腺病毒宣講材料20110731.ppt

諾賽基因腺病毒服務(wù) 2011年7月26日 Outline 腺病毒腺病毒載體腺病毒載體的應(yīng)用Adxsi重組腺病毒載體系統(tǒng)腺病毒載體的質(zhì)檢如何使用和操作病毒 腺病毒 結(jié)構(gòu)組成分類基因組感染細胞機制腺病毒細胞轉(zhuǎn)化作用 腺病毒的結(jié)構(gòu)組成 直徑60 90nm20面體 無囊膜240個六鄰體12個五鄰體雙鏈線性DNA基因組 分類 5型腺病毒的基因組結(jié)構(gòu)示意圖 腺病毒基因組重要組件 E1 E2 E3 E4 5 ITR 3 ITR ITR 反向末端重復(fù)序列E1 激活其他病毒基因的轉(zhuǎn)錄 對細胞基因的轉(zhuǎn)錄也有調(diào)控作用E2 調(diào)節(jié)病毒DNA的復(fù)制E3 逃避宿主免疫系統(tǒng)對受病毒感染細胞的清除作用E4 與病毒DNA復(fù)制 晚期基因表達 RNA剪接和阻止宿主細胞生物合成等功能有關(guān)L1 L5 晚期基因主要編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白 腺病毒的感染細胞過程 先結(jié)合CAR 再結(jié)合整合素內(nèi)吞作用將腺病毒內(nèi)化到細胞中并進入溶酶體從溶酶體中釋放腺病毒顆粒轉(zhuǎn)位到細胞核通過核孔將病毒DNA釋放到細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄 復(fù)制 病毒包裝在細胞核中進行 腺病毒的細胞轉(zhuǎn)化作用 E1A蛋白與RB105蛋白作用 55kD的E1B基因產(chǎn)物與P53作用 這兩種復(fù)合物的形成使細胞失去生長控制19kD的E1B蛋白可能與抑制腺病毒轉(zhuǎn)化細胞的凋亡有關(guān) 293細胞為Ad5DNA片段轉(zhuǎn)化的細胞 其基因組含有腺病毒DNA左端的11 腺病毒載體 腺病毒作為載體的優(yōu)點與其他病毒載體比較腺病毒載體的改造 腺病毒作為載體的優(yōu)點 廣泛的細胞感染范圍不整合基因組非致病的病毒能得到較高的病毒滴度容易構(gòu)建 容易改造不隨生殖種系遺傳 與其他病毒載體比較 腺病毒載體的改造 去掉了E1 由293細胞反式提供 去掉了E3 與病毒引起的細胞免疫反應(yīng)相關(guān) 不影響病毒成長可插入約7 5kb的外源DNA片段 insert 腺病毒載體的其他改造 第二代腺病毒 去掉了E2或E4 第三代腺病毒 幾乎去掉了腺病毒所有基因 Ad5 F35 5型fiber換成35型fiber Ad5 F3 5型fiber換成3型fiber 溶瘤型腺病毒 保留了E1區(qū)部分基因 條件復(fù)制型腺病毒 由條件啟動子啟動E1 腺病毒載體的應(yīng)用 腺病毒載體應(yīng)用的領(lǐng)域腺病毒載體應(yīng)用過程中的瓶頸 腺病毒載體的應(yīng)用領(lǐng)域 基因轉(zhuǎn)染蛋白表達基因治療腺病毒疫苗細胞移植iPS 腺病毒載體應(yīng)用的瓶頸 病毒靶向性問題病毒的免疫原性為題 TargetingAd vetors GeneticmodificationofviralcoatproteinsTumor specificpromotersConjugationwithtargetingligandsorpolymers EludingAdenoviralVectorImmunity ImmunosuppressionImmunomodulationserotypeswitchingUseoftargetedAdvectorsmicroencapsulationofAdvectorsuseofhelper dependent HD AdvectorsdevelopmentofnonhumanAdvectors Adxsi載體系統(tǒng) 腺病毒載體構(gòu)建流程Adxsi載體系統(tǒng)特點與其他載體系統(tǒng)的比較常用穿梭載體介紹 重組腺病毒的構(gòu)建流程 病毒載體構(gòu)建病毒包裝 小量擴增病毒大量擴增及純化滴度測定 Adxsi載體特點 Ad5型E1 E3缺陷的腺病毒直接連接的方案 I CeuI I SceI雙酶切 重組克隆陽性率高能包裝對細胞有毒性的基因或者對病毒包裝復(fù)制擴增等有干擾作用的基因病毒滴度高 與其他載體系統(tǒng)比較 體外直接連接 Clontech公司Adeno X系統(tǒng) 細菌內(nèi)同源重組 Adeasy系統(tǒng) 293細胞里面同源重組 本元正陽Admax系統(tǒng) 體外同源重組 invitrogen公司 ViralPower系統(tǒng) 常用穿梭載體介紹 各種報告基因的載體各種標(biāo)簽的載體誘導(dǎo)表達穿梭載體系統(tǒng)iPS相關(guān)載體系統(tǒng) 2A載體構(gòu)建流程 iPS相關(guān)腺病毒載體 腺病毒載體的質(zhì)檢 穿梭載體的質(zhì)量檢測 酶切 測序 PCR病毒載體的質(zhì)量檢測 酶切 測序 PCR病毒包裝過程檢測 鏡下觀察 CPE病毒的質(zhì)量檢測 滴度測定 PCR RCA及純度檢測 CPE早期 CPE晚期 滴度測定方法介紹 OD260法空斑形成法TCID50法 VP PFU IU VP 病毒顆粒 viralparticle 包括 活 病毒和 死 病毒 用OD260法測定PFU 空斑形成單位 plaqueformationunit 梯度稀釋法測定IU 感染單位 infectiousunit TCID50法測定 OD260法 OD260 x viraldilution x cuvettedilution x1 1x1012 OPU mL只適合測定純化的腺病毒 TCID50法 T 101 d S 0 5 d Log10ofthedilution 1foraten folddilution S thesumofratios alwaysstartingfromthefirst10 1dilution 1 1 1 1 1 1 0 6 0 2 0 0 6 8Titer T 101 1 6 8 0 5 107 3 for100uLaliquotofvirus T 108 3 equivalentto2x108 TCID50 mLT a 10bTCID50 ml a 10b 0 7PFU ml 1x108 3 0 7PFU mL 1x107 6PFU mL 4x107PFU mL 各種方法比較 RCA的定義 復(fù)制型腺病毒 replicationcompetentadenoviruses 簡稱RCA 是在用含腺病毒絕大部分基因組的骨架質(zhì)粒與攜帶外源基因表達框的穿梭質(zhì)粒在293細胞或細胞內(nèi)同源重組產(chǎn)生腺病毒載體的過程中 重組腺病毒的基因組與整合在293基因組上的E1基因同源序列間發(fā)生同源重組而產(chǎn)生的 同源重組導(dǎo)致目的基因丟失而被E1區(qū)代替 RCA的特征 在本不支持復(fù)制缺陷型腺病毒載體復(fù)制的細胞株 如A549細胞 上可復(fù)制和擴增 產(chǎn)生細胞病變 并可形成噬斑 RCA replicationcompetent infectiousparticle IU replicationdefective infectiousparticle non infectiousparticles 腺病毒載體最終制品中的病毒粒子類型 VP allvectorparticles RCA是如何產(chǎn)生的 Homologousoverlapbetween293 E1andvectorbackbone 450bp E1in293genome Transgenecassette E1from293genome 1100bp 如何檢測RCA 細胞法 在不支持復(fù)制缺陷型腺病毒載體增殖的細胞如A549上進行檢測 用噬斑形成的數(shù)量來反應(yīng)制品中RCA的含量 PCR法 設(shè)計針對E1區(qū)的引物 可以特異地檢出攜帶E1A區(qū)基因的RCA病毒粒子 如何降低制品中的RCA 現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的腺病毒重組系統(tǒng) 如AdMAX AaEasy 都不可避免地會產(chǎn)生RCA 近來 荷蘭一家公司建立了一株新的稱為PERC6的腺病毒包裝細胞株 這種細胞基因組上整合的腺病毒基因成分與腺病毒載體骨架沒有同源區(qū) 用這種細胞生產(chǎn)復(fù)制缺陷型腺病毒載體理論上不會產(chǎn)生RCA 我們能做的就是控制病毒在293細胞中擴增的代次 如何使用和操作腺病毒 需要注意哪些安全措施 如何確定我的細胞是否適合感染 什么是MOI 如何測定最適MOI 感染細胞的流程病毒使用過程中的常見問題 需要注意哪些安全措施 橡膠手套 口罩 護目鏡 安全柜液體廢棄物用84處理過再高壓處理固體廢棄物用可高壓的袋收集后高壓處理 什么是MOI MOI是multiplicityofinfection的縮寫 中文譯為感染復(fù)數(shù) 傳統(tǒng)的MOI概念起源于噬菌體感染細菌的研究 其含義是感染時噬菌體與細菌的數(shù)量比值 也就是平均每個細菌感染噬菌體的數(shù)量 噬菌體的數(shù)量單位為pfu 一般認為MOI是一個比值 沒有單位 其實其隱含的單位是pfunumber cell 后來MOI被普遍用于病毒感染細胞的研究中 含義是感染時病毒與細胞數(shù)量的比值 如何測定最適MOI 要得到最佳的實驗結(jié)果 確定腺病毒的最佳用量是非常重要的 如果用量不足 那么不能達到100 的感染效率 如果用量太高 會對細胞有毒害作用或者其他不可預(yù)測的效應(yīng) 我們應(yīng)該盡量用最小濃度的病毒來達到100 的基因傳遞效率 這個最佳的濃度因不同的細胞類型而有顯著差異 為了確定你的細胞系的最適病毒用量 可以用帶報告基因的腺病毒做預(yù)實驗 如AdCMV gal或者AdCMV GFP 用不同稀釋倍數(shù)的報告基因病毒感染細胞 在感染1 2天后檢測感染效率 可以通過 gal染色或者通過在熒光顯微鏡下觀察細胞的GFP的表達情況來確定可達到100 感染效率但又不會引起細胞表型變化病毒濃度范圍 感染細胞的流程 培養(yǎng)細胞至70 80 左右進行感染用2ml含10 FBS血清的培養(yǎng)基稀釋病毒 病毒用量參照最適MOI值 吸取原來六孔板中培養(yǎng)基的舊的培養(yǎng)基 加入稀釋病毒的培養(yǎng)基 5 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)如果細胞狀態(tài)不好可以考慮第二天更換培養(yǎng)液 狀態(tài)好的話可以不用換 培養(yǎng)細胞至70 80 左右進行轉(zhuǎn)染用1ml無血清的培養(yǎng)基稀釋病毒 病毒用量參照最適MO