光合細(xì)菌培養(yǎng)基配方的優(yōu)化研究.doc

光合細(xì)菌培養(yǎng)基配方的優(yōu)化研究摘要:光合細(xì)菌培養(yǎng)基的組分是由乙酸鈉、氯化銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、酵母膏等5種原料構(gòu)成。采用L16(45)正交表,將5種原料作為光合細(xì)菌生長(zhǎng)有影響的因素,通過(guò)試驗(yàn)數(shù)理統(tǒng)計(jì)的直觀和理論分析,對(duì)其配方進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)培養(yǎng)基的配方為乙酸鈉3. 3 g/L、氯化銨0. 6 g/L、磷酸二氫鉀0. 9 g/L、硫酸鎂0. 5 g/L、酵母膏1. 5 g/L、光照3 000 lx和溫度(32?2)e時(shí),培養(yǎng)72 h即可達(dá)到生長(zhǎng)峰值,細(xì)菌總數(shù)可以從起初的1. 75109cfu/mL提高到3. 19109cfu/mL。優(yōu)化的培養(yǎng)基條件能有效促進(jìn)光合細(xì)菌生長(zhǎng)。關(guān)鍵詞:光合細(xì)菌;標(biāo)準(zhǔn)曲線;平板菌落計(jì)數(shù);正交試驗(yàn)設(shè)計(jì);培養(yǎng)基優(yōu)化1 試驗(yàn)材料試驗(yàn)菌種:光合細(xì)菌(Photosynthetic Bacteria,PSB)由山東省淡水水產(chǎn)研究所分離、提純、培養(yǎng)而獲得,主要菌種為沼澤紅假單胞菌。液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方:乙酸鈉2. 5 g,酵母膏2. 0 g,MgSO40. 5 g,NH4Cl 1. 0 g,KH2PO40. 5 g和無(wú)菌水1 000 mL1。固體培養(yǎng)基(用于平板菌落計(jì)數(shù))配方:牛肉膏1. 5 g,蛋白胨5. 0 g,NaCl2. 5 g,瓊脂7. 0 g和無(wú)菌水500 mL1。主要儀器:生化培養(yǎng)箱LRH)150B,紫外線分光光度計(jì)Cary 100,自控振蕩機(jī)ZD,顯微鏡O-lympus CX41,蒸汽消毒器YXQG02,電子天平AG204,振蕩培養(yǎng)箱BS)IEA;無(wú)菌吸管,培養(yǎng)皿,試管及試管架、三角燒瓶等常用試驗(yàn)室器皿。主要試劑:乙酸鈉,氯化鈉,氯化銨,磷酸二氫鉀,結(jié)晶硫酸鎂,碳酸氫鈉均為分析純(AR);蛋白胨,牛肉膏,酵母膏和瓊脂均為生化試劑(BR)。2 試驗(yàn)方法2.1 光合細(xì)菌濃度OD660值標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定2.1. 1 基本原理 用紫外線分光光度計(jì)進(jìn)行光學(xué)密度測(cè)定,來(lái)獲得光合細(xì)菌不同標(biāo)準(zhǔn)濃度菌懸液的OD660值2,繪制光合細(xì)菌濃度OD660值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。2. 1. 2 操作步驟 標(biāo)記:取11支無(wú)菌20 mL試管,用記號(hào)筆分別標(biāo)明光合細(xì)菌濃度, 0. 00, 0. 01,0. 02, 0. 03, 0. 04, 0. 05, 0. 06, 0. 07, 0. 08, 0. 09和0. 10。接種:分別用10 mL無(wú)菌吸管吸取光合細(xì)菌菌懸液2. 0, 4. 0, 6. 0, 8. 0, 10. 0, 12. 0, 14. 0,16. 0, 18. 0, 20. 0 mL分別放入20mL試管中,加入液體培養(yǎng)基至20 mL,并用自控振蕩機(jī)搖晃均勻。2. 1. 3 OD660值測(cè)定結(jié)果 2007年6月2日,提取不同標(biāo)準(zhǔn)濃度PSB菌懸液、液體培養(yǎng)基作空白;選取波長(zhǎng)660. 00 nm,光束模式為雙光束自動(dòng)選擇模式,進(jìn)行OD660測(cè)試,其回歸方程為:y=0. 506 01 x (r= 0. 999 07)式中, x為光合細(xì)菌濃度; y為OD660值;A為截距;B為斜率。2. 2平板菌落計(jì)數(shù)法試驗(yàn)2. 2. 1操作步驟 取無(wú)菌培養(yǎng)皿9套,將光合細(xì)菌菌懸液依次稀釋至10-1, 10-2, 10-3, 10-4,10-5, 10-6, 10-7。置入自控振蕩機(jī)上振蕩,使菌液充分混勻。用3支1 mL無(wú)菌吸管分別吸取10-5、10-6和10-7的稀釋菌懸液各0. 1 mL,分別放入已做好固體培養(yǎng)基平板的培養(yǎng)皿中,并用玻璃涂棒將菌液涂布均勻。每種稀釋濃度3個(gè)設(shè)置重復(fù),及時(shí)放入生化培養(yǎng)箱中,調(diào)至(32?2)e,進(jìn)行光照培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后,取出培養(yǎng)平板,對(duì)各培養(yǎng)皿中形成的菌落計(jì)數(shù),算出同一稀釋度3475漁業(yè)現(xiàn)代化62007年第34卷第6期 個(gè)平板上的菌落平均數(shù),并按下列公式進(jìn)行計(jì)算:1 mL中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)1012. 2. 2試驗(yàn)結(jié)果(1)平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果(表1)(2)PSB菌懸液OD660值測(cè)試結(jié)果(表2)表1培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果表稀釋度10-51 2 3平均10-61 2 3平均10-71 2 3平均cfu數(shù)/平板2 262 1 816 1 983 2 020. 3 267 281 226 258 31 42 33 35. 3cfu數(shù)/mL 2. 021092. 581093. 53109 注:采集時(shí)間為2007-06-06 15: 10: 15;光合細(xì)菌(PSB)菌懸液平均濃度=2. 71109個(gè)/mL。表2培養(yǎng)時(shí)光合細(xì)菌(PSB)菌懸液OD660值測(cè)試表樣品濃度度數(shù)值(g/L)濃度平均值(g/L)平均值(Abs)標(biāo)準(zhǔn)偏差SD均方差%RSD讀數(shù)值(Abs)3個(gè)平行樣3. 13. 13. 13. 1 1. 563 6 0. 011 74 0. 751 101. 5501. 5661. 573 注:采樣時(shí)間為2007-06-04 15: 18: 57。2.3 光合細(xì)菌生長(zhǎng)正交試驗(yàn)2.3. 1 試驗(yàn)原理 光合細(xì)菌生長(zhǎng)受到多種因素的影響。利用規(guī)格化的表格L16(45)正交表,合理安排試驗(yàn),通過(guò)極差、均值統(tǒng)計(jì)分析,篩選出光合細(xì)菌最佳培養(yǎng)基的配方3-5。2. 3. 2 正交試驗(yàn)方案(表3)表3液體培養(yǎng)基L16(45)正交試驗(yàn)因素水平表水平A乙酸鈉(g/L)BNH4Cl(g/L)CKH2PO4(g/L)DMgSO4(g/L)E酵母膏(g/L)1 2. 1 0. 6 0. 3 0. 3 0. 52 2. 5 1. 0 0. 5 0. 5 1. 03 2. 9 1. 4 0. 7 0. 7 1. 54 3. 3 1. 8 0. 9 0. 9 2. 02. 3. 3稱量與接種 對(duì)各種試劑質(zhì)量進(jìn)行稱重,根據(jù)正交表的試驗(yàn)方案,計(jì)算出試驗(yàn)所需要的總量,溶解在80 mL無(wú)菌水中,分別在48個(gè)三角燒瓶?jī)?nèi)均加入NaHCO30. 02g,調(diào)整pH值,并接種菌懸液濃度20%,最后加入無(wú)菌水100 mL至刻度,用自動(dòng)振蕩機(jī)混合均勻,放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),箱內(nèi)溫度維持(32?2)e,每天測(cè)取OD660,直到光合細(xì)菌樣品組中第1個(gè)出現(xiàn)生長(zhǎng)峰值時(shí)結(jié)束(圖1),并對(duì)該樣品組進(jìn)行延期跟蹤測(cè)試,觀測(cè)其結(jié)果(圖2)。2. 3. 4培養(yǎng)結(jié)果(表4)正交試驗(yàn)開(kāi)始接種時(shí),菌懸液的接種量為20%,其OD660值=1. 014 5,由公式y(tǒng)= 0. 506 01x(r=0. 999 07)推算出光合細(xì)菌含菌數(shù)為1. 75109cfu/mL。圖1在樣品組中第1個(gè)出現(xiàn)生長(zhǎng)峰值情況(試驗(yàn)組13)485漁業(yè)現(xiàn)代化62007年第34卷第6期 圖2試驗(yàn)組13跟蹤測(cè)試結(jié)果(2007-07-09)2007-07-16)表4液體培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果表(2007-07-16)試驗(yàn)組A B C D E OD660值yi1 1 1 1 1 1 1. 153 22 1 2 2 2 2 1. 433 13 1 3 3 3 3 1. 500 14 1 4 4 4 4 1. 443 55 2 1 2 3 4 1. 350 56 2 2 1 4 3 1. 674 67 2 3 4 1 2 1. 517 38 2 4 3 2 1 1. 437 89 3 1 3 4 2 1. 360 710 3 2 4 3 1 1. 545 511 3 3 1 2 4 1. 448 412 3 4 2 1 3 1. 477 913 4 1 4 2 3 1. 840 914 4 2 3 1 4 1. 353 915 4 3 2 4 1 1. 525 916 4 4 1 3 2 1. 723 3均值1. 382 5 1. 426 3 1. 499 9 1. 375 6 1. 415 6均值1. 495 1 1. 501 8 1. 446 9 1. 540 1 1. 508 6均值1. 458 1 1. 497 9 1. 413 1 1. 529 9 1. 623 4均值1. 611 0 1. 520 6 1. 586 8 1. 501 2 1. 399 1極差R 0. 228 5 0. 094 3 0. 173 7 0. 164 5 0. 224 3 注:每一試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。3討論根據(jù)光合細(xì)菌濃度OD660值標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定試驗(yàn),得到回歸方程: y=0. 506 01x,相關(guān)系數(shù)r=0. 999 07。當(dāng)OD660=1. 563 6時(shí),根據(jù)平板菌落計(jì)數(shù)試驗(yàn),測(cè)得菌懸液平均菌落數(shù)為2. 71109cfu/mL。根據(jù)增殖培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗(yàn)(表2),從極差(R)分析可以看出,AE因素影響光合細(xì)菌生長(zhǎng)OD660值的主次順序:AECDB。因素A乙酸鈉對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)的影響十分明顯,因素B氯化銨對(duì)生長(zhǎng)的影響最小。從均值理論分析,最佳培養(yǎng)基配方組合為: A4、B4、C4、D3、E3。正交試驗(yàn)最佳生長(zhǎng)條件是試驗(yàn)組13,即乙酸鈉3. 3 g,氯化銨0. 6 g,磷酸氫二鉀0. 9 g,硫酸鎂0. 5 g,酵母膏1. 5 g。每個(gè)樣品均接種200mL,加碳酸氫鈉0. 20 g,并加無(wú)菌水1 000 mL至刻度。培養(yǎng)溫度(32?2)e,普通白熾燈光照3 000 1x。根據(jù)開(kāi)始菌懸液的濃度、第1次樣品13達(dá)到峰值的OD660值,由公式y(tǒng) = 0. 506 01x(r=0. 999 07)以及菌懸液的濃度與OD660值呈線性關(guān)系,可以推算得到,培養(yǎng)72 h,細(xì)菌總數(shù)可從1. 75109cfu/mL提高到3. 19109cfu/mL。根據(jù)跟蹤測(cè)試結(jié)果(圖2),光合細(xì)菌達(dá)到生長(zhǎng)峰值后,有一段平滑生長(zhǎng)期,隨后衰減,這主要是由于培養(yǎng)基吸收消耗,滿足不了光合細(xì)菌正常生長(zhǎng)的需要所致。試驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲得,對(duì)工廠化養(yǎng)魚(yú)水質(zhì)凈化、光合細(xì)菌的正確使用,具有重要的指導(dǎo)意義。t參考文獻(xiàn)1沈萍,范秀容,李廣武.微生物學(xué)試驗(yàn)M.北京:高等教育出版社, 2002: 92-95.2農(nóng)牧函199830號(hào).沼澤紅假單胞菌(光合細(xì)菌)水劑產(chǎn)品質(zhì)量暫行標(biāo)準(zhǔn)S. http: /syzgny. com. cn/ConsHtml/5 /1 /1 /11765. html3趙選民.試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法M.北京:科學(xué)出版社, 2006: 64-114.4陳家鼎,孫山澤,李東風(fēng).數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)講義M.北京:高等教育出版社, 2006: 287-314.5王育鋒.用光合細(xì)菌液池塘培育淡水魚(yú)種的試驗(yàn)J.水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1990, 14(4): 347-350.=作者簡(jiǎn)介陳秀麗(1971),女,研究實(shí)習(xí)員,學(xué)士,畢業(yè)于山東師范大學(xué),從事淡水微生物研究。通訊作者:陳友光(1961),男,研究員,從事水產(chǎn)養(yǎng)殖與工廠化養(yǎng)魚(yú)工程專業(yè)研究。(2007-08-10收稿; 2007-11-20修回)(下轉(zhuǎn)第34頁(yè))495漁業(yè)現(xiàn)代化62007年第34卷第6期 1981,第一輯: 125-131.10黃琇,余志堂.中華鱘幼魚(yú)食性研究C /長(zhǎng)江水域資源、生態(tài)、環(huán)境與經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)研究論文集.北京:科學(xué)出版社,1991: 257-261.11戴國(guó)梁.長(zhǎng)江口及其臨近水域底棲動(dòng)物生態(tài)特點(diǎn)J.水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1991, 15(2): 104-116.12李建生,李圣法.長(zhǎng)江口漁場(chǎng)漁業(yè)生物群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)變化J.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2004, 11(5): 432-439.13陳正國(guó).長(zhǎng)江口中華鱘幼魚(yú)資源的保護(hù)對(duì)策研究J.現(xiàn)代漁業(yè)信息, 1991, 6(4): 12-14.14施德龍,龔志高.長(zhǎng)江口中華鱘幼魚(yú)保護(hù) J.海洋漁業(yè),1993, 15(2): 72-73.15莊平,王幼槐,李圣法,等.長(zhǎng)江口魚(yú)類M.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2006: 137-144.=作者簡(jiǎn)介吳建輝(1980),男,碩士,主要從事中華鱘保護(hù)區(qū)的資源和環(huán)境監(jiān)測(cè)工作。(2007-09-17收稿; 2007-12-10修回)Growth ofwild juvenile Chinese sturgeon (Acipenser sinensis)farmed in the artificial environmentWU Jian-hu,i LIU Jian, CHEN Jin-hui( SuperintendencyDepartment ofShanghaiYangizeEstuarineNatureReserve forChinese Sturgeon, Shanghai200092, China)Abstract:Thewild juvenile Chinese sturgeon (Acipenser sinensis) catched in theDongtan ofChongming is-land by the fisherman onMay, 2006, was bred in the artificial environment from June toAugus.t This paperinvestigated its growth feature in the artificial environment. The result of the study is that juveniles bodylength increased from (15. 40?0. 64) cm to (29. 20?0. 75) cm among three months, 1. 54 mm in dailylength increased, and its bodyweight increased from (26. 00?1. 34) g to (108. 00?3. 87) g among threemonths, 0. 90 g in dailyweight increased. The relationship between BL and BW of juvenileAcipenser sinensiswasW = 0. 121 5 L2. 031 3(R2=0. 945 7) (b3), that is to say the growth of length was faster than ofweigh.t And comparing the growth ofwild juvenileAcipenser sinensisin the artificial environment and in thewild environmen,t the result is that juvenileAcipenser sinensisgrow in thewild is faster than itsgrow in the ar-tificial environmen.t The resultsmay infer that the growth differencesmay be caused by injured, not fit foren-vironment and foodwhen juvenileAcipenser sinensisis bred in the artificial environmen.tKey words:Acipenser sinensis; wild; artificial environmen;t Dongtan of Chongming island; isometricgrowth; relative fatness(上接第49頁(yè))Study on the optim ization of a culturemediumfor photosynthetic bacteriaCHEN Xiu-l,i CHEN You-guang, WANG Yu-feng, LIXian(FreshWaterFisheriesResearch Institute ofShandondProvince, Jinan250117, China)Abstract:The culture medium for photosynthetic bacteria is composed of CH3COONa, NH4C,l MgSO4,KH2PO4and Peptone