載體構(gòu)建流程.ppt

經(jīng)典載體構(gòu)建流程 I載體構(gòu)建流程 cDNA 提取mRNA 得到目的基因 RT PCR PCR產(chǎn)物純化 酶切目的基因和載體 純化酶切產(chǎn)物 連接 轉(zhuǎn)化 菌落PCR 挑取陽性克隆去測序 測序正確的搖菌提質(zhì)粒 保菌 導(dǎo)入表達(dá)宿主測試表達(dá)情況 提取mRNA 如果可能 實驗室應(yīng)辟出專門RNA操作區(qū) 離心機(jī) 移液槍 試劑等均應(yīng)專用 RNA操作區(qū)應(yīng)保持清潔 并定期進(jìn)行消毒 操作過程中應(yīng)自始至終佩戴口罩和手套 并經(jīng)常更換 以避免將手 臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶入試管或污染用具 操作過程所用器材都要經(jīng)過特殊處理 一次性槍頭 離心管等塑料制品采用連續(xù)滅菌兩次來滅活RNA酶 研缽180 4h RT 由于真核基因是由非編碼的內(nèi)含子將ORF分隔開來的斷裂基因 若以基因組為模板PCR得到的片段克隆進(jìn)載體 不能在原核細(xì)胞剪接內(nèi)含子 也不能在非對象真核細(xì)胞中正確剪接表達(dá) 所以要克隆真核蛋白基因 需以不含內(nèi)含子的連續(xù)編碼的mRNA為模板 PCR耐熱酶不能直接以mRNA為模板擴(kuò)增 必須通過逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 再以cDNA為模板擴(kuò)增目的基因 根據(jù)不同的目的 可有三類引物選擇 PCR得到目的基因 剛開始摸條件時 都會先做一個梯度PCR 選出最適條件 由于此步為獲取正確的目的基因 所以盡量避免PCR的突變格外重要 其中所采取的措施有 使用高保真酶 循環(huán)次數(shù)控制在300cycle左右 引物設(shè)計合理等 重復(fù)1 3步25 30輪 目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈與引物復(fù)性 DNA變性形成2條單鏈 子鏈延伸DNA加倍 PCR常出現(xiàn)的問題 1 假陽性 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致 有時其條帶更整齊 亮度更高2 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致 或大或小 或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶3 什么條帶都沒有 解決方法 假陽性的原因及解決方法 可能引物設(shè)計不合適 選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性 因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時 擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列 靶序列太短或引物太短 容易出現(xiàn)假陽性 需重新設(shè)計引物 還有就是靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染 非特異性條帶的出現(xiàn) 其原因 一是引物與靶序列不完全互補(bǔ) 或引物聚合形成二聚體 二是Mg2 離子濃度過高 退火溫度過低 及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān) 其次是酶的質(zhì)和量 往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn) 酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增 其對策有 必要時重新設(shè)計引物 減低酶量或調(diào)換另一來源的酶 降低引物量 適當(dāng)增加模板量 減少循環(huán)次數(shù) 適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法 93 變性 65 左右退火與延伸 什么條帶都沒有 其原因可能是少加?xùn)|西 酶已經(jīng)失活了 或退火溫度太高等 解決方法 檢查是否少加?xùn)|西了 換一下酶 降低退火溫度或做個梯度 摸一下條件 PCR產(chǎn)物純化 倘若直接對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切 體系的雜蛋白 離子等會造成酶切困難或星活性 殘余的聚合酶也會填平粘性末端 造成克隆失敗 所以此步對整個分子克隆都至關(guān)重要 可適當(dāng)用酚抽提 柱純化 必要的話也可以膠回收 酶切目的基因和載體 酶切注意事項 兩種酶切的條件不同時 分別進(jìn)行兩次酶切 切完一個純化后再切 溫度要求不同 先酶切低溫要求的 再酶切高溫要求的 若鹽濃度要求不同 先酶切低鹽濃度要求的 再酶切高鹽濃度要求的 只要其中一種酶需要添加BSA 則應(yīng)在雙酶切反應(yīng)體系中加入BSA BSA不會影響任何內(nèi)切酶的活性 注意將甘油的終濃度控制在10 以下 以避免出現(xiàn)星號活性 可通過增加反應(yīng)體系的總體積的方法實現(xiàn)這一要求 酶切常見問題 純化酶切產(chǎn)物 通常此步是必要的 可以對比未經(jīng)純化的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接后獲得的陽性克隆大大低于膠回收酶切產(chǎn)物連接所得陽性克隆 此步的目的是去除多余的片段 得到單一純化的目的基因與載體骨架 使之連接不受其他序列干擾 另外酶切后純化前 均需熱滅活 以免殘余的限制性內(nèi)切酶干擾后續(xù)連接反應(yīng) 降低陽性率 回收前 回收后 酶切目的條帶 酶切載體帶 連接 催化DNA中相鄰的5 磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸二酯鍵 使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接 PCR產(chǎn)物最好進(jìn)行切膠回收純化 以去除PCR產(chǎn)物中的非特異性片段和引物等雜質(zhì) 切膠回收PCR產(chǎn)物時 避免DNA在紫外線下暴露時間過長從而形成嘧啶二聚體 造成PCR產(chǎn)物不能連接 凝膠電泳檢測純化后的PCR產(chǎn)物的濃度 優(yōu)化連接反應(yīng)時插入片段與載體摩爾比例為2 1 10 1 通常為3 1 PCR產(chǎn)物及載體應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融 否則易造成3 末端殘基的丟失 一般連接25度2小時 16或4度過夜 轉(zhuǎn)化 基本步驟 1 將100 l感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍 2 取5 l連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中 輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻內(nèi)容物 在冰上放置30分鐘 3 將管放入預(yù)加溫到42 的水浴中 熱激90秒 快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中 使細(xì)胞冷卻1 2分鐘 4 每管中加700 lLB培養(yǎng)基 37 振蕩培養(yǎng)1小時 進(jìn)行復(fù)蘇 5 室溫4 000rpm離心5分鐘 棄去上清后 用剩余100 l培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并涂布到含抗性的LB瓊脂平板表面 注意 細(xì)胞用量應(yīng)根據(jù)連接效率和感受態(tài)細(xì)胞的效率進(jìn)行調(diào)整 6 將平板置于室溫直至液體被吸收 7 倒置平皿 于37 培養(yǎng) 12 16小時后可出現(xiàn)菌落 菌落PCR 此步以適應(yīng)現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗室批量工作的高效性 通常只需挑半個菌落直接作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR就能初步檢測陽性克隆 初步檢菌的陽性克隆接種提質(zhì)粒 供后續(xù)酶切分析以及測序檢測 酶切檢測陽性克隆 將菌檢的陽性克隆所得質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析 獲得預(yù)期條帶的即為陽性克隆 要進(jìn)一步確認(rèn)是否有因PCR所帶來的點(diǎn)突變 插入 缺失等改變目的基因的序列 還需要對陽性克隆進(jìn)行測序 選用的酶通常為設(shè)計引物的兩個酶 因為它能完整切下ORF和載體骨架 可以通過條帶大小以判斷陽性克隆 挑取陽性克隆去測序 測序是構(gòu)建載