液相色譜儀日常維護及常見故障 - 復(fù)件.ppt

液相色譜儀日常維護及常見故障分析 主講 趙廣義 1流動相2脫氣機 在線 3泵 單元 二元 四元 4進樣器 手動 自動 5色譜柱6檢測器 VWD DAD FLD RID 一 液相色譜儀日常維護及注意事項 所用溶劑應(yīng)為HPLC級 水應(yīng)為二次超純水 所用溶劑應(yīng)經(jīng)過過濾 過濾水應(yīng)使用水相濾膜 過濾有機相應(yīng)使用有機相濾膜 不能混用 也不要用錯 每一張濾膜只能用一次 不能重復(fù)使用 如果沒有在線脫氣機 所用溶劑應(yīng)經(jīng)過超聲脫氣 水易滋生藻類 避免直接照射 過濾后的水最好使用不要超過兩天 如果條件允許可向溶劑中加入0 001 0 0001M的疊氮化鈉 注意溶劑的相容性 避免使用不相容的溶劑 避免使用強酸 強堿或有機氯等腐蝕性溶劑 在溶劑瓶中的溶劑過濾頭可能會堵塞 必要時小心拿下用強酸 35 硝酸 浸泡1小時 用水沖洗 但不要使用超聲處理 1流動相 溶劑的相溶性 溶劑信息 避免使用下列對不銹鋼有腐蝕性的溶劑 鹵化物堿金屬溶液和相應(yīng)的酸溶液 高濃度的無機酸例如 硝酸和硫酸 能夠形成鹵素自由基或酸的氯化試劑及其混合物 含有過氧化物的色譜級醚必須用氧化鋁干燥劑 在有機溶劑中的有機酸溶液 含有強絡(luò)合劑的溶液 四氯化碳和異丙醇或THF混合液 溶劑截止波長 所以在使用紫外檢測器時 所用波長應(yīng)至少比所用溶劑的截止波長大20nm以上 在使用紫外檢測器時 所用波長與所用溶劑的截止波長接近 或低于截止波長 時 容易產(chǎn)生噪音干擾 從而影響檢測結(jié)果 生色團和最大吸收波長 溶劑 PH 溫度等都會影響生色團的最大吸收峰的強度和位置 溶劑過濾 選擇合適的濾膜 聚四氟乙烯濾膜 適用于所有溶劑 酸和鹽 并無任何可溶物 醋酸纖維濾膜 適用于水基溶劑 不適用于有機溶劑 推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)的樣品 尼龍66濾膜 適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液 可用于強酸 70 乙醇 二氯甲烷 不適用于DMF二甲基甲酰胺 再生纖維素濾膜 具有蛋白質(zhì)吸收低 同樣適用于水溶性樣品和有機溶劑 注意 1 每張濾膜只能用一次 2 水相和有機相不要搞混 柱塞清洗附件SealWash HPLC使用緩沖溶液Buffer時 由于緩沖鹽溶液存在高壓鹽析現(xiàn)象 析出的細(xì)小鹽粒會損傷藍寶石柱塞桿和密封墊 從而造成漏液等故障現(xiàn)象 因而建議選配柱塞清洗附件SealWash 緩沖鹽濃度大于0 01mol時 強烈建議選配在線的柱塞清洗附件SealWash 清洗液配置 90 水 10 異丙醇溶液 流速為2 3滴 min 該混合液可抑制菌類生長和降低水的表面張力 清洗液虹吸流出 不能干涸 目的 脫氣方法 氦氣脫氣回流加熱脫氣真空脫氣超聲脫氣 排除溶解在流動相中的氧氣和氮氣 2脫氣機 阻尼器 壓力傳感器 泵驅(qū)動 溶劑瓶 梯度比例閥 主動輸入閥AV 出口球閥BOV 清洗閥PurgeValve 柱塞桿Piston 3泵 二元泵工作原理 Damper Purgevalve Mixer A B Inletvalve Outletvalve 泵的注意事項 1 溶劑的過濾 脫氣 2 避免使用腐蝕性溶劑 3 在滿足分析的前提下 盡可能使用較低的流速 較低的系統(tǒng)壓力 4 更換過濾白頭 5 考慮溶劑的相容性 6 盡可能使用新鮮的水 7 使用0 01M以上濃度的緩沖溶液要選配柱塞清洗組件 清洗液不能干涸 8 使用正相溶劑比如環(huán)己烷時 建議使用聚乙烯密封墊 在0 200Bar下使用聚乙烯密封墊比標(biāo)準(zhǔn)密封墊更耐磨損 四元泵 四元泵多通道比例閥MCGV使用時注意 緩沖溶液要放在下面通道 以避免鹽顆粒析出 二元泵 設(shè)置壓縮因子補償 以達到最佳比例效果 4進樣器 FromPump ToWaste 手動進樣器 樣品要干凈 經(jīng)過過濾 合適的進樣體積 比如定量環(huán)為20ul 進樣體積應(yīng)為0 10ul 或者20ul 進樣20ul時注射樣品量應(yīng)至少60ul以上 定期清洗進樣閥 清洗過程如下 1 將進樣閥旋至Inject位置 2 用帶有專用頭的注射器用純水約20 30ml沖洗進樣閥 3 將進樣閥旋至Load位置 參考左圖 手動進樣器 自動進樣器 準(zhǔn)備位置 調(diào)用樣品瓶吸樣品 進樣和運行位置 標(biāo)準(zhǔn)進樣過程 自動進樣器 樣品要干凈 經(jīng)過過濾 洗針 把樣品殘留降低到最小限度 可降低進樣的記憶效應(yīng) 洗針瓶最好不要加瓶墊 多次吸液用于進樣量大于100ul 5色譜柱 色譜柱保護 過濾所有的溶劑和樣品使用保護柱儀器在使用完畢 要沖洗整個系統(tǒng) 移走系統(tǒng)中的緩沖液 柱子在不使用時 兩端密封保存在適當(dāng)?shù)娜軇┲斜４嬷幼⒁馍V柱的pH值使用范圍不要高壓沖洗柱子不要高溫下過長時間使用硅膠鍵合相 色譜柱的再生 進行色譜柱再生時 應(yīng)使用一個廉價的泵 我們建議最好不使用您的高效液相色譜儀上的泵 色譜柱尺寸柱體積所用溶劑的體積125 41 6ml30ml250 43 2ml60ml250 10 20ml400ml請根據(jù)下表選擇您的再生方法 極性固定相 如Si NH2 DIOL基色譜填料 的再生 正庚烷 氯仿 乙酸乙酯 丙酮 乙醇 水 非極性固定相 如反相色譜填料RP 18 RP 8 CN等 的再生 水 乙腈 氯仿 或異丙醇 乙腈 水0 05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱注意 在對NH2改性的色譜柱進行再生時 由于NH2可能成銨根離子的形式存在 因此應(yīng)該在水洗后用0 1M的氨水沖洗 然后再用水沖洗至堿溶液完全流出 如果簡單的有機溶劑 水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì) 用0 05M稀硫酸沖洗非常有效 6檢測器 VWD的光源 氘燈有一定的半衰期 一般為1000小時左右 所以在沒有樣品分析任務(wù)時要關(guān)閉氘燈 以延長氘燈的使用壽命 流動池污染后 會造成靈敏度下降 噪聲加大 應(yīng)避免臟的樣品進入流動池 定期使用異丙醇沖洗系統(tǒng)對保持流動池性能有一定好處 更換氘燈 能引起HPLC發(fā)生問題的潛在因素 工作環(huán)境電源及地線流動相泵進樣器保護柱在線過濾器連接管路色譜柱檢測器數(shù)據(jù)處理裝置操作 二 液相色譜儀故障分析 邏輯判斷及處理問題化學(xué)品環(huán)境機器 色譜柱 保護柱 電源 泵 溶液 地線 進樣器 樣品 溫度 檢測器 濕度 數(shù)據(jù)處理單元 清潔程度 液相色譜儀器出現(xiàn)故障可以從多方面入手 1 從部件的運轉(zhuǎn)情況推測 如壓力 流速的變化2 從色譜圖的異常情況推測 如出峰時間 峰形3 從數(shù)據(jù)結(jié)果中分析 流動相內(nèi)含有空氣 脫氣處理檢測池內(nèi)有氣泡 沖洗檢測池或在檢測池出口接一段內(nèi)徑0 009 的管子 此法只適用于耐壓檢測器 色譜柱內(nèi)有未洗脫盡的組份 洗脫色譜柱 系統(tǒng)有漏液之處 檢漏并處理電噪聲 去除噪聲源 信號線屏蔽 檢查系統(tǒng)接地狀況檢測器光源燈能量低 更換光源燈檢測池污染 沖洗檢測池 典型故障分析及實例基線噪聲 基線周期性噪聲絕大多數(shù)情況下是來源于泵的問題泵頭內(nèi)有氣泡 流動相脫氣 泵頭排氣 注意正確的排氣方法 泵進出口閥有問題 更換閥組件柱塞桿有問題 更換柱塞桿及其密封圈溶劑混合不良 加裝混合器電噪聲 去除噪聲源 非周期性噪聲氣泡 流動相脫氣檢測池內(nèi)有氣泡 流動相脫氣 檢測池后加適當(dāng)反壓系統(tǒng)有漏液之處 檢漏并處理溶劑混合不良 加裝混合器電噪聲 去除噪聲源 基線漂移梯度系統(tǒng) 溶劑A于溶劑B的ABS值相差大 試用另種溶劑或使用基線扣除法色譜柱有其他組份被洗脫出 沖洗 直至基線穩(wěn)定溶劑發(fā)生變化 如溶入氣體或溶劑揮發(fā) 氦氣或脫氣機脫氣 溶劑瓶避光 密封 但要注意防止溶劑瓶內(nèi)產(chǎn)生負(fù)壓 系統(tǒng)有漏液之處 檢漏并處理環(huán)境溫度影響 尤其對示差 電導(dǎo) 電化學(xué)檢測 室溫 柱溫 檢測池溫度控制反壓變化 溶劑和樣品過濾 注意黏度過大的樣品 基線周期性波動溫度影響 環(huán)境溫度及檢測池溫度控制 注意空調(diào)機的影響溶劑混合不良 加裝混合器流動相脫氣不良 流動相脫氣供電電源的影響泵不良 檢修處理 基線有無規(guī)律的尖峰氣泡 溶劑脫氣電路接觸不良 保證清潔 接線牢固 接點無氧化光源燈不良 檢查處理電噪聲 去除噪聲源 無樣品峰未進樣泵未工作漏液流動相或樣品的問題柱子或保護柱的問題數(shù)據(jù)采集裝置的問題或其與檢測器連線的問題最簡單快捷的檢查 泵是否工作 系統(tǒng)是否漏液 進一針丙酮溶液檢查檢測器讀數(shù)及數(shù)據(jù)單元是否有響應(yīng) 負(fù)峰組份的ABS值小于溶劑的ABS值氣泡通過了檢測池對RI檢測器不一定是有了問題 很可能是正常的所有峰都是負(fù)峰 可能是檢測器輸出與數(shù)據(jù)單元連線極性接反 峰形不好 如峰拖尾 峰分叉 出肩膀在線過濾器 INLINEFILTER 污染 通常會伴隨有系統(tǒng)壓力升高之現(xiàn)象 色譜柱污染系統(tǒng)有不正常的死體積 檢查管路連接是否正確 內(nèi)徑 接頭保護柱 GUARDCOLUMN 污染溶劑不好或使用不對樣品不好色譜柱壞了 PH8會破壞柱子內(nèi)的填料 流速變化率太大 操作上應(yīng)注意 兩個要點 峰保留時間 RT 重現(xiàn)性 峰面積重現(xiàn)性RT重現(xiàn)性不好 無規(guī)律變化 流量不穩(wěn) 氣泡 漏液 泵 溫度影響有規(guī)律的變化 且逐漸趨于穩(wěn)定 系統(tǒng)未充分平衡RT重現(xiàn)性好 但峰面積重現(xiàn)性不好 進樣量 選用定量管進樣時 進樣體積應(yīng)大于3倍定量管容積 樣品 氣泡 樣品在流動相各組份中不能充分溶解 通常伴隨有柱壓逐漸升高且經(jīng)反沖后 柱壓會恢復(fù)正常之現(xiàn)象 基線噪聲的影響 積分處理的影響 系統(tǒng)性能 重復(fù)性差 常見故障分析列表 一 從壓力變化判斷 1 壓力無 2 壓力高 3 壓力低 4 壓力不穩(wěn) 1 峰前沿 二 從色譜圖的異常情況推測 2 峰拖尾 3 峰變寬 4 峰分叉 5 無峰 6 負(fù)峰 7 鬼峰 8 保留時間變化 9 保留時間不斷變化 10 基線漂移 11 無規(guī)則基線噪音 12 規(guī)則基線噪音 三 從數(shù)據(jù)結(jié)果中分析 1 定量結(jié)果 2 定性結(jié)果 想一想 看一看 1 HPLC系統(tǒng)中各機器是否開機正常2 溶劑瓶內(nèi)溶劑是否新鮮且脫氣3 泵是否已初始化且工作正常4 系統(tǒng)管路及電路是否連接正常5 檢測器是否通過自檢且工作正常6 溶劑瓶會不會產(chǎn)生負(fù)壓7 溶劑的PH值是否合適8 對溫度敏感的檢測器是否被陽光直射或被空調(diào)直吹9 溶劑瓶是否被陽光直射10 停機前是否將系統(tǒng)及柱子中的緩沖液置換干凈11 較長時間停機之前是否將柱子摘下 且系統(tǒng)最后用甲醇沖洗過 系統(tǒng)不能在緩沖液或THF下長時間停機 12 樣品是否能完好的溶于流動相13 所選用的過濾膜是否正確14 若用7725i進樣器 所用的進樣針是否正確 切忌 示差 熒光檢測器的出口管堵塞直接用甲醇置換緩沖液進的樣品會在流動相中產(chǎn)生沉淀用水溶性濾膜過濾有機溶劑溶劑 特別是緩沖液撒漏在機器內(nèi)流速變化率太大高溫使用下的柱子尚未降下溫度就停泵陽光直射溶劑瓶或檢測器空調(diào)直吹檢測器溶劑瓶完全密封 液相色譜儀 hplc 的保養(yǎng)1 HPLC的日常操作條件 溫度 10 30 相對濕度 80 最好是恒溫 恒濕 遠(yuǎn)離高電干擾 高振動設(shè)備 2 泵的保養(yǎng) 1 使用流動相盡量要清潔 2 進液處的沙芯過濾頭要經(jīng)常清洗 3 流動相交換時要防止沉淀 4 避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡 3 進樣器的保養(yǎng) 1 每次分析結(jié)束后 要反復(fù)沖洗進樣口 防止樣品的交叉污染 4 柱的保養(yǎng) 1 柱子在任何情況下不能碰撞 彎曲或強烈震動 2 當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時 閥件或管路一定要清洗干凈 3 要注意流動相的脫氣 4 避免使用高粘度的溶劑作為流動相 5 進樣樣品要提純 6 嚴(yán)格控制進樣量 7 每天分析工作結(jié)束后 要清洗進樣閥中殘留的樣品 8 每天分析測定結(jié)束后 都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?9 若分析柱長期不使用 應(yīng)用適當(dāng)有機溶劑保存并封閉 5 檢測器 UV 的保養(yǎng) 1 紫外燈的保養(yǎng) 在分析前 柱平衡得差不多時 打開檢測器 在分析完成后 馬上關(guān)閉檢測器 2 樣品池要保養(yǎng) HPLC的正確使用和科學(xué)保養(yǎng) 1 保持貯液瓶清潔 對專用貯液瓶應(yīng)定期清洗 用試劑瓶作貯液瓶時 要經(jīng)常更換 2 定期 如半個月 在稀硝酸溶液中超聲 清洗過濾器 保持過濾器暢通無阻 3 使用HPLC試劑和新蒸二次蒸餾水作流動相 所使用的溶劑其截止波長一定要低于檢測波長 對不是HPLC級的試劑要進行過濾 HPLC試劑出廠前已用0 02 m濾膜過濾 對流動相一定要脫氣 4 每天開始使用儀器 注意放空排氣 確保泵頭 流動池以及其它流路系統(tǒng)中無氣泡存在 5 珍惜保護色譜柱 避免柱頭突然產(chǎn)生大的波動 擾動損傷柱床 如避免泵啟動過速 升壓過快 樣品閥搬動過慢所造成的柱壓大的波動 6 采用保護 警戒 柱 延長柱壽命 如污染物堆積于保護柱柱頭 造成柱壓升高 柱效下降 峰形變差時 卸下用強溶劑反沖后再用或更換新保護柱 7 避免超負(fù)荷進樣 對250 4 6mm的柱子 絕對進樣量應(yīng)不超過100 g 在靈敏度允許的前提下 應(yīng)盡量將試樣濃度降低 減少絕對進樣量 進樣體積可保持不變 這是保持HPLC柱性能持久良好的重要舉措之一 8 經(jīng)常用強溶劑沖洗柱子 將柱內(nèi)強保留組分及時洗脫出 反相柱用異丙醇 二氯甲烷 1 1 沖洗 正相 硅膠柱 用純甲醇或異丙醇沖洗 時間均不少于1h 9 做完試驗 及時用適當(dāng)溶劑沖洗柱子和進樣閥 尤其是對過夜的柱子和進樣閥 一定要用足量的水徹底洗凈其中的鹽類 緩沖液 再用甲醇或乙腈沖洗 并保存在乙腈中 正相柱保存在非極性有機溶劑 如己烷 中 10 以硅膠為基質(zhì)的柱子 如C 18 C 8等 要控制好流動相的pH值 一般不要低于2 5 不高于7 0 11 盡量用流動相溶解樣品 一是避免出現(xiàn)拖尾峰 怪峰 二是避免試樣在系統(tǒng)中由于溶解度降低而析出 12 對于阻塞或受傷嚴(yán)重的柱子 必要時 可卸下不銹鋼濾板 超聲洗去濾板阻塞物 對塌陷污染的柱床進行清除 填充 修補工作 此舉可使柱