凝膠層析法測定蛋白質分子質量.doc

凝膠層析法測定蛋白質分子質量一、實驗目的1. 了解凝膠層析（Gel Chromatography）的原理及其應用。2. 通過測定蛋白質分子質量的訓練，初步掌握凝膠層析技術。二、實驗原理凝膠層析又稱凝膠排阻層析（Gel Exclusion Chromatography），凝膠過濾（Gel Filtration），滲透層析（Gel Permeation Chromatography）或分子篩層析（Molecular Sieve Chromatography）等。它是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小順序分離樣品中各個組分的液相色譜方法。凝膠層析技術被廣泛應用于分離、提純、濃縮生物大分子及脫鹽、去熱源等各種生物化學實驗過程之中。測定蛋白質分子質量也是它的重要應用之一。凝膠是一種具有立體網(wǎng)狀結構且呈多孔的不溶性珠狀的顆粒物質。用凝膠來分離物質，主要是根據(jù)多孔凝膠對不同半徑的蛋白質分子（近似于球形）具有不同的排阻效應實現(xiàn)的。即它是根據(jù)分子大小這一物理性質進行分離純化的。對于某種型號的凝膠，一些大分子不能進入凝膠顆粒內部而完全被排阻在外，只能沿著顆粒間的縫隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由擴散，滲透進入凝膠內部的篩孔，而后又被流出的洗脫液帶走。分子越小，進入凝膠內部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先從柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子和小分子之間，只能進入一部分凝膠較大的孔隙，即被部分排阻，因此這些分子從柱中流出的順序也介于大、小分子之間。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，分子便按照從大到小的順序依次流出，達到分離的目的。對于任何一種被分離的化合物在凝膠層析柱中被排阻的范圍均在0100%之間，其被排阻的程度可以用有效分配系數(shù)Kav（分離化合物在內水和外水體積中的比例關系）表示，Kav值的大小和凝膠柱床的總體積（Vt）、外水體積（V0）以及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關：Kav=（Ve-V0）/（Vt-V0）。在限定的層析條件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是隨著分離物分子質量的變化而改變。分子質量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小則Ve值大，Kav值大。有效分配系數(shù)Kav是判斷分離效果的一個重要的參數(shù)，同時也是測定蛋白質分子質量的一個依據(jù)。在相同層析條件下，被分離物質Kav值差異越大，分離效果越好。反之，分離效果差或根本不能分開。在實際的實驗中，我們可以實測出Vt、V0及Ve的值，從而計算出Kav的大小。對于某一特定型號的凝膠，在一定的分子質量范圍內，Kav和lgMr成線性關系： Kav = -blg Mr + C 其中b，C 為常數(shù)。同樣可以得 Ve = -b lg Mr + C, 其中、為常數(shù)?？梢酝ㄟ^在一凝膠柱中分離多種已知分子質量的蛋白質后，并根據(jù)上述的線性關系繪出標準曲線，然后用同一凝膠柱測出其他未知蛋白的分子質量。三、實驗儀器和實驗試劑（一） 器材1. 玻璃層析柱。2. HL-1型恒流泵。3. BSE-100型自動部分收集器。4. 8823B紫外檢測儀。5. SPECORD-200紫外分光光度計。6. TYPE3057 Portable Recorder記錄儀。7. 100ml試劑瓶。8. 50ml、100ml量筒各一個。9. 50ml、100ml、250ml、500ml燒杯各一個。10. 10ml刻度試管。11. 膠頭滴管。12. 玻璃棒。（二）試劑1. 標準蛋白（1） 牛血清白蛋白：Mr=67 000（上海生化所）（2） 雞卵清清蛋白： Mr =45 000（美國SIGMA公司）（3） 胰凝乳蛋白酶原A：Mr =24 000（4） 溶菌酶： Mr =14 3002. 未知蛋白樣品（由實驗室制備）3. 洗脫液0.025mol/L KCL-0.1 mol/L HAC4. 藍色葡聚糖-2000四、實驗操作和具體過程（一） 凝膠的溶脹稱取7g Sephadex G-75 于250 ml燒杯中加入洗脫液100ml，置于室溫溶脹23天，反復傾瀉去掉細顆粒，然后減壓抽氣去處凝膠孔隙中的空氣，沸水浴中煮沸23小時（可去處顆粒內部的空氣以及滅菌）。（二） 裝柱1. 取潔凈的玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺上。2. 凝膠柱總體積（Vt）的測定：在距離柱上端5cm處作一個記號，關閉柱出水口，加入去離子水，打開出水口，液面降至柱記號處即關閉出水口，然后用量筒接受柱中去離子水（水面降至層析柱玻璃篩板），讀出的體積即為柱床總體積Vt。也可以最后走完未知蛋白后再測定Vt。3. 在柱中加入洗脫液（約1/3柱床高度），將凝膠濃漿緩慢傾入柱中，待凝膠沉積約1cm2cm高度后打開出水口，流速一般用56ml/10min。膠面上升到柱記號處則裝柱完畢，注意裝柱過程中凝膠不能分層。然后關閉出水口，靜置片刻，待凝膠完全沉降，則接上恒流泵，用12倍柱床體積的洗脫液平衡柱子，使柱床穩(wěn)定。（三） V0和未知蛋白Ve的測定按實驗要求安裝和連接好各種儀器。把記錄儀的記錄時間調節(jié)到2cm/h，調節(jié)恒流泵的速度為56ml/10min，紫外檢測儀置于0.5A檔。檢查無誤后再開始下一步操作。吸去柱上端的洗脫液（切不可攪亂膠面，可覆蓋一張濾紙或尼龍網(wǎng)）。打開出水口，使殘余液體降至與膠面相切（但不要干膠），關閉出水口。用細滴管吸取0.5ml（5mg/ml）藍色葡聚糖-2000和未知蛋白（8mg/ml）的混合液，小心地繞柱壁一圈（距離膠面2mm）緩慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，打開出水口（開始收集?。?，待溶液滲入膠床后，關閉出水口，用少許洗脫液加入柱中，滲入膠床后，柱上端再用洗脫液充滿后用56ml/10min的速度開始洗脫，自動收集器收集時間為5min每管。最后作出洗脫曲線。收集并量出從加樣開始至洗脫液中藍色葡聚糖濃度最高點的洗脫液體積即為V0。繼續(xù)收集洗脫液，直至未知蛋白洗出，以洗脫液作空白參比，紫外分光光度計280nm處比色，測出最大吸收峰。注意：藍色葡聚糖和未知蛋白洗下來之后，還要用洗脫液（12倍床體積）繼續(xù)平衡一段時間，以備下步實驗使用。（四） 標準曲線的制作1. 用洗脫液配制標準蛋白溶液供全班使用，溶液中三種蛋白的濃度各為：牛血清清蛋白（5mg/ml）、雞卵清清蛋白（8mg/ml）、胰凝乳蛋白酶原（5mg/ml）、溶菌酶蛋白（5mg/ml）。2. 在裝樣前應該測定此時的柱床體積，因為該體積可能和上次不同，如果有變化則應在之后的計算中進行修正。3. 按（三）的操作方法加入上述標準蛋白溶液0.5ml，以56ml/10min的速度洗脫并收集洗脫液。注意控制每管的流速為1.51.8ml/3min/管。此時把紫外檢測儀置于0.2A檔。4. 用紫外分光光度計逐管測定A280，并確定各種蛋白的洗脫峰最高點，然后量出各種蛋白的洗脫體積Ve。5. 以A280為縱坐標，Ve為橫坐標畫出標準蛋白的洗脫曲線。6. 以Kav為縱坐標，LogMr為橫坐標作標準曲線。7. 以Ve為縱坐標，LogMr為橫坐標作標準曲線。8. 在標準曲線上查出未知蛋白的LogMr，其反對數(shù)便是待測定蛋白質的分子質量。9. 在實驗完畢后，必需將凝膠回收處理，以備下次使用，嚴禁將凝膠丟棄或倒入水池中。五、實驗結果和討論（一）實驗結果的原始數(shù)據(jù)（1） 恒流泵設定流速：5.4ml/10min (測定藍色葡聚糖+未知蛋白) 5.8ml/10min (測定標準蛋白)（2） 自動部分收集器設定：3.2ml/5min55s/管 (測定藍色葡聚糖+未知蛋白) 3.2ml/5min30s/管(測定標準蛋白)（3） 層析柱內凝膠總體積Vt（即柱床體積）：Vt=99ml (測定藍色葡聚糖+未知蛋白) Vt=98.4ml (測定標準蛋白)（4） 洗脫液A280吸光度測定數(shù)據(jù)：具體數(shù)據(jù)請見下表（表1和表2） 表1 藍色葡聚糖+未知蛋白A280吸光度測定數(shù)據(jù)（藍色消失后測得各管吸光值如下）管號0（對照） a b c d e fA280 0管號 g h iJ(最藍) 1 2 3A280 0.022管號 4 56（最大） 7 8 9 10A280 0.042 0.101 0.153 0.146 0.096 0.053 0.023表2標準蛋白質A280吸光度測定數(shù)據(jù)牛血清清蛋白、雞卵清清蛋白、胰凝乳蛋白酶原 管號1234567A2800.000-0.001-0.0010.0000.002-0.001-0.001管號891011121314A280-0.001-0.0020.0690.4200.2520.1430.137管號15161718192021A2800.1390.1500.1860.2350.2640.2930.346管號22232425262728A2800.4010.4070.3480.2410.1440.0750.032管號29303132333435A2800.0130.0070.0050.0080.0060.0050.002（5） 凝膠層析洗脫體積數(shù)據(jù)記錄：洗脫體積請見下表（表3和表4）表3 藍色葡聚糖+未知蛋白洗脫體積數(shù)據(jù)藍色葡聚糖+未知蛋白洗脫峰最高峰值所在管號洗脫體積第一洗脫峰J35.2ml第二洗脫峰659.7ml 表4標準蛋白質洗脫體積數(shù)據(jù) 標準蛋白質（牛血清清蛋白、雞卵清清蛋白、胰凝乳蛋白酶原） 洗脫峰最高峰值所在管號洗脫體積第一洗脫峰 11 35.5ml第二洗脫峰 23 70.0ml 第三洗脫峰 32 97.4ml1.實驗數(shù)據(jù)的處理（1） 凝膠層析柱柱床體積Vt：測藍色葡聚糖+未知蛋白時：Vt=99ml測標準蛋白時： Vt=98.4ml（2） 利用表1中的數(shù)據(jù)作標準蛋白的洗脫曲線。以收集管數(shù)（由于每管收集的體積為3.2ml，所以管數(shù)X3.2ml即為洗脫體積）為橫軸，以280nm的吸光度值為縱軸，做出連續(xù)的平滑曲線，如下圖1所示。 圖1 標準蛋白洗脫曲線從此圖中可以看到三個吸收峰分別在第11管、第23管和第32管左右出現(xiàn)，由于三種標準蛋白的分子量依次減小，而分子量大的蛋白會先洗脫出來，所以其中第一個峰為牛血清白蛋白（Mr=67,000）的吸收峰，第二個峰為雞卵清清蛋白（Mr =45,000）的吸收峰，第三個峰為胰凝乳糖蛋白酶原A（ Mr =24,000)的吸收峰。未知蛋白的洗脫體積Ve也通過量筒測出。各蛋白有效分配系數(shù)Kav和洗脫體積的計算和標準曲線的繪制根據(jù)有效分配系數(shù)的計算公式，其中凝膠柱的總體積在兩次測量時是可能是不同的，所以在計算未知蛋白的有效分配系數(shù)和標準蛋白的有效分配系數(shù)時，應分別采用不同的凝膠柱床的總體積Vt=99ml和Vt=98.4ml，不過由于在實際實驗中我們兩次進行凝膠層析的柱床體積相差很?。w積差不到0.6ml），所以可以認為柱床體積是穩(wěn)定的。而外水體積（即藍色葡聚糖的洗脫體積）Vo35.2ml。 數(shù)據(jù)計算結果見下表5。蛋白質種類分子量Mr洗脫體積 Ve（ml）有效分配系數(shù) Kav分子量對數(shù) LgMr牛血清蛋白67,000 35.50.0047468354.826074803雞卵清蛋白45,000 70.00.5506329114.653212514胰凝乳糖蛋白酶原A24,000 97.40.9841772154.380211242未知蛋白 59.70.384012539表5原始數(shù)據(jù)計算匯總表 由于在一定的分子質量范圍內，Kav與lgMw成線性關系：，其中b,c為常數(shù)。以標準蛋白質的分子量的lg值即lg(Mr)為橫坐標，以有效分配系數(shù)為縱坐標，對Kav和lgMr做線性擬合，結果見下圖3：圖3 有效分配系數(shù)Kav與蛋白質分子量的lgMw值線性擬合的標準曲線線性擬合方程為Kav=-2.1418lgMw+10.408，相關性系數(shù)的平方R2=0.9624，線性程度很好。根據(jù)這一標準曲線可以由未知蛋白的有效分配系數(shù)Kav計算未知蛋白的分子量。根據(jù)同樣的原理洗脫體積Ve也是和lgMw成線性關系的，以標準蛋白質的分子量的lg值即lg(Mw)為橫坐標，以洗脫體積Ve為縱坐標，對Ve和lgMw做線性擬合，結果見下圖4：圖4 洗脫體積Ve與蛋白質分子量的lgMw值線性擬合的標準曲線線性擬合方程為Ve=-135.36lgMw+692.99，相關性系數(shù)的平方R2=0.9624，線性程度很好。根據(jù)這一標準曲線可以由未知蛋白的洗脫體積Ve計算未知蛋白的分子量。2.未知蛋白分子質量的計算未知蛋白質的有效分配系數(shù)為Kav=0.384012539, 根據(jù)標準曲線的線形擬合公式可以計算出未知蛋白的lgMr=4.680169699, 所以未知蛋白的分子量的值為Mr=47,882。未知蛋白質的有效分配系數(shù)為Ve=59.7ml, 根據(jù)標準曲線的線形擬合公式可以計算出未知蛋白的lgMr=4.678560875, 所以未知蛋白的分子量的值為Mr=47,704。以上結果匯總為下表6蛋白質種類分子量Mr洗脫體積 Ve（ml）有效分配系數(shù) Kav分子量對數(shù) LgMr牛血清蛋白67,000 35.50.0047468354.826074803雞卵清蛋白45,000 70.00.5506329114.653212514胰凝乳糖蛋白酶原A24,000 97.40.9841772154.380211242未知蛋 白Kav47,882 59.70.3840125394.680169699Ve47,704 59.70.3840125394.678560875 表6最終計算結果匯總表3.實驗結果的討論 (1) 對未知蛋白質分子量計算結果的討論。根據(jù)有效分配系數(shù)Kav計算得到的未知蛋白質分子量為Mr=47,882，根據(jù)洗脫體積Ve計算得Mr=47,704。二種方法所得到的數(shù)據(jù)基本一致，兩者相差178，相對差值約為0.4%，在實驗過程所允許的范圍之內。但是，理論上講兩種計算方法的結果應該是一致，造成誤差的原因可能是第一次層析藍色葡聚糖和未知蛋白之后，凝膠洗脫不充分，并且第二次層析標準蛋白這個過程中凝膠柱床Vt很可能發(fā)生變化。而且由于同樣的原因，外水體積Vo也會發(fā)生變化。因此，兩次層析實驗過程中凝膠的物理性質即相關物理參數(shù)并不完全一致，導致由分配系數(shù)Kav和由洗脫體積Ve分別計算的Mr不一致。不過，由于總體上凝膠的各種性質并沒發(fā)生明顯的變化，所以最終所測得的未知蛋白分子質量相差很小。（2）關于加樣后加洗脫液引起的實驗誤差的分析加樣操作過程產(chǎn)生的方法誤差：因為加入樣品后即開始收集，而我們最后計算洗脫峰位置是根據(jù)收集的管數(shù)乘以每管計算得到的設定收液體積。所以在樣品滲入膠床后停止收集液體再加入少許洗脫液潤洗管壁的時間內我們沒有收集液體，但自動收集器仍在記時，所以該管液體量應該少于設定的每管收液體積。在數(shù)據(jù)處理過程中，我們對該管仍按設定的每管3.2ml計算。所以該時間段直接產(chǎn)生測量誤差。其大小主要取決于操作者的熟練程度。所以我們在實驗中應該盡量縮短該時間。（3）實驗中可能造成結果誤差的原因分析。第一，在實驗相關參數(shù)測定中的系統(tǒng)誤差和偶然誤差。由于在測量柱床體積Vt，外水體積Vo，洗脫體積Ve時使用了量筒等測量工具，所以由于這些工具所帶來的系統(tǒng)誤差是很難完全避免的。同時，由于本次實驗中每次層析實驗只進行了一次，所以人為測量中的偶然誤差也是很可能出現(xiàn)的。所以，如果能夠多次重復實驗，并將每次實驗的結果取平均值，應該能夠在一定程度上使得最終測定的未知蛋白質分子量更加準確。第二，由于兩次進行凝膠層析時所設定的恒流泵流速不同，因此可能導致在兩次層析過程中分離效果不同，從而導致最終結果的誤差。第一次層析過程中由于兩個洗脫峰的間距較大，所以使用了2.75ml/5min/管的速度；而第二次前兩個洗脫峰的間距很小，為使得兩個洗脫峰能夠充分分離，所以使用了1.6ml/3min/管的速度。因此，洗脫速度的不同可能導致兩次實驗的層析效果有一定的差別。由于這個差別，將用測定