2020高中生物專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)教案新人教版.docx

課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)學習目標1.明確培養(yǎng)基對微生物進行選擇的原理。2.學會統(tǒng)計微生物數(shù)量的方法。3.能進行實驗設(shè)計與操作，并對實驗結(jié)果進行分析和評價。知識點一篩選微生物的研究思路知識梳理1.菌株篩選(1)自然界中目的菌株的篩選篩選的依據(jù)：根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。實例：從熱泉中篩選出Taq細菌。熱泉7080 的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物，而使耐熱的Taq_細菌脫穎而出。(2)實驗室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。方法：利用選擇培養(yǎng)基篩選。(3)選擇培養(yǎng)基概念：在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱為選擇培養(yǎng)基。制備原理：根據(jù)不同微生物的特殊營養(yǎng)要求或其對某化學、物理因素的抗性不同而制備培養(yǎng)基。制備方法：a在培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì)。例如，加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌；加入高濃度的食鹽可以得到金黃色葡萄球菌。b改變培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分。例如，缺乏氮源時可以分離固氮微生物；石油作為唯一碳源時，可以分離出能消除石油污染的微生物；用含無機碳源的培養(yǎng)基分離自養(yǎng)型微生物；尿素作為唯一氮源時，可以分離出能分解尿素的微生物。c改變微生物的培養(yǎng)條件。例如，將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)可以得到耐高溫的微生物；用普通培養(yǎng)基在無氧條件下分離厭氧型和兼性厭氧型微生物。(4)分離分解尿素的細菌的培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成提供的營養(yǎng)或作用KH2PO4 1.4 g無機鹽Na2HPO4 2.1 gMgSO47H2O 0.2 g葡萄糖10.0 g碳源尿素1.0 g氮源、碳源瓊脂15.0 g凝固劑用蒸餾水定容至1000 mL水從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于固體培養(yǎng)基，是由于加入了凝固劑瓊脂。從功能上看屬于選擇培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基的氮源只有尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解并利用尿素；缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長繁殖，受到抑制，所以，用該培養(yǎng)基能夠篩選出分解尿素的微生物。2統(tǒng)計菌落數(shù)目(1)活菌統(tǒng)計法：稀釋涂布平板法。原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌?；罹鷶?shù)計算方法：每克樣品中的菌株數(shù)(CV)M。C：代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V：代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)；M：代表稀釋倍數(shù)。統(tǒng)計方法：為了保證結(jié)果準確，一般設(shè)置35個平板，選擇菌落數(shù)在30300的平板進行計數(shù)，并取其平均值。統(tǒng)計菌落數(shù)往往比活菌實際數(shù)目低的原因：當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。(2)總菌計數(shù)法：顯微鏡直接計數(shù)法。此方法需用特定的血細胞計數(shù)板進行計數(shù)，此方法不能區(qū)分細菌的死活。3設(shè)置對照(1)對照實驗：除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗。(2)主要目的：排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。如設(shè)置空白培養(yǎng)基作為對照組，觀察培養(yǎng)基是否有雜菌污染。1.能在選擇培養(yǎng)基上生長的一定是目的菌嗎？提示：不一定。原則上選擇培養(yǎng)基只能允許特定種類的微生物生長，但實際上，微生物的培養(yǎng)是一個非常復(fù)雜的問題，有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物生長繁殖，因此能在選擇培養(yǎng)基上生長的微生物不一定都是所需的微生物，還需進一步的鑒定。2教材提供的案例中A同學的結(jié)果與其他同學不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同，二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。如何設(shè)置對照實驗來確定原因？提示：方案一：其他同學用與A同學一樣的土樣進行實驗，如果結(jié)果與A同學一致，則證明A同學操作無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。方案二：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照實驗的設(shè)置是必不可少的。典題分析題型一選擇培養(yǎng)基的選擇作用例1在缺乏氮源的培養(yǎng)基上，大部分微生物無法生長；在培養(yǎng)基中加入青霉素可以抑制細菌和放線菌的生長；在培養(yǎng)基中加入10%的酚可以抑制細菌和霉菌的生長。利用上述選擇培養(yǎng)基依次能從混雜的微生物群體中分離出()A乳酸菌、金黃色葡萄球菌、放線菌B固氮細菌、大腸桿菌、放線菌C固氮細菌、霉菌、放線菌D固氮細菌、金黃色葡萄球菌、放線菌解題分析固氮細菌可以在無氮培養(yǎng)基上生長；青霉素可以抑制細菌和放線菌的生長，但不會抑制霉菌的生長；加入10%的酚的培養(yǎng)基可以抑制細菌和霉菌的生長，但不會抑制放線菌的生長。答案C題后歸納選擇培養(yǎng)微生物的兩種方法(1)可利用該分離對象對某一營養(yǎng)物質(zhì)有“嗜好”的原理，專門在培養(yǎng)基中加入該營養(yǎng)物質(zhì)，從而使它成為一種加富培養(yǎng)基。(2)可利用該分離對象對某種抑菌物質(zhì)的抗性，在混合培養(yǎng)物中加入該抑菌物質(zhì)，經(jīng)培養(yǎng)后，其他微生物生長受抑制，而分離對象卻可大量增殖，在數(shù)量上占優(yōu)勢。題型二統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法剖析例2自然界中的微生物往往是混雜生長的。人們在研究微生物時一般要將他們分離提純，然后進行數(shù)量測定。下面是對大腸桿菌進行數(shù)量測定的實驗，請回答有關(guān)問題。步驟如下：制備稀釋倍數(shù)為102、103、104、105、106的系列稀釋液。對大腸桿菌進行計數(shù)，應(yīng)選用_法接種樣品。適宜溫度下培養(yǎng)。結(jié)果分析：(1)測定大腸桿菌數(shù)目時，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計結(jié)果，與事實更加接近的是_。A一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是230B兩個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是220和260，取平均值240C三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是21、212和256，取平均值163D四個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是210、260、240和250，取平均值240(2)一同學在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基上測得平板上菌落數(shù)的平均值為212，那么每毫升樣品中的菌落數(shù)約是(涂布平板時所用的稀釋液體積為0.2 mL)_。(3)用這種方法測定菌體密度時，實際活菌數(shù)量要比測得的數(shù)量_，因為_。(4)某同學在測定大腸桿菌的密度時發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基上還有其他雜菌的菌落，能否肯定大腸桿菌的品系被污染了？為什么？_。解題分析若對大腸桿菌進行計數(shù)，則需要用稀釋涂布平板法接種樣品。(1)為保證結(jié)果準確，一般設(shè)置35個平板，選擇菌落數(shù)在30300的平板進行計數(shù)，取其平均值。(2)2120.21061.06109(個)。(3)因為菌落可能由1個或多個細菌連在一起繁殖而成，所以實際活菌數(shù)量要比測得的數(shù)量多。(4)雜菌的出現(xiàn)可能是由于培養(yǎng)基滅菌不徹底或在培養(yǎng)過程中感染了雜菌。答案步驟：稀釋涂布平板(1)D(2)1.06109個(3)多當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的是一個菌落(4)不能。因為不能確定雜菌的來源題后歸納兩種統(tǒng)計菌落數(shù)目方法的比較項目顯微鏡直接計數(shù)法稀釋涂布平板法(間接計數(shù)法)原理利用特定的血細胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌主要用具顯微鏡、血細胞計數(shù)板培養(yǎng)基計數(shù)依據(jù)菌體本身培養(yǎng)基上的菌落優(yōu)點計數(shù)方便、操作簡單計數(shù)的是活菌缺點死菌、活菌都計算在內(nèi)操作較復(fù)雜，統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低(當兩個或多個細胞連在一起時，在平板上觀察到的只是一個菌落)計算公式每毫升原液含菌數(shù)40010000每小格平均菌體數(shù)稀釋倍數(shù)每毫升原液含菌數(shù)某一稀釋度下培養(yǎng)基上平均菌落數(shù)涂布平板時所用稀釋液的體積稀釋倍數(shù)注：表中400、10000都是常數(shù)。題型三對照實驗的設(shè)置例3為了判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用，需要設(shè)置的對照是()A未接種的選擇培養(yǎng)基B未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基C接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基D接種了的選擇培養(yǎng)基解題分析判斷選擇培養(yǎng)基是否發(fā)揮作用，自變量即選擇培養(yǎng)基，因此對照實驗應(yīng)設(shè)置非選擇性培養(yǎng)基，其他條件保持一致，故C正確。答案C技法提升微生物分離、計數(shù)時常見的對照實驗有兩種：第一種，判斷培養(yǎng)基是否被雜菌污染，需同時將未接種的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；第二種，判斷選擇培養(yǎng)基是否有篩選作用，需同時設(shè)置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，并對其接種后培養(yǎng)，觀察兩種培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目，通過對比得出結(jié)論。知識點二實驗設(shè)計及操作知識梳理1.實驗設(shè)計及操作提示步驟實驗操作操作提示土壤取樣土壤微生物約70%90%為細菌，主要分布在距地表38 cm土壤層。要求：從富含有機質(zhì)、酸堿度接近中性土壤中取樣；取樣層：先鏟除表層土，在距地表約38_cm的土壤層取樣；將樣品裝入事先準備好的信封中取樣用的小鐵鏟和盛土樣的信封都要經(jīng)過滅菌制備培養(yǎng)基分別配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用續(xù)表步驟實驗操作操作提示樣品的稀釋和涂布稱取10 g土樣加到盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻；吸取上清液1 mL，轉(zhuǎn)移至盛有9 mL無菌水的無菌大試管中，按照上述流程進行樣品的稀釋；按照由107103稀釋度的順序分別吸取0.1 mL進行平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管應(yīng)在火焰旁稱取土樣。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞；由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍103107倍的稀釋液；實驗時要對所用的平板、試管作好標記。如培養(yǎng)皿要注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等；稀釋倍數(shù)：a.測定土壤中細菌的數(shù)量，一般選用104、105和106倍的稀釋液進行平板培養(yǎng)。b.測定放線菌的數(shù)量，一般選用103、104和105倍稀釋。c.測定真菌的數(shù)量，一般選用102、103和104倍稀釋培養(yǎng)觀察將平板倒置于3037 溫度下培養(yǎng)12 d，每隔24 h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目不同微生物往往需要不同的培養(yǎng)溫度和時間一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下，同一種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，包括菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等方面計數(shù)選取菌落數(shù)在30300的平板進行計數(shù)。在同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復(fù)計數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計算出樣品中細菌的數(shù)目選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目2結(jié)果分析與評價內(nèi)容現(xiàn)象結(jié)論有無雜菌污染的判斷對照的培養(yǎng)皿中無菌落生長未被雜菌污染培養(yǎng)物中菌落數(shù)偏高被雜菌污染菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高培養(yǎng)物中混入其他氮源選擇培養(yǎng)基的篩選作用牛肉膏培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目大于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目選擇培養(yǎng)基具篩選作用樣品的稀釋操作得到2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板操作成功重復(fù)組的結(jié)果若選取同一種土樣，統(tǒng)計結(jié)果應(yīng)接近3菌種鑒定(1)原理：CO(NH2)2H2OCO22NH3，分解尿素的細菌合成的脲酶將尿素分解為氨，使培養(yǎng)基的堿性增強，pH升高。(2)方法：在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細菌，若指示劑變紅，可初步鑒定該種細菌能夠分解尿素。1.不同的微生物培養(yǎng)的溫度和時間相同嗎？提示：不相同。細菌一般在3037 溫度下培養(yǎng)12 d；放線菌一般在2528 溫度下培養(yǎng)57 d；霉菌一般在2528 溫度下培養(yǎng)34 d。2為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？提示：這是因為土壤中各類微生物的數(shù)量(單位：株/g)是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中，好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應(yīng)當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。3菌落計數(shù)時，除了采用稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數(shù)法外，還可以采用什么方法？舉例說明。提示：細菌的數(shù)目還可以通過濾膜法來測定。以測定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目為例：將已知體積的水過濾后，將濾膜放在伊紅美藍培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在該培養(yǎng)基上，大腸桿菌的菌落呈現(xiàn)黑色。可以根據(jù)培養(yǎng)基上黑色菌落的數(shù)目，計算出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。典題分析題型四分解尿素的細菌的分離與鑒定例4如表為培養(yǎng)某種微生物的培養(yǎng)基配方，請回答有關(guān)問題：KH2PO4Na2HPO4MgSO47H2O葡萄糖尿素蒸餾水1.4 g2.1 g0.2 g10.0 g1.0 g定容至1000 mL(1)該培養(yǎng)基只允許分解尿素的細菌生長，這種培養(yǎng)基稱為_培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基會抑制其他種類微生物生長，其原因是該培養(yǎng)基_。(2)“目的菌”生長所需的氮源和碳源分別來自培養(yǎng)基中的_和_，實驗需要振蕩培養(yǎng)，原因是_。(3)若要通過統(tǒng)計培養(yǎng)基中菌落數(shù)來估計樣品中的細菌數(shù)，上述培養(yǎng)基中還需要添加的成分是_，接種時應(yīng)采用_法。(4)從土壤中分離出分解尿素的細菌后，要對其作進一步的鑒定，可在上述培養(yǎng)基中加入_指示劑，培養(yǎng)該菌后，如果指示劑變_，可初步鑒定該種細菌能夠分解尿素。(5)某同學用0.1 mL稀釋液在稀釋倍數(shù)為106的平板中測得菌落數(shù)的平均值為163，則每毫升樣品中的細菌數(shù)是_。解題分析(1)該培養(yǎng)基以尿素為唯一氮源，只允許分解尿素的細菌生長，不能利用尿素的細菌不能在該培養(yǎng)基上生長，這種培養(yǎng)基叫作選擇性培養(yǎng)基。(2)“目的菌”生長所需的氮源和碳源分別來自培養(yǎng)基中的尿素和葡萄糖，分解尿素的微生物是需氧型生物，所以在培養(yǎng)過程中需振蕩。(3)若要通過統(tǒng)計培養(yǎng)基中菌落數(shù)來估計樣品中的細菌數(shù)，需用固體培養(yǎng)基，故上述培養(yǎng)基中還需要添加的成分是瓊脂，接種時應(yīng)采用稀釋涂布平板法。(4)由于細菌分解尿素的過程中產(chǎn)生了氨，氨使培養(yǎng)基的pH升高，要對其作進一步的鑒定，可在上述培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)該菌后，如果指示劑變紅，可初步鑒定該種細菌能夠分解尿素。(5)某同學用0.1 mL稀釋液在稀釋倍數(shù)為106的平板中測得菌落數(shù)的平均值為163，則每毫升樣品中的細菌數(shù)為1630.11061.63109(個)。答案(1)選擇以尿素為唯一的氮源，不能利用尿素的細菌不能在該培養(yǎng)基上生長(2)尿素葡萄糖為“目的菌”提供氧氣(3)瓊脂稀釋涂布平板(4)酚紅紅(5)1.63109個技法提升微生物的篩選與鑒別方法(1)微生物的篩選方法單菌落挑取法利用平板劃線法或稀釋涂布平板法接種到固體平板培養(yǎng)基表面，直接根據(jù)微生物菌落的特征利用單菌落挑取的方法獲得目的微生物選擇培養(yǎng)法利用選擇培養(yǎng)基對微生物進行選擇培養(yǎng)，直接獲得目的微生物鑒定培養(yǎng)法利用鑒別培養(yǎng)基使目的微生物菌落呈現(xiàn)特有的特征，然后篩選目的微生物(2)微生物的鑒別方法菌落特征鑒別法根據(jù)微生物在固體平板培養(yǎng)基表面形成的菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等特征進行鑒別指示劑鑒別法如在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種微生物后，培養(yǎng)基變紅說明該種微生物能夠分解尿素染色鑒別法如在培養(yǎng)基中加入伊紅美藍，根據(jù)培養(yǎng)基中是否出黑色菌落來篩選大腸桿菌課堂小結(jié)當堂檢測查漏補缺鞏固提升1土壤中分解尿素的微生物所需氮源為()A硝酸 B氨 C尿素 D蛋白胨答案C解析只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源使其生長、發(fā)育及繁殖受到抑制，所以，以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基能夠選擇出分解尿素的微生物。2某同學對101、102、103倍稀釋液中的細菌進行計數(shù)，平均菌落數(shù)分別是2760、295和16，則菌落總數(shù)為(所用稀釋液體積為0.1 mL)()A2.76104個/mLB2.95105個/mLC4.6104個/mLD3.775104個/mL答案B解析某同學在101、102、103倍稀釋的平均菌落數(shù)為2760、295和16，為保證結(jié)果準確，一般選擇菌落在30300的平板進行計數(shù)，因此只有295符合要求，其稀釋倍數(shù)為102，所用稀釋液體積為0.1 mL，代入計算公式2950.11022.95105個/mL。3用稀釋涂布平板法來統(tǒng)計樣品中的活菌數(shù)時，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)就能推測出樣品中的活菌數(shù)。原因是()A平板上的一個菌落就是一個細菌B菌落中的細菌數(shù)是固定的C此時的一個菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個活菌D此方法統(tǒng)計的菌落數(shù)一定與活菌的實際數(shù)相同答案C解析用稀釋涂布平板法來統(tǒng)計樣品中的活菌數(shù)時，平板上的一個菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個活菌，但偶爾也能來自兩個或多個細菌，所以此方法統(tǒng)計的菌落數(shù)可能低于活菌的實際數(shù)目。4測定土壤中細菌數(shù)量一般選用104、105和106倍的稀釋液進行平板培養(yǎng)，而測定真菌的數(shù)量一般選用102、103和104倍稀釋，其原因是()A細菌個體小，真菌個體大B細菌易稀釋，真菌不易稀釋C細菌在土壤中數(shù)量比真菌多D隨機的，沒有原因答案C解析土壤中活菌的數(shù)量一般高于真菌的數(shù)量，為控制平板上的菌落數(shù)在30300之間，需要選擇不同的稀釋倍數(shù)，故C正確。5某同學要分離土壤