第二章基因工程習(xí)題答案.doc

基因工程課程習(xí)題 選擇題 001 基因工程操作的三大基本元件是【】I 供體 II 受體 III 載體 IV 抗體 V 配體 I + II + III I + III + IV II + III + IV II + IV + V III + IV + V 002 根據(jù)當(dāng)今生命科學(xué)理論，基因工程的用途是【E】 I 分離純化基因 II 大量生產(chǎn)生物分子 III 構(gòu)建新型物種 IV 提高基因重組效率 I + II + III I + II + IV I + III + IV II + III + IV I + II + III + IV 003 根據(jù)基因工程的定義，下列各名詞中不能替代基因工程的是【A】 基因誘變 分子克隆 DNA重組 遺傳工程 基因無(wú)性繁殖 004 基因工程的單元操作順序是【B】 增，轉(zhuǎn)，檢，切，接 切，接，轉(zhuǎn)，增，檢 接，轉(zhuǎn)，增，檢，切 檢，切，接，增，轉(zhuǎn) 切，接，增，轉(zhuǎn)，檢 005 下列有關(guān)基因的敘述，錯(cuò)誤的是【A】 蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的唯一產(chǎn)物 基因是 DNA 鏈上具有編碼功能的片段 基因也可以是 RNA 基因突變不一定導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物改變結(jié)構(gòu) 基因具有方向性006 限制性核酸內(nèi)切酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的，其生理意義是 【D】 修復(fù)自身的遺傳缺陷 促進(jìn)自身的基因重組 強(qiáng)化自身的核酸代謝 提高自身的防御能力 補(bǔ)充自身的核苷酸消耗 007 天然 PstI 限制性內(nèi)切酶的來源是 【D】 Bacillus amyloliquefaciens Escherichia coli Haemophilus influenzae Providencia stuartii Streptomyces lividans 008 T 4 -DNA 連接酶是通過形成磷酸二酯鍵將兩段 DNA 片段連接在一起，其底物的關(guān)鍵基團(tuán)是 【D】 2 -OH 和 5 -P 2 -OH 和 3 -P 3 -OH 和 2 -P 3 -OH 和 5 -P 5 -OH 和 3 -P 009若載體 DNA 用 M 酶切開，則下列五種帶有 N 酶粘性末端的外源 DNA 片段中，能直接與載體拼接的是 【D】M N A/AGCTT T/TCGAA C/CATGG ACATG/T CCC/GGG G/GGCCC G/GATCC A/GATCT GAGCT/C G/AGCTC 010下列有關(guān)質(zhì)粒分子生物學(xué)的敘述，錯(cuò)誤的是 【B】 質(zhì)粒是共價(jià)環(huán)狀的雙鏈 DNA 分子 天然質(zhì)粒一般不含有限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列 質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立于染色體 DNA 自主復(fù)制 松弛復(fù)制型的質(zhì)?？捎寐让顾?cái)U(kuò)增 質(zhì)粒并非其宿主細(xì)胞生長(zhǎng)所必需 011帶有多個(gè)不同種復(fù)制起始區(qū)的質(zhì)粒是 【A】 穿梭質(zhì)粒 表達(dá)質(zhì)粒 探針質(zhì)粒 整合質(zhì)粒 多拷貝質(zhì)粒 012 下列各常用載體的裝載量排列順序，正確的是 【A】 Cosmid -DNA Plasmid -DNA Cosmid Plasmid Plasmid -DNA Cosmid Cosmid Plasmid -DNA -DNA Plasmid Cosmid 013 目前在高等動(dòng)物基因工程中廣泛使用的載體是 【C】 質(zhì)粒 DNA 噬菌體 DNA 病毒 DNA 線粒體 DNA 葉綠體 DNA014 若某質(zhì)粒帶有 lacZ 標(biāo)記基因，那么與之相匹配的篩選方法是在篩選培養(yǎng)基中加入 【D】 半乳糖 葡萄糖 蔗糖 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚基 - b -D- 半乳糖苷（ X-gal ） 異丙基巰基 - b - 半乳糖苷（ IPTG ） 015質(zhì)粒是基因工程中最常用的運(yùn)載體，它的主要特點(diǎn)是【C】 能自主復(fù)制 不能自主復(fù)制 結(jié)構(gòu)很小 蛋白質(zhì) 環(huán)狀RNA 環(huán)狀DNA 能“友好”地“借居”A B C D 016 雙脫氧末端終止法測(cè)定 DNA 序列是基于 【A】 DNA 的聚合反應(yīng) DNA 的連接反應(yīng) DNA 的降解反應(yīng) 特殊的 DNA 連接酶 聚合單體 2 和 5 位的脫氧 017 下列三種方法中，能有效區(qū)分重組子與非重組子的是 【E】 I 限制性酶切 II PCR 擴(kuò)增 III 抗藥性篩選 I I + II I + III II + III I + II + III 018鳥槍法克隆目的基因的戰(zhàn)略適用于 【A】 原核細(xì)菌 酵母菌 絲狀真菌 植物 人類 019 cDNA 第一鏈合成所需的引物是 【D】 Poly A Poly C Poly G Poly T 發(fā)夾結(jié)構(gòu) 020 Taq DNA 聚合酶的發(fā)現(xiàn)使得 PCR 技術(shù)的廣泛運(yùn)用成為可能，這是因?yàn)?【D】 Taq DNA 聚合酶能有效地變性基因擴(kuò)增產(chǎn)物 Taq DNA 聚合酶催化的聚和反應(yīng)不需要引物 Taq DNA 聚合酶具有極強(qiáng)的聚和活性 Taq DNA 聚合酶能使多輪擴(kuò)增反應(yīng)連續(xù)化 Taq DNA 聚合酶能使擴(kuò)增反應(yīng)在 DNA 變性條件下進(jìn)行 021 為了利用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增下列染色體 DNA 片段上的虛線部分，應(yīng)選用的引物順序是 【D】 I + II I + III I + IV II + III II + IV 022 構(gòu)建基因文庫(kù)一般使用的載體是 【E】 I 質(zhì)粒 II-DNA III Cosmid I II III II + III I + II + III 023 強(qiáng)化基因轉(zhuǎn)錄的元件是 【C】 密碼子 復(fù)制子 啟動(dòng)子 內(nèi)含子 外顯子 024 啟動(dòng)子的特征之一是 【B】 GC 富積區(qū) TATA Box 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 長(zhǎng)度平均 1 kb 含有某些稀有堿基 025 下列基因調(diào)控元件中屬于反式調(diào)控元件的是 【A】 阻遏蛋白 啟動(dòng)子 操作子 終止子 增強(qiáng)子 026包涵體是一種 【E】 受體細(xì)胞中難溶于水的蛋白顆粒 大腸桿菌的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu) 噬菌體或病毒 DNA 的體外包裝顆粒 用于轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞的脂質(zhì)體 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的混合物 027 外源基因在大腸桿菌中以融合蛋白的形式表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)是 【】 I 融合基因能穩(wěn)定擴(kuò)增 II 融合蛋白能抗蛋白酶的降解 III 表達(dá)產(chǎn)物易于親和層析分離 III I + II I + III II + III I + II + III 028 第二代基因工程是指 【C】 途徑工程 代謝工程 蛋白質(zhì)工程 RNA 基因工程 細(xì)胞器基因工程 029 基因工程菌中重組質(zhì)粒的丟失機(jī)制是 【】 重組質(zhì)粒滲透至細(xì)胞外 重組質(zhì)粒被細(xì)胞內(nèi)核酸酶降解 重組質(zhì)粒在細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配 重組質(zhì)粒殺死受體細(xì)胞 重組質(zhì)粒刺激受體細(xì)胞提高其通透性 030利用毛細(xì)管作用原理，將凝膠電泳分離后的DNA片段轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上并根據(jù)核酸雜交原理進(jìn)行分析的技術(shù)是【】 Western 印跡轉(zhuǎn)移技術(shù) Northern 印跡轉(zhuǎn)移技術(shù) 基因的表現(xiàn)型分析法 Southern 印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)031在翻譯過程中mRNA必需首先與核糖體相結(jié)合才能進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。在原核生物中，mRNA分子上有兩個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)是起始密碼AUG，另一個(gè)是【】 啟動(dòng)子 調(diào)節(jié)基因 SD序列 終止子二、填空題答案1、型限制性內(nèi)切酶可特異性地識(shí)別 呈雙重螺旋對(duì)稱結(jié)構(gòu)的特定雙鏈DNA序列 并進(jìn)行切割。如Bst B(TT CGAA）消化可產(chǎn)生 含5 CG 3的5磷?；损ば阅┒?末端，Pst （CTGCA G）消化可產(chǎn)生5TGCA 3的3OH端黏性末端，而Sma（CCC GGG）消化產(chǎn)生 平 末端。2、識(shí)別順序相同但切割位點(diǎn)不同者稱 同位 酶，識(shí)別順序與切割方式均相同者稱 同裂 酶，來源與識(shí)別順序均不同，但切割后形成的限制性片段有相同的粘性末端，稱 同尾 酶。3、受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許有外源DNA的載體分子通過，這種細(xì)胞稱為 感受態(tài)細(xì)胞 。4、在翻譯過程中，mRNA必需首先與核糖體相結(jié)合才能進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。在原核生物中，mRNA分子上有兩個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)是 起始密碼AUG ，另一個(gè)是 SD序列 。5、在提取分離DNA的過程中，加入酚-氯仿、去垢劑或酶的目的是 使蛋白質(zhì)變性或水解，除去蛋白質(zhì) ，使用金屬離子螯合劑如EDTA等的原因 是細(xì)胞內(nèi)有金屬離子，如Mg2+，是酶活性的輔助因子，會(huì)使DNA被DNase分解，故除去使DNase活性的Mg2+以保護(hù)DNA不被變性或降解 。在小批量堿變性提取質(zhì)粒過程中加入醇溶液的目的是 是DNA變性沉淀，并除去蛋白質(zhì)、糖類等其他水溶性雜質(zhì)，使之分離 ，加入Rnase的目的是 除去DNA沉淀中的RNA，是凝膠電泳檢測(cè)時(shí)條帶更明顯 。6、PCR的全稱是 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ，它是一種在體外模擬DNA復(fù)制方式選擇性地?cái)U(kuò)增DNA特殊區(qū)域的技術(shù)。它是在四種 脫氧核苷三磷酸 存在下，以寡聚核苷酸為引物及 單鏈DNA 為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成DNA互補(bǔ)鏈的過程，其基本反應(yīng)步驟為 高溫變性 、 低溫退火 和 適溫延伸 ，并循環(huán)n次，達(dá)到擴(kuò)增目的。7、采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子或其他生物樣品有序地固化于支持物表面，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，通過特定儀器對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量的技術(shù)稱為 生物芯片技術(shù) ，根據(jù)固定的探針不同，可分為 基因芯片 、 蛋白芯片 、 細(xì)胞芯片 和組織芯片。該技術(shù)具有高通量、快速高效、高度靈敏等特點(diǎn)。8、根據(jù)Southern blot的結(jié)果可以說明 被檢測(cè)樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等 ，Northern blot 則用于 檢測(cè)樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量 ，而Western blot的結(jié)果可以明 被檢測(cè)基因在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)狀況 。9、基因工程中用來獲得有功能的異源蛋白質(zhì)的體系稱為 表達(dá)系統(tǒng) 。10、用火藥爆炸或者高壓氣體加速將包裹了DNA的球狀金粉或者鎢粉顆粒直接送入完整的植物組織或者細(xì)胞中，這一方法稱為 基因槍法 。基因工程課程習(xí)題 問答題1、 基因工程的操作過程的主要步驟包括哪些？切、接、轉(zhuǎn)、增、篩（檢）（1）切獲得DNA片段，取得目的基因；載體的選擇與制備。方法：從生物基因組中分離得到基因組DNA 酶切產(chǎn)物 從總RNA中分離得到mRNA ，再逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA 人工合成化學(xué)合成；PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）（2） 接DNA片段和載體DNA在體外連接，形成重組子。（3） 轉(zhuǎn)將重組的DNA引入宿主細(xì)胞方式：轉(zhuǎn)化某一基因型細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收另一基因型細(xì)胞的DNA，而使其基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象；轉(zhuǎn)染除去蛋白質(zhì)外殼的病毒核酸感染細(xì)胞或原生質(zhì)體的過程；轉(zhuǎn)導(dǎo)用噬菌體做載體，將一個(gè)細(xì)胞的基因傳遞給另一個(gè)細(xì)胞的過程。還有顯微注射等。（4）增培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使目的基因在其中進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增，并將其整合到受體細(xì)胞的基因組中。（5）篩、檢重組子的篩選與鑒定。篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得使外源基因高效表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞。2、什么是限制性核酸內(nèi)切酶？第二型限制酶有何特點(diǎn)？限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶，restriction endonuclease）是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并對(duì)DNA分子進(jìn)行切割的核酸內(nèi)切酶。第二型限制酶特點(diǎn):2亞基，單輔因子;識(shí)別序列是由4、5、6或7個(gè)核苷酸組成的特定核苷酸序列，識(shí)別位點(diǎn)雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)，切割與識(shí)別位點(diǎn)相同或相近。分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，不需ATP。3、分析影響限制性內(nèi)切酶酶切的因素有哪些？（1）溫度：大部分限制性內(nèi)切酶最適反應(yīng)溫度為37，少數(shù)酶高于或低于這個(gè)溫度。（2）時(shí)間：合適，大多為1 h，可過夜反應(yīng)。（3）溶液體系：要求有穩(wěn)定的pH環(huán)境。標(biāo)準(zhǔn)的緩沖溶液中含有氯化鈣、氯化鎂或氯化鉀、Tris-HCl、-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）以及牛血清蛋白質(zhì)（BSA）和Mg2+，具有一定的酸堿值即pH值。（4）鹽離子濃度：不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)鹽離子強(qiáng)度（Na+）有不同的要求，一般按離子強(qiáng)度不同分為低（0mmol/L）、中（50mmol/L）、高鹽（100mmol/L）三類。Mg2+也是限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)所需。（5）反應(yīng)體積和甘油濃度：在進(jìn)行酶切反應(yīng)時(shí)，加酶的體積一般不超過總反應(yīng)的10%，若加酶體積太大，甘油濃度過高，則會(huì)影響酶切反應(yīng)。（6）DNA的純度和結(jié)構(gòu)：DNA樣品中所含的蛋白質(zhì)、有機(jī)溶劑及RNA等雜質(zhì)均會(huì)影響酶切反應(yīng)速度和酶切的完全度，酶切的底物一般是雙鏈DNA，DNA的甲基化位置會(huì)影響酶切反應(yīng)。4、一個(gè)典型的原核表達(dá)質(zhì)粒的主要元件有哪些？基因工程P53能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的序列即復(fù)制子；控制轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子如lac、trp等；選擇標(biāo)記的編碼序列如各種抗生素抗性基因；多克隆位點(diǎn)（MCS）；轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，如一個(gè)合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子ATG等。5、以人工構(gòu)建的pBR322質(zhì)粒為例說明基因工程載體的特點(diǎn)。v 有多個(gè)限制性內(nèi)切酶單一位點(diǎn)（EcoR，Hind等） v 四環(huán)素抗性基因Tetr和氨芐青霉素抗性基因Ampr ，且Tetr中有BamH I（GGATCC）切點(diǎn)，Ampr中有Pst切點(diǎn)（CTGCAG）和Sal I切點(diǎn)（GTCGAC）。 可以通過Ampr Tets來篩選重組體。插入失活篩選原理。v 在細(xì)胞中是多拷貝的，是松弛型復(fù)制子。v 具有復(fù)制起始點(diǎn)（ori)。v 分子量較小，安全。6、小批量堿變性提取質(zhì)粒DNA的原理與基本過程如何？堿變性法是常用的質(zhì)粒抽提方法，其原理是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。 小批量堿變性提取質(zhì)粒DNA的基本過程為 （1）酶或機(jī)械法等方法破壞細(xì)胞，釋放出胞內(nèi)物質(zhì)； （2）加堿使DNA與蛋白質(zhì)變性，加中和液復(fù)性。因?yàn)橘|(zhì)粒DNA分子量小易復(fù)性，從而使得其與基因組DNA分離； （3）在上清液中通過酚氯仿抽提、去垢劑或酶使剩余蛋白質(zhì)變性或水解，除去蛋白質(zhì)； （4）再加入醇溶液使質(zhì)粒DNA變性沉淀而與其他水溶性物質(zhì)分離； （5）將沉淀溶解于有RNase的TE溶液中，溫育降解RNA后電泳檢測(cè)、-20 保存。7、什么是基因文庫(kù)？基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)制備方法有何區(qū)別？通過克隆技術(shù)將大分子DNA編碼的全部或者絕大多數(shù)基因或基因組進(jìn)行擴(kuò)增后的DNA片段混合物，稱為基因文庫(kù)或DNA文庫(kù)、克隆庫(kù)。分為基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)兩種?；蚪MDNA文庫(kù)的制備：從生物組織細(xì)胞提取出全部DNA，用物理方法（超聲波、攪拌剪力等）或酶法（限制性核酸內(nèi)切酶的不完全酶解）將DNA降解成預(yù)期大小的片段，然后將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體、粘粒或YAC載體）連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞，這樣每一個(gè)細(xì)胞接受了含有一個(gè)基因組DNA片段與載體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起組成一個(gè)含有基因組各DNA片段克隆的集合體，就是基因組文庫(kù)。cDNA文庫(kù)的制備：提取出組織細(xì)胞的全部mRNA，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起組成包含著某細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。8、PCR的定義、原理、方法？在生命科學(xué)領(lǐng)域有何具體用途？ 一種在體外模擬DNA復(fù)制方式選擇性的擴(kuò)增DNA特殊區(qū)域的技術(shù)，又稱為無(wú)細(xì)胞克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法。是在四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸為引物及單鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成DNA互補(bǔ)鏈的過程。原理與方法:1. 高溫變性 雙鏈DNA在高溫下解鏈（變性）變成單鏈的過程;2. 低溫退火 降溫后變性的單鏈DNA可按照A=T, C三G 特異性配對(duì)的原則重新結(jié)合恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu); 同模板DNA特異性互補(bǔ)結(jié)合的引物的結(jié)合3. 適溫延伸 DNA聚合酶的酶促作用, 即可沿引物DNA的5向3末端合成、延長(zhǎng)與模板互補(bǔ)的核苷酸鏈;4.循環(huán)n次。用途： 1. 特異性擴(kuò)增目的（模板）DNA。 2. 特異性檢測(cè)目的RNA（如表達(dá)水平）（通過反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)） 3. 用于基因重組（擴(kuò)增特定DNA片段） 4. 制備特異性探針 5. 用于DNA測(cè)序 6. 用于基因定位分析 7. 通過誘變寡核苷酸引物產(chǎn)生各種突變體 8. 用于分析基因組DNA的多態(tài)性(Random Amplified Poly-morphic DNA = RAPD) 9. 構(gòu)建cDNA或基因組DNA文庫(kù) （從mRNA或基因組DNA中） 10.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：DNA或RNA的絕對(duì)定量分析 9、瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理是什么？瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，具親水性，但不帶電荷，是一種很好的電泳支持物。 DNA分子在瓊脂糖凝膠中時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。 DNA分子在高于等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下, DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)。 具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。 相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子泳動(dòng)速度不一樣。10、什么是原位雜交技術(shù)？其基本過程如何？根據(jù)核酸雜交原理，利用基因探針檢出培養(yǎng)板上重組轉(zhuǎn)化體菌落位置的技術(shù)?；具^程：（1）將硝酸纖維素濾膜鋪放在生長(zhǎng)著轉(zhuǎn)化菌落的平板表面，使其中的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上。 （2）取出濾膜，作溶菌、堿變性（0.5mol/L NaOH）， 酸中和（Tris.Cl pH7.4）等處理后，轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上，置于室溫2030min，使濾膜干燥。將濾膜夾在兩張干的濾紙之間，在真空烤箱中于80烘烤2h，固定DNA。 （3）帶有DNA印跡的濾膜同32P標(biāo)記的適當(dāng)探針雜交、以檢測(cè)帶有重組質(zhì)粒（含有被研究的DNA插入片段）的陽(yáng)性菌落。（4）將放射自顯影的X光底片同保留下來的原菌落平板對(duì)照，從中挑出陽(yáng)性菌落供作進(jìn)一步的分析研究。11、什么是啟動(dòng)子?什么是SD序列？啟動(dòng)子(promoter，P)：是指能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列(40bp-60bp) 。富含A-T堿基對(duì)，具有保守序列：-10區(qū)（pribnow box）：TATAAT；-35區(qū)： 不同的啟動(dòng)子的效率不同，強(qiáng)啟動(dòng)子指導(dǎo)產(chǎn)生較多量的mRNA，弱啟動(dòng)子指導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄合成的mRNA很少。啟動(dòng)子的強(qiáng)度主要決定于啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)。原核生物RNA聚合酶不能識(shí)別真核細(xì)胞啟動(dòng)子，因此真核基因在原核生物表達(dá)時(shí)，應(yīng)將真核基因置于原核生物強(qiáng)啟動(dòng)子下，以實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)錄。 在原核生物中，mRNA起始密碼子AUG上游3-11bp處一段能與16SrRNA3端序列互補(bǔ)的富含嘌呤的堿基序列稱為SD序列(SD sequence）。mRNA分子上有兩個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)是起始密碼AUG，另一個(gè)是起始密碼AUG上游處的一段的序列后者稱為SD序列。 12、什么是操縱子？請(qǐng)用簡(jiǎn)圖表示操縱子的基本結(jié)構(gòu)并以乳糖操縱子負(fù)調(diào)控系統(tǒng)（阻遏蛋白調(diào)控作用）為例說明其功能。 操縱子是原核生物轉(zhuǎn)錄單位。操縱子組成為結(jié)構(gòu)基因連同其上游的調(diào)控序列(啟動(dòng)子 promotor P、操縱基因operator O、其他調(diào)節(jié)序列)共同構(gòu)成一個(gè)操縱子。無(wú)誘導(dǎo)物（乳糖）時(shí)，阻遏物基因I產(chǎn)生的阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，位點(diǎn)關(guān)閉， RNA多聚酶通不過，轉(zhuǎn)錄不進(jìn)行，基因關(guān)閉；有誘導(dǎo)物（乳糖）時(shí)，誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，阻遏蛋白失活，從o點(diǎn)脫離，o位點(diǎn)打開，RNA多聚酶通過，Z、Y、A轉(zhuǎn)錄。即基因表達(dá)。13、為什么用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)真核生物的蛋白質(zhì)時(shí)，克隆的真核基因不能來自基因組文庫(kù)？真核基因應(yīng)如何獲得？ 對(duì)真核細(xì)胞來說，從基因組DNA文庫(kù)獲得的基因與從cDNA文庫(kù)獲得的不同，基因組DNA文庫(kù)所含的是帶有含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫(kù)中獲得的是已經(jīng)過剪接、去除了內(nèi)含子的cDNA。因?yàn)樵思?xì)胞不具有mRNA轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能進(jìn)行剪接、去除內(nèi)含子等操作，所以 用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)真核生物的蛋白質(zhì)時(shí)，克隆的真核基因不能來自基因組文庫(kù)，應(yīng)從cDNA文庫(kù)中獲得，或者通過提取mRNA后RT-PCR方法獲得。 14、如何提高真核基因在原核宿主中的表達(dá)效率？（1）選擇合適載體，提高翻譯水平 n 強(qiáng)啟動(dòng)子提高轉(zhuǎn)錄水平n 核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ATG-SD）距離合適 在基因重組過程中應(yīng)將結(jié)構(gòu)基因接于SD序列之后以便為mRNA提供核糖體結(jié)合位點(diǎn)，提高真核基因表達(dá)效率。n 避免產(chǎn)物降解 ：分泌/融合表達(dá)；（融合蛋白表達(dá)后再去除原核肽段）（2）選擇合適宿主(如 Lac 啟動(dòng)子LacI菌；PL/PRCI857溶源菌)（3）調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞代謝 為保持宿主正常生長(zhǎng)速度及重組轉(zhuǎn)化體穩(wěn)定性，維持產(chǎn)物的高效表達(dá)，必需采用適當(dāng)方法，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝。目前，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝方法很多。如營(yíng)養(yǎng)物濃度控制、產(chǎn)物誘導(dǎo)表達(dá)、載體誘導(dǎo)復(fù)制及促進(jìn)產(chǎn)物分泌等。15、什么是基因診斷？基因診斷中常用的方法有哪些？試簡(jiǎn)述其中一種方法的原理。基因診斷是指用分子生物學(xué)的技術(shù)對(duì)引起疾病的原因遺傳基因、致病微生物和寄生蟲,以及某些惡性腫瘤在基因水平上進(jìn)行病原學(xué)和細(xì)胞遺傳基因的檢測(cè)和分析。基因診斷中常用的方法有核酸分子雜交、PCR、DNA芯片技術(shù)、限制酶酶譜分析和DNA序列測(cè)定等。 核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一。它的基本原理是：互補(bǔ)的核酸單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進(jìn)行雜交。它不僅能在DNA和DNA之間進(jìn)行，也能在DNA和RNA之間進(jìn)行。因此，當(dāng)用一段已知基因的核酸序列作探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時(shí)，如果兩者的堿基完全配對(duì)，它們即互補(bǔ)地結(jié)合成雙鏈，從而表明被測(cè)基因組DNA中含有已知的基因序列。16、名詞解釋：基因探針 基因芯片 蛋白質(zhì)工程基因探針（probe）：就是一段與目的基因DNA互補(bǔ)的帶有能檢測(cè)標(biāo)記物的特異核苷酸序列，它可以包括整個(gè)基因，也可以僅僅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。基因芯片(gene chip)：又稱DNA芯片，是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段有規(guī)律地排列固定于支持物上，樣品DNA/ RNA通過PCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子，然后按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè)，從而迅速得出所要的信息。 蛋白質(zhì)工程：是指在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)上,借助計(jì)算機(jī)等輔助設(shè)計(jì)來確定某一蛋白質(zhì)分子的改造方案。然后通過基因改造和基因工程技術(shù)獲得新的蛋白質(zhì)分子。17、簡(jiǎn)述包含體形成的原因和包含體蛋白復(fù)性的主要步驟。重組蛋白在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)，尤其當(dāng)表達(dá)目的蛋白量超過細(xì)菌體總蛋白量10%時(shí)，會(huì)在細(xì)胞內(nèi)與細(xì)菌雜蛋白、核酸等成分聚集成沒有生物活性的直徑0.1-0.3m的固體顆粒，這種不溶性聚合體即包含體（inclusion body）。生成包含體的原因可能有是蛋白質(zhì)合成速度太快，多肽鏈相互纏繞，影響了多肽鏈的正確折疊，導(dǎo)致疏水基團(tuán)外露等。 （包含體的形成有利于防止蛋白酶對(duì)表達(dá)蛋白的降解，并且非常有利于分離表達(dá)產(chǎn)物。但包含體形成后，表達(dá)蛋白不具有生物活性，因此必須溶解包含體并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行復(fù)性。）包含體復(fù)性即從伸展態(tài)中間體后期中間體天然態(tài)的過程，操作步驟一般為用超聲波、勻漿等使菌體破碎后，離心得到包含體加入強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑如6 8molL鹽酸胍或910molL尿素溶解包含體用透析、稀釋和超濾復(fù)性法等等方法使之正確折疊。18、列表比較大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)。以下為某同學(xué)作業(yè)答案，供參考表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)（1）對(duì)大腸桿菌的背景知識(shí)，特別是基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有深刻了解；（2）是一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體；（3）許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效、高水平的表達(dá)；（4）大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，易用于批量生產(chǎn)。（1）缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制，只能表達(dá)克隆的cDNA,不宜表達(dá)真核基因組DNA；（2）缺乏翻譯后加工機(jī)制，許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數(shù)的這類修飾作用在細(xì)菌細(xì)胞中并不存在；（3）表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包含體，需作復(fù)性處理；（4）難于表達(dá)大量可溶性蛋白。酵母表達(dá)系統(tǒng)（1）基因背景了解清楚，上游操作簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)迅速，非常適于大規(guī)模發(fā)酵。（2）具有一定的加工及修飾能力：如二硫鍵的正確形成，前體蛋白的水解加工。表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白相同或類似。（3）可將異源蛋白基因與N-末端前導(dǎo)肽等信號(hào)肽融合，指導(dǎo)新生肽的分泌，在分泌中可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行糖基化修飾，但其修飾糖鏈與高等真核細(xì)胞并不相同。（4）可移去起始甲硫氨酸，避免了作為藥物使用可能引起的免疫反應(yīng)問題。 （1）產(chǎn)糖量過多因而損壞蛋白質(zhì)的生物活性、安全性等；（2）糖基化修飾與高等真核細(xì)胞并不相同。 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（1）表達(dá)效率高。重組蛋白的表達(dá)水平最高可達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50。（2）屬于真核表達(dá)系統(tǒng)。有糖基化作用、脂肪酸?；饔?、氨基末端乙酰化作用以及磷酸化，有利于表達(dá)產(chǎn)物形成天然的高級(jí)結(jié)構(gòu)，保持原有的生物活性與功能。（3）桿狀病毒能容納較大的外源基因而不影響其本身的增殖。（4）桿狀病毒屬于昆蟲病毒。具有高度特異的宿主范圍，對(duì)脊椎動(dòng)物和植物均無(wú)致病性。病毒重組因失去多角體保護(hù)，在自然界的生存能力很弱，因此比較安全。（5）應(yīng)用晚期多角體蛋白基因啟動(dòng)子表達(dá)外源基因可表達(dá)毒性蛋白。（6）桿狀病毒表達(dá)載體通用性廣?？杀磉_(dá)來自病毒、細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物幾乎所有的蛋白，并且能表達(dá)帶有內(nèi)含子的外源基因。（7）重組桿狀病毒除在體外昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)外源基因外，還能感染昆蟲活體，在體內(nèi)高效表達(dá)外源蛋白。（1）宿主細(xì)胞生長(zhǎng)慢、 培養(yǎng)基昂貴、 含有免疫宿主蛋白、 桿狀病毒感染會(huì)導(dǎo)致宿主死亡、因此每一輪蛋白合成均需重新感染。（2）昆蟲細(xì)胞內(nèi)的糖基化方式與脊椎動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的糖基化方式有一定的差異，其糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)多為簡(jiǎn)單的不分支結(jié)構(gòu)。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) （1）產(chǎn)物的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白質(zhì)最接近，糖基化等后加工最精確。（2）一般會(huì)產(chǎn)生正確加工的、有活性的蛋白。該表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)水平較低、培養(yǎng)基昂貴、生長(zhǎng)緩慢、含有過敏物質(zhì)等缺點(diǎn)在實(shí)際應(yīng)用過程中較難避免。19、利用基因工程菌生產(chǎn)有哪些特點(diǎn)？有什么優(yōu)勢(shì)？常用的宿主菌有哪些？基因工程菌帶有外源基因，這些基因可能不穩(wěn)定。丟失外源基因的菌往往比未丟失的菌生長(zhǎng)快得多，這樣就會(huì)大大降低產(chǎn)物的表達(dá)。為了抑制基因丟失的菌的生長(zhǎng)，一般在培養(yǎng)中加入選擇壓力，如抗生素?；蚬こ叹呐囵B(yǎng)一般分兩段。前期是菌體生長(zhǎng)，生長(zhǎng)到某一階段，加入誘導(dǎo)因子，誘發(fā)產(chǎn)物表達(dá)。利用基因工程菌生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在目的產(chǎn)物產(chǎn)量高，表達(dá)調(diào)控性好，可根據(jù)目的產(chǎn)物特點(diǎn)構(gòu)建各種表達(dá)系統(tǒng)，等等。常用宿主菌有大腸桿菌（如BL21(DE3)plysS菌株）、酵母菌（如Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae等）、枯草芽孢桿菌等。20、在基因工程菌培養(yǎng)過程中為什么質(zhì)粒會(huì)丟失？（1）分離的不穩(wěn)定性：細(xì)胞分裂過程中，有一個(gè)子細(xì)胞沒有獲得質(zhì)粒 DNA拷貝，并最終增殖成為無(wú)質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體。即在細(xì)胞分裂過程中發(fā)生的質(zhì)粒不平均的分配，導(dǎo)致質(zhì)粒丟失，亦叫做質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性。 （2）培養(yǎng)體系中因?yàn)楦鞣N原