酸的生物降解）。4、 防止核酸的生物降解，核酸酶消化磷酸二酯鍵，破壞一級結(jié)構(gòu)。其中DNA酶，需要二價金屬離子的激活（Mg2），使用二價金屬離子鰲合劑EDTA，基本上可抑制DNA酶的活性。實驗二 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及DNA的瓊脂糖凝膠電泳一、實驗?zāi)康?、掌握PCR反應(yīng)的原理，學(xué)習(xí)PCR的方法，熟悉PCR擴增儀的使用。2、了解PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化及引物設(shè)計。3、掌握瓊脂糖凝膠電泳的操作方法。二、實驗原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）是Karry Mullis于1985年創(chuàng)立的一種通過體外酶促擴增獲取大量特異DNA片段的方法。PCR技術(shù)是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)，模擬天然DNA的復(fù)制機制。PCR的特異性取決于引物和模板的特異性結(jié)合。PCR的全過程是以變性、退火、延伸三步反應(yīng)為一周期，通過若干輪的循環(huán)完成的，其中每一步的轉(zhuǎn)換是通過改變反應(yīng)溫度來控制。1、變性（denaturation） 模板DNA在95左右的高溫條件下雙鏈間的氫鍵斷裂，雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA并游離于反應(yīng)液中。2、退火（annealing） 熱變性后將溫度降低，人工合成的兩個寡核苷酸引物分別與模板DNA擴增區(qū)域的兩端準(zhǔn)確配對結(jié)合，形成局部雜交鏈。3、延伸（extension）在四種dNTP底物及Mg2存在的條件下，DNA聚合酶在最適作用溫度下可將脫氧單核苷酸從引物3端摻入，并沿著模板以新合成的DNA單鏈的53方向延伸合成新DNA，以上三個步驟為一循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一循環(huán)的模板。如圖所示，理論上PCR合成的數(shù)量經(jīng)過每輪循環(huán)都將增加一倍，應(yīng)按2n的指數(shù)方式遞增。PCR經(jīng)30輪循環(huán)后，PCR擴增量應(yīng)達(dá)到230個拷貝，約109個拷貝，但由于DNA聚合酶的質(zhì)量、待擴增片斷的序列及反應(yīng)體系的條件等諸多因素的影響，實際擴增效率比預(yù)期的要低，一般可達(dá)106107個拷貝。三、實驗流程1、目的基因的PCR擴增2、PCR產(chǎn)物的電泳檢測四、實驗試劑1、Taq DNA聚合酶：5 U/l。2、dNTP：4種dNTP按等比例混合，每種2.5mmol/L。3、MgCl2：，與緩沖液混在一起，無需單獨配置。4、PCR引物：稀釋為一定的濃度，擴增時用量為12l反應(yīng)體積。5、緩沖液：10PCR緩沖液濃度如下，使用時按比例稀釋：250500mmol/L KCl100500mmol/L Tris-Cl （pH 8.4）0.5% Tween-201mg/L BSA6、瓊脂糖凝膠：根據(jù)待分離樣品分子質(zhì)量的大小選擇不同濃度的凝膠。7、溴化乙錠（10mg/ml）在20ml雙蒸水中溶解0.2g溴化乙錠，混勻后4避光保存，溴化乙錠是一種誘變劑，操作時應(yīng)注意安全。8、上樣Buffer： 0.25的溴酚藍(lán)，使用時需加入一定濃度的甘油或蔗糖聚蔗糖，以使樣品沉入加樣槽。五、實驗步驟1、PCR反應(yīng)體系總體積25l（10buffer 2.5l，Mg2+ 1.5l，ddH2O 13.5l，primer A 2l，primer B 2l），模板DNA 1l，Taq酶1.5l）。 2、循環(huán)參數(shù)設(shè)定（1）95 1min 62 1min 72 1min 72延伸7min（2）反應(yīng)體系終止后。2瓊脂糖電泳（溴化乙錠染色）a、用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子。b、根據(jù)核酸分子質(zhì)量的大小配置不同濃度的瓊脂糖凝膠，一般200400bp的DNA片段，可配置1.21.7濃度的瓊脂糖用于電泳。c、在錐形瓶中配置0.5TAE電泳緩沖液100ml，稱取一定量的瓊脂糖粉放入沸水浴中或微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻至60（需要時可加入溴化乙錠），倒入電泳槽中，待凝固。d、向電泳槽中倒入配置好的凝膠，其量以沒過膠面2mm為宜，小心移去梳子。如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去。e、 在DNA樣品中加入0.2體積的上樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內(nèi)。f、接通電源，一般紅色為正極，黑色為負(fù)極，DNA樣品由負(fù)極往正極泳動（靠近加樣孔的一端為負(fù)）。電壓為15V/cm（長度以兩個正極之間的距離計算）。g、根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳。一般200400bp的PCR產(chǎn)物50V電壓，電泳2040分鐘即可。h、溴化乙錠染色后，紫外燈上觀察電泳帶的及其位置，并與標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量核酸比較擴增產(chǎn)物的大小。實驗三 質(zhì)粒的提取一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)質(zhì)粒DNA的基本知識。2、掌握質(zhì)粒的小量快速提取法。二、實驗原理 質(zhì)粒（plasmid）是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小在1200kb之間，具有雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中。質(zhì)粒具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，表達(dá)它攜帶的遺傳信息。質(zhì)?？瑟毩⒂坞x在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，也可整合到細(xì)菌染色體中，它離開宿主細(xì)胞就不能存活，它所控制的許多生物學(xué)功能也賦予宿主細(xì)胞某些特殊的表型。所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate, SDS）也可使細(xì)胞壁裂解，經(jīng)溶菌酶和陰離子去污劑（SDS）處理后，細(xì)菌DNA附著在細(xì)胞壁碎片上，離心時易被沉淀出來，而質(zhì)粒DNA則留在上清液中。用乙醇沉淀，即可得到質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA分子量一般在106107道爾頓范圍內(nèi)。在細(xì)胞內(nèi)，共價閉環(huán)DNA（covalently closed circular DNA，簡稱cccDNA）常以超螺旋形式存在。若兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫作開環(huán)DNA（open circular DNA, 簡稱ocDNA）。在電泳時，同一質(zhì)粒如以cccDNA形式存在，它比其開環(huán)和線狀DNA的泳動速度都快，因此在本實驗中，質(zhì)粒DNA在電泳凝膠中可能呈現(xiàn)3條區(qū)帶。三、實驗儀器及試劑1、儀器與耗材微量移液器、微量離心管（又稱Eppendorf管）、常用玻璃器皿、臺式高速離心機、分光光度計、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)等。2、材料大腸桿菌DH53、試劑（1）pH8.0 G.E.T 緩沖液（50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl）。 （2）pH 4.8乙酸鉀溶液（60ml5mol/L KAc，11.5ml冰乙酸，28.5ml H2O）（3）酚/氯仿（11，V/V）：酚需在160重蒸，加入抗氧化劑8-羥基喹啉，使其濃度為0.1%，并用Tris-HCl緩沖液平衡兩次。氯仿中加入異戊醇，氯仿/異戊醇（241，V/V）。（4）pH 8.0 TE緩沖液：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，其中含有RNA酶（RNase）20g/ml。（5）TAE緩沖液：稱取Tris10.88g、醋酸5.52g和EDTA 0.72g，用蒸餾水溶解后，定容至200ml，用前稀釋10倍。四、實驗步驟1、細(xì)菌的培養(yǎng)、質(zhì)粒DNA的擴增和收集：（1）挑取瓊脂平板上的單一菌落，接種至20ml LB液體培養(yǎng)液中，37，300轉(zhuǎn)/分振搖過夜。（2）取1ml上述菌液于1.5ml Eppendorf管中，6000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，棄上清并重復(fù)1次，共收集2ml菌液。（3）倒掉菌液上淸，將Eppendorf管倒置于濾紙上空干，同時配置溶液。2、細(xì)菌菌體的裂解和初步純化：（1）在上述Eppendorf管中加入冰浴后的溶液100l，劇烈振蕩混勻。（2）加入室溫放置的溶液200l，顛倒混勻，此時溶液會變澄清，冰上放置3分鐘。（3）加入冰浴后的溶液150l，顛倒混勻，此時溶液中會出現(xiàn)絮狀沉淀。12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，將上淸移至另一干凈1.5ml Eppendorf管中（約有400l）。（4）每管加等體積的“酚：氯仿”（下層有機相），劇烈震蕩混勻后12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，將上淸液移至另一干凈1.5ml Eppendorf管中（約300l）。（5）每管加入2.5倍體積95乙醇（600l）室溫靜置30分鐘后12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。（6）倒掉上淸后將管底倒置于高壓過的濾紙上控干。（7）加入50l TE（含無DNA酶的RNA酶20l/ml）溶解質(zhì)粒DNA，短暫震蕩5分鐘后，可進(jìn)行內(nèi)切酶實驗或20存儲。3、電泳鑒定空質(zhì)粒載體大小位置1瓊脂糖電泳鑒定質(zhì)粒大小位置，觀察沒有經(jīng)過酶切的質(zhì)粒是否有松弛環(huán)狀質(zhì)粒DNA、線性質(zhì)粒DNA及超螺旋狀態(tài)質(zhì)粒DNA上下三條帶出現(xiàn)。附：DNA的瓊脂糖凝膠電泳：1、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的基本方法。該技術(shù)操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶（Ethidium bromide, EB）染色，在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作。 瓊脂糖可以制成各種形狀、大小和孔隙度的凝膠。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。瓊脂糖主要在DNA電泳中作為一種固體支持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中，中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定： （1）DNA的分子大小: 線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移越慢。 （2）瓊脂糖濃度一個給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍瓊脂糖濃度線性DNA分子的分離范圍0.30.60.70.91.21.512.05601200.8100.570.960.230.12（3）DNA分子的構(gòu)象 分子量相同，構(gòu)象不同的DNA分子在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，超螺旋DNA移動最快，而線狀雙鏈DNA移動最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶，難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起，還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。 （4）電源電壓 在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大，所加電壓不得超過5v/cm。 （5）嵌入染料的存在 熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強，還會使線狀DNA遷移率降低15。 （6）離子強度影響 電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠)，電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10電泳緩沖液)，則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時會引起凝膠熔化或DNA變性。 對于天然的雙鏈DNA，常用的幾種電泳緩沖液有TAE含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA)，一般配制成濃縮母液，儲于室溫。 （7）制備步驟a、瓊脂糖凝膠的制備：稱取0.6g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入50 ml TAE緩沖液，經(jīng)沸水浴加熱全部融化后，取出搖勻，此為1.2%的瓊脂糖凝膠。b、膠板的制備：取橡皮膏（寬約1cm）將有機玻璃板的邊緣封好，水平放置，將樣品槽板垂直立在玻璃板表面。將冷卻至65左右的瓊脂糖凝膠液，小心倒入凝膠液，使膠液緩慢展開，直到在整個玻璃板表面形成均勻的膠層，室溫下靜置30 min，待凝固完全后，輕輕拔出樣品槽模板，在膠板上即形成相互隔開的樣品槽。用滴管將樣品槽內(nèi)注滿TBE緩沖液以防止干裂，制備好膠板后立即取下橡皮膏，將膠板放在電泳槽中使用。c、加樣：用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內(nèi)。每次加完一個樣品，要用蒸餾水反復(fù)洗凈微量加樣器，以防止相互污染。d、加完樣品后的凝膠板，立即通電。樣品進(jìn)膠前，應(yīng)使電流控制在20mA，樣品進(jìn)膠后電壓控制在6080V，電流為4050 mA。當(dāng)指示前沿移動至距離膠板12cm處，停止電泳。e、將電泳后的膠板在EB染色液中進(jìn)行染色以觀察在瓊脂糖凝膠中的DNA條帶。實驗四 限制性核酸內(nèi)切酶分析及DNA的回收一、實驗?zāi)康?、 了解限制型核酸內(nèi)切酶的性質(zhì)及酶切反應(yīng)的條件。2、 掌握DNA回收的方法。二、實驗原理1、限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件 a、緩沖系統(tǒng)：多數(shù)生物技術(shù)公司的產(chǎn)品目錄中均提供了關(guān)于何種酶適合于何種緩沖液的資料。為了簡化操作，有人提出了“通用緩沖液”的反應(yīng)體系，組成如下：Tris-HCl 50 mmol/L pH8.0MgCl2 10 mmol/L二硫蘇糖醇（DDT） 1 mmol/L牛血清白蛋白 100g/mlNaCl 0g/L （低鹽緩沖液）NaCl 50g/L （中鹽緩沖液）NaCl 100g/L （高鹽緩沖液）b、反應(yīng)體積：一般不少于20l，過少的反應(yīng)體積在加入各種組分時，容易產(chǎn)生誤差。商品化的限制性內(nèi)切酶溶液中含有50（V/V）的甘油作為防凍劑，酶切體系中酶的用量不宜超過總體積的1/10，因為甘油含量若超過5，則會抑制內(nèi)切酶的活性。 c、反應(yīng)溫度：大多數(shù)常用的反應(yīng)溫度為37，相當(dāng)一部分酶在反應(yīng)溫度升高時不穩(wěn)定。d、反應(yīng)時間：由于商品形式提供的限制性內(nèi)切酶只是相對純的制劑，并不是絕對不含其它雜酶，若反應(yīng)時間過長，有可能出現(xiàn)雜酶活力。因此，在使用時要避免長時間的酶解反應(yīng)，一般可選擇11.5h，最長不要超過3h。2、影響限制性內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的因素a、DNA純度：純度越高，酶解效率越高。b、DNA分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型：環(huán)狀、超螺旋DNA分子的酶切率，線性DNA分子，甲基化修飾作用可以阻礙DNA分子的切割。c、反應(yīng)體系：緩沖體系、pH值，Mg2濃度、NaCl濃度。d、溫度和時間：一般為37，在保證酶切效率的前提下盡量避免長時間反應(yīng)。e、酶及酶量：選用高質(zhì)量制劑，不要高濃度的酶，防止雜酶活性產(chǎn)生。3、限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用方法 a、小量酶解反應(yīng)：主要用于質(zhì)粒的酶切鑒定，典型的反應(yīng)是20l體積中含0.21.0g DNA。 b、大量酶解體系：主要應(yīng)用于大量制備基因片斷，一般反應(yīng)體積在50100l，DNA用量在1030g。三、實驗儀器及試劑（一）儀器 水平式電泳裝置,電泳儀,臺式高速離心機, 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀, 照相支架, 照相機及其附件。 （二） 試劑 1、5TBE電泳緩沖液。2、6電泳載樣緩沖液：0.25 溴粉藍(lán)，40(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于 4。 3、溴化乙錠（EB）溶液母液：將EB配制成10mg/ml，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲于室溫即可。 四、實驗步驟（一）DNA酶切反應(yīng) 1、將清潔干燥并經(jīng)滅菌的Eppendorf管(最好0.5ml)編號，用移液器分別加入DNA1g和相應(yīng)的10限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液2l，再加入重蒸水使總體積為19l，將管內(nèi)溶液混勻后加入1l酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機短暫離心一下，使溶液集中在管底。此步操作是整個實驗成敗的關(guān)鍵,要防止錯加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。 2、混勻反應(yīng)體系后，將Eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?7水浴保溫2-3小時，使酶切反應(yīng)完全。 3、每管加入2l 0.1mol/L EDTA（pH8.0），混勻或加熱，以終止反應(yīng)，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?（二）瓊脂糖凝膠電泳1、加樣：取10l酶解液與2l 6載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。 2、電泳：加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳。 五、注意事項1、酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應(yīng)。 2、酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應(yīng)條件下，1小時完全降解1mg 1DNA的酶量為一個單位，但是許多實驗制備的DNA不像l DNA那樣易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。 3、市場銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時可事先用酶反應(yīng)緩沖液（1）進(jìn)行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。 4、觀察DNA離不開紫外透射儀，可是紫外光對DNA分子有切割作用。從膠上回收DNA時，應(yīng)盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm)，以減少紫外光切割DNA。 5、EB是強誘變劑并有中等毒性，配制和使用時都應(yīng)戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。 6、當(dāng)EB太多，膠染色過深，DNA帶看不清時，可將膠放入蒸餾水沖泡，30分鐘后再觀察點擊排行?！靖戒洝?、限制性核酸內(nèi)切酶作用及分類限制性核酸內(nèi)切酶（以下簡稱限制性酶）是一類識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以內(nèi)切方式水解DNA的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生5-P和3-OH末端。1952年Luria等及1953年Bertani等研究噬菌體時發(fā)現(xiàn)了宿主控制性現(xiàn)象。Arber及其同事用放射性同位素標(biāo)記證明，噬菌體在新品系中的損害伴隨有其DNA的降解，但宿主自已的DNA并不降解，據(jù)此他們提出了限制- 修飾酶假說。對于一個宿主細(xì)胞，限制性酶及DNA甲基化酶是其細(xì)胞中的一對酶，它們對DNA底物可以有相同的識別順序，但有相反的生物功能，限制性酶的功能是在DNA分子內(nèi)部拆卸水解，甲基化酶是對所識別DNA分子的修飾，經(jīng)修飾后就可逃避限制性酶的識別及切割。甲基化酶只修飾宿主自身的DNA，從而避免了限制性酶對自身DNA的破壞。 限制性酶主要分為三種類型：型限制酶為復(fù)合功能酶，具有限制-修飾兩種功能，但在DNA鏈上沒有固定的切割位點，一般在離識別位點1kb到幾kb的地方隨機切割，不產(chǎn)生特異性片段。型酶與型酶基本相似，不同的是型酶在識別位點之外，有特異性的切割位點，但這兩類酶對DNA酶切分析的意義不大，通常所說的限制性內(nèi)切酶是指型酶，它能夠識別與切割DNA鏈上的特定的核苷酸序列，產(chǎn)生特異性的DNA片段。2、識別序列及消化產(chǎn)物的末端結(jié)構(gòu)限制性內(nèi)切酶的識別序列，大部分具有雙軸對稱性結(jié)構(gòu)或稱迴文序列，如EcoRI的識別序列為： GAATTC CTTAAG這種結(jié)構(gòu)又稱為雙重對稱結(jié)構(gòu)。G表示酶的識別序列，箭頭表示酶切口。大部分酶的識別序列長度為4-6個核苷酸。4核苷酸序列在DNA鏈中出現(xiàn)頻率高，對一隨機排列的DNA分子來說，出現(xiàn)幾率為1/44，因此4核苷酸識別序列的限制性酶在DNA鏈上切點多，產(chǎn)生片段的數(shù)目多，長度短。對于5和6核苷酸識別序列的酶，出現(xiàn)頻率分別為1/45和1/46 ，因此，6核苷酸的特異性序列在DNA中出現(xiàn)頻率低，而8核苷酸識別位點在DNA鏈中出現(xiàn)機率更低(1/48 )。一部分限制性酶具有非典型的雙軸對稱性序列，其迴文識別序列被一個或幾個其它核苷酸所間隔，如Bgl的識別序列是： AGATCT TCTAGA另外有些限制性酶(約10種，如BbV等)，其識別序列不表現(xiàn)為迴文結(jié)構(gòu)，它們降解雙鏈DNA時，酶切點大部分不在識別序列內(nèi)，而是與識別序列相距5至13個核苷酸殘基不等。 限制性酶切片段的末端結(jié)構(gòu)：限制性酶不但有特定的識別序列，并且任何一種酶切割DNA鏈時，總是水解核苷酸3和5-磷酸二酯鍵的3位磷酸酯鍵，使產(chǎn)物的5端帶磷酸單酯基團，而3末端則為游離羥基。一種酶的全部水解產(chǎn)物具有相同末端的結(jié)構(gòu)。根據(jù)酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點，產(chǎn)物的末端可分為粘性末端和平末端兩類。粘性末端指酶切后DNA片段末端帶有1-4個核苷酸殘基的單鏈結(jié)構(gòu)，且片段兩端突出的單鏈具有互補性。突出的單鏈因部位的不同，又可分為5-與3-粘性末端兩種，突出的單鏈帶5磷酸單酯的稱5-粘性末端；突出的單鏈含3-羥基則稱3-粘性末端。平末端指酶切后，片段為齊頭末端結(jié)構(gòu)。在DNA體外重組時，粘性末端是DNA連接酶的高效底物，有很高的連接效率。 限制性內(nèi)切酶對環(huán)狀質(zhì)粒DNA有多少切口，就能產(chǎn)生多少酶切片段，因此鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù)，就可以推斷酶切口的數(shù)目，從片段的遷移率可以大致判斷酶切片段大小的差別。用已知分子量的線狀DNA為對照，通過電泳遷移率的比較，就可以粗略推測分子形狀相同的未知DNA的分子量。實驗五 大腸桿菌感受態(tài)的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化一、實驗?zāi)康?、了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程及其在分子生物學(xué)研究中的意義；2、學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌感受細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法。二、實驗原理轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。 轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R，M)，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如電擊法，CaCl2 ，RbCl（KCl）等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞（competence cell）。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制，表達(dá)實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀（如抗生素的抗性）。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子（transformant，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞）。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2和RbCl（KCl）法，RbCl（KCl）法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高，但CaCl2 法簡便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實驗的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時，可加入占總體積15的無菌甘油于-70保存(半年)，因此CaCl2法為使用更廣泛。本實驗以E.coli DH5a菌株為受體細(xì)胞，并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pUC18質(zhì)粒共保溫，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pUC18質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子擴增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。三、實驗儀器及試劑（一）儀器和材料恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈臺、電熱恒溫水浴、分光光度計、臺式離心機、離心管、移液器、Eppendorf管、E.coli DH5、pUC18質(zhì)粒DNA等。（二）實驗試劑1、LB液體培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨 10g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 5gNaCl 10g攪拌，使溶質(zhì)完全溶解，用5mol/L NaOH（約0.2ml）調(diào)節(jié)pH值7.4，加入去離子水至總體積為1L，高壓蒸汽15磅滅菌20分鐘。2、LB瓊脂平板培養(yǎng)基在LB培養(yǎng)液中加入1.5的瓊脂，高壓蒸汽15磅滅菌20分鐘。3、氨芐青霉素儲液稱取50mg氨芐青霉素，溶于1ml水中，通過0.22um濾器除菌，配得氨芐青霉素儲液。4、LBA平板培養(yǎng)基：將配好的LB瓊脂平板培養(yǎng)基高壓滅菌后，冷卻至60左右，加入氨芐青霉素，使終濃度為50g/ml，搖勻后鋪板。5、0.1mol/L CaCl2：稱取1.10g CaCl2（無水、分析純），溶解在100ml無菌雙蒸水中，滅菌處理后，避光儲存于4冰箱。四、實驗步驟（一）受體菌的培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的E.coli DH5單菌落，接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中，37下振蕩培養(yǎng)12小時左右,直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD6000.5左右。（二）感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( CaCl2 法)1、將受體菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，37培養(yǎng)16小時。（具體操作為用滅菌接種環(huán)取大腸桿菌一環(huán)，涂在培養(yǎng)基平板表明靠近皿邊的位置上，然后用接菌環(huán)從這里開始往返在培養(yǎng)基表面劃線，注意不可劃破表面，線條盡可能靠近，末端可以發(fā)育成單個菌落。）2、在平板上挑取一單菌落，菌落直徑大小約為12mm，接種于含50mlLB的300ml錐形瓶中，37 300r/min強烈震蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁后，每隔2030分鐘測一次OD600，當(dāng)0.6時，停止培養(yǎng)，此時細(xì)胞的濃度達(dá)到5107個細(xì)胞/ml，細(xì)菌為對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長前期。3、將1ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到1.5ml Eppendorf管離心管中，在冰上放置10分鐘，然后4000r/min，4離心10分鐘。4、棄上淸，倒置離心管流盡剩余液體，每個管中各加入0.2ml冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置15分鐘。然后4000r/min，4離心5分鐘，回收細(xì)胞。5、棄上淸，每1ml的原培養(yǎng)液再加入40l冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻后即制成感受態(tài)細(xì)胞懸液。6、分裝于微量離心管中（每管1ml），放置于冰上，24小時內(nèi)可直接用于轉(zhuǎn)化實驗。（可將細(xì)胞在4放置1224小時，感受態(tài)細(xì)胞可以加入終濃度為10的滅菌甘油，置于70凍存）。（三）感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化1、在40l上述感受態(tài)細(xì)胞懸液中，加入1l pUC18質(zhì)粒DNA溶液，其含量不超過50ng，此管為轉(zhuǎn)換實驗組。2、將上述各樣品輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后，于42水浴中保溫2分鐘，熱休克，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，然后迅速置于冰浴中冷卻3分鐘。3、在上述試管中加入160l LB液體培養(yǎng)基，則總體積約為0.2ml，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液?；靹颍?7水浴溫浴15分鐘以上，使受菌體恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗藥性，即細(xì)菌中的質(zhì)粒表達(dá)抗生素抗性蛋白。注意：1）為了獲得高感受性細(xì)胞，應(yīng)選用處于對數(shù)生長期的細(xì)胞OD600不應(yīng)高于0.6，并且在整個實驗過程中需將細(xì)胞置于冰上。2）細(xì)胞在冷凍后即使獲得了感受性，而在80幾小時后感受性達(dá)到最高值。至少幾個月均能維持高水平的感受態(tài)。（四）抗生素平板篩選轉(zhuǎn)化體1、將上述培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液搖勻后，進(jìn)行梯度稀釋，方法見下表：試管號 1 2 3 原液 1號 2號加入的樣品液（ml） 0.05 0.05 0.05 LB液體培養(yǎng)基（ml） 0.45 0.45 0.45 稀釋濃度 101 102 103 稀釋倍數(shù) 101 102 1032、分別取上述稀釋度的各樣品培養(yǎng)液200l，鋪于含抗菌素LB平板培養(yǎng)基上，涂勻。3、室溫下放置20分鐘，待溶液被培養(yǎng)基完全吸收后，倒置平皿，于37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12小時，待菌落生長良好而又未互相重疊時，停止培養(yǎng)。五、檢出轉(zhuǎn)化體和計算轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計每個培育皿中的菌落數(shù)，在含抗菌素培養(yǎng)液平皿中長出的菌落即為轉(zhuǎn)化體，根據(jù)此培育皿中菌落數(shù)則可計算出轉(zhuǎn)化體總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，計算公式如下：轉(zhuǎn)化體總數(shù)菌落數(shù)稀釋倍數(shù)實驗六 蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳一、實驗?zāi)康?、 了解聚丙烯酰胺凝膠電泳的實驗原理，掌握其操作規(guī)程。2、 掌握電泳法分離蛋白質(zhì)。二、實驗原理聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)電泳樣品的電荷，分子大小及形狀的差別分離物質(zhì)。這種介質(zhì)既具有分子篩效應(yīng)，又具備靜電效應(yīng)，所以分辨力高于瓊脂糖凝膠電泳。聚丙烯酰胺單體（Acr）和交聯(lián)劑N，N亞基雙丙稀酰胺（Bis）在催化劑N，N，N ，N四甲基乙二胺（TEMED）和過硫酸銨（AP）存在的條件下，交叉連接形成三維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠交聯(lián)形成的小孔的孔徑大小主要與以下因素有關(guān)：（1）交聯(lián)度（C），即雙丙稀酰胺占丙稀酰胺總計的質(zhì)量比?？讖诫S著二者比率的增大而減小，比率接近1:20，孔徑達(dá)到最小值。一般實驗常用比率為1:29?？煞蛛x大小相差3的多肽。（2）濃度（T），即灌膠時所用丙稀酰胺和雙丙稀酰胺的總的百分濃度，一般根據(jù)所需分離的范圍選擇濃度。515的丙稀酰胺所灌制凝膠的分離范圍如下： 丙稀酰胺濃度（） 線性分離范圍（KDa）15 124310 16287.5 36945.0 57212 注：雙丙稀酰胺:丙稀酰胺1:29選擇T和C的經(jīng)驗性公式：C=6.50.3T丙稀酰胺凝膠常規(guī)灌制于兩塊封閉的平板之間，然后進(jìn)入垂直電泳。主要是因為氧能抑制丙稀酰胺的聚合反應(yīng)，在密封的雙玻璃平板的夾層中灌膠后，僅有頂層的部分凝膠與空氣中的氧接觸，從而大大減弱了氧對聚合的抑制作用。聚丙烯酰胺凝膠電泳按其使用凝膠的孔徑和緩沖系統(tǒng)的不同，可分為連續(xù)電泳和不連續(xù)電泳。不連續(xù)電泳因其分辨率高、上樣量大而受到廣泛應(yīng)用。不連續(xù)電泳的凝膠按孔徑大小不同分為濃縮膠與分離膠。濃縮膠（concentrating gel）又稱堆積膠（stacking gel），凝膠濃度較小，孔徑相對較大。把較稀釋的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶，使樣品在分離膠中得以高分辨率的分離。分離膠（separation gel，resolving gel）又稱電泳膠（running gel），通?？讖捷^小，通過選擇合適的凝膠濃度，使樣品組分得以很好的分離。分離膠又可分為均一膠和梯度膠。濃縮膠和分離膠常使用相同的緩沖系統(tǒng)，但pH不同。前者用pH6.8的Tris-HCl，后者用pH8.8的Tris-HCl，前者凝膠濃度常用45，后者則根據(jù)被分離樣品的情況而定。三、實驗步驟1、玻璃板洗干凈，將玻璃板和硅膠條裝好。2、根據(jù)實驗的要求配置不同濃度的分離膠，同時根據(jù)不同的電泳槽所需的凝膠體積，按比例調(diào)整各成分的量。溶液成分不同體積聚丙烯酰胺凝膠（12）中各成分的添加量（ml）5 10 15 20 25 30 40 50水1.63.34.96.68.29.913.216.530丙稀酰胺2.04.06.08.010.012.016.020.01.5mmol/L Tris（pH8.8）1.32.53.85.06.37.51012.510SDS0.050.10.150.200.250.30.40.510%AP0.050.10.150.200.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02注：在小燒杯中混勻所加液體，立即使用，TEMED最后加入。3、用加樣器將膠緩慢注入兩玻璃板空隙中，不時輕敲玻璃板讓氣泡上浮，直至距加樣孔底1cm處。4、在膠的表面緩慢加100l水，等待膠的聚合。凝膠聚合后，可以看到凝膠和水之間有一層明顯的分界線，標(biāo)志凝膠已聚合，這是由于光線透過透明介質(zhì)不同密度不同折射率的區(qū)域時，光學(xué)折射產(chǎn)生的波紋。倒去水，用濾紙吸去殘余水分。5、配置濃縮膠。溶液成分不同體積分離膠（5）中各成分的添加量（ml）1 2 3 4 5 6 7 8水0.681.42.12.73.44.15.56.830丙稀酰胺0.170.330.50.670.831.01.31.71.5mmol/L Tris（pH8.8）0.130.250.380.50.630.761.01.2510%AP0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01注：在小燒杯中混勻所加液體，立即用加樣器加入兩塊玻璃板之間。6、立即插入適當(dāng)?shù)氖猃X，注意勿使梳齒下帶進(jìn)氣泡，梳頂部應(yīng)比玻璃板頂部略高些。7、室溫下聚合0.5小時，若凝膠明顯回縮，再添些丙稀酰胺溶液，梳齒下出現(xiàn)明顯的折光線時，標(biāo)志聚合反應(yīng)已經(jīng)完成。將兩塊玻璃板連同凝膠一起取出，前后翻轉(zhuǎn)，重新裝好電泳槽，用記號筆表明加樣孔的位置。8、將夾有凝膠的玻璃板放入電泳槽中，檢查是否有泄漏。在電泳裝置的上緩沖液室和下緩沖液室加入1Tris甘氨酸電泳緩沖液，注意使上緩沖液室中的電泳緩沖液剛好淹沒凝膠的加樣孔格。9、小心取出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺加樣孔格。立即用1Tris甘氨酸電泳緩沖液沖洗孔格。沖洗孔格這一操作不能省略，因為梳子取出后，梳子上吸附的和膠頂部尚未聚合的丙稀酰胺會流入孔格內(nèi)，再聚合后使孔格底部不整齊，導(dǎo)致以后電泳帶型的不整齊。10、用加樣器將已與上樣緩沖液混好的蛋白質(zhì)樣品等體積（約10l）加入到樣品孔中。11、接通電源，正極與下層緩沖液室相連，選擇電壓為30V（約15mA）電泳10min至溴酚蘭染料進(jìn)入凝膠，然后將電壓調(diào)至60V（約30mA）電泳24h，至溴酚蘭泳出凝膠，電泳過高將引起升溫，導(dǎo)致帶型彎曲。12、關(guān)閉電源，撤去導(dǎo)線。取出玻璃模具，平放于桌上，小心將上面的玻璃板從角上輕輕掀開，去除兩側(cè)墊條，切去膠的一角作為標(biāo)記。13、染色（1）將聚丙烯酰胺凝膠放在塑料容器中并以35倍體積的固定液（冰乙酸/甲醇/水（102070）覆蓋，在旋轉(zhuǎn)搖床中緩慢搖動至少15min。（2）傾去固定液，以考馬斯亮藍(lán)染色液（0.25g考馬斯亮藍(lán)溶解于90ml甲醇/水（11）和10ml冰醋酸中）覆蓋凝膠，并緩慢搖動3040min。（3）傾去染色液，用約50ml ddH2O沖洗凝膠。（4）傾去固定液，以脫色液（30%甲醇與10%乙酸混合液）覆蓋凝膠，緩慢搖動2h，傾去脫色液，再加入新脫色液同時至獲得藍(lán)色條帶及干凈的背景，凝膠可放在7乙醇或水中保存。實驗七 蛋白質(zhì)免疫印跡分析一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)印跡免疫分析的原理、應(yīng)用等基本知識。2、掌握蛋白質(zhì)印跡免疫分析的基本操作和結(jié)果分析。二、基本原理Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相支持膜上，然后利用相應(yīng)抗體進(jìn)行檢測的技術(shù)。蛋白質(zhì)印跡免疫分析的過程包括 蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳分離后，在電場作用下將凝膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上； 經(jīng)封閉后再用待檢蛋白質(zhì)的抗體與之結(jié)合； 經(jīng)洗滌后，再將濾膜與二級試劑（放射性標(biāo)記或辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)抗免疫球蛋白抗體）結(jié)合，進(jìn)一步洗滌后，通過放射自顯影或原位酶反應(yīng)來確定抗原抗體抗抗體復(fù)合物在濾膜上的位置和豐度。該技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測定特異敏感等諸多優(yōu)點，具有從復(fù)雜混合物中對特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測的優(yōu)越性。該技術(shù)的靈敏度能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的固相放射免疫分析的水平而無需對靶蛋白進(jìn)行放射性標(biāo)記。 目前，Western blot廣泛用于蛋白質(zhì)研究、基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué)的研究。三、實驗儀器及試劑（一）儀器轉(zhuǎn)移電泳儀，硝酸纖維素膜，濾紙，剪刀，手套，小尺圖1 BioRad蛋白質(zhì)電泳裝置圖2 BioRad蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移裝置（二）試劑1、SDS-PAGE試劑。 2、轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加ddH2O定容至1000ml。 3、 0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，加ddH2O至1000ml。4、膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g，甲醇80ml，乙酸2ml，ddH2O118ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。5、顯色液DAB（