成人淋球菌性眼炎致失明一例.docx

斑點印跡雜交法檢測四環(huán)素抗性基因斑點印跡雜交法檢測四環(huán)素抗性基因中華皮膚科雜志 1999年第3期第32卷 短篇論著作者：駱丹聶劉旺魯曉萱黃澍杰謝禮豪徐文嚴朱文元單位：駱丹朱文元210029南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科；聶劉旺魯曉萱南京鐵道醫(yī)學院生物教研室；徐文嚴中國醫(yī)學科學院中國協(xié)和醫(yī)科大學皮膚病研究所；黃澍杰謝禮豪廣東省江門市皮膚病防治所解脲支原體(Uu)是一種缺乏細胞壁、因而對內(nèi)酰胺類抗生素治療無效的微生物，故對Uu感染引起的臨床癥狀常用四環(huán)素、紅霉素類等藥物治療。因上述藥物的廣泛使用，四環(huán)素抗性基因(tetM)在各種微生物間的轉(zhuǎn)座或轉(zhuǎn)化作用等，使Uu耐藥株不斷增加。通過微生物藥物敏感性試驗(MIC)及聚合酶鏈反應(PCR)技術可檢測耐藥程度、耐藥種類及四環(huán)素耐藥決定子(tetM)。本研究擬對tetM標準株PCR擴增產(chǎn)物進行地高辛標記制備成核酸探針，再行斑點印跡雜交試驗?，F(xiàn)報道如下。一、材料與方法(一)藥品、試劑與實驗菌株：標準品鹽酸四環(huán)素由中國生物制品檢定所提供；PCR相關試劑均購自華美及復華生物工程公司；HybondN尼龍膜為英國Amersham公司產(chǎn)品；地高辛(Dig)標記檢測系統(tǒng)試劑盒為德國寶靈曼公司產(chǎn)品。42Uu株為臨床非淋菌性尿道炎(宮頸炎)患者泌尿生殖道分泌物培養(yǎng)鑒定后陽性株標本，傳代3次后收集備用于MIC測定、PCR擴增模板及基因組DNA提取后的分子雜交。(二)TRNGtetMPCR產(chǎn)物的回收、純化與標記：將200LTRNGtetMPCR產(chǎn)物經(jīng)1.5瓊脂糖凝膠電泳后，取出DNA熒光帶置Eppendorf管中搗碎，加等體積平衡酚振蕩搖勻及70冰凍各10min，12000r/min離心10min后再按酚氯仿抽提法制備純化DNA，20保存以備標記用。標記前首先變性模板DNA，按試劑盒說明在冰上依次加入相應試劑，37保溫過夜后，終止標記反應，再行乙醇沉淀漂洗所標記的DNA探針，并以TE溶解保存。(三)Dot?Blot印跡雜交：分別將UutetMPCR產(chǎn)物3L及Uu分離株DNA提取物模板10L加熱變性冷卻后直接點膜于HybondN尼龍膜上，80烘烤2h固定膜上DNA。以預雜交液(50去離子甲酰胺，5Denhart液，0.1g/mL變性鮭魚精子DNA等)68預雜交2h。變性DNA探針后加入正式雜交體系，68雜交過夜。次日經(jīng)高濃度到低濃度SSC洗滌后，封閉非特異性雜交，依照試劑盒說明進行免疫檢測顯示雜交結果。二、結果(一)Uu株四環(huán)素MIC分布與tetM基因擴增檢測：42株Uu對四環(huán)素敏感性的檢測表明，MIC達8g/mL以上有12株；30例tetM決定子陽性的Uu株其MIC水平分布于0.0632g/mL。(二)tetMPCR產(chǎn)物的斑點印跡雜交：以載tetM的TRNG作為對照，經(jīng)PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳回收純化及標記后，對上述30例PCR陽性產(chǎn)物進行斑點印跡雜交分析。結果出現(xiàn)陽性雜交信號28例，陰性2例。(三)不同MIC株DNA提取物的斑點印跡雜交：采用前述核酸探針與各濃度的Uu株DNA提取物直接點膜雜交，結果只有MIC16g/mL以上的Uu株DNA才可出現(xiàn)陽性雜交信號，此探針不能與MIC8g/mL以下的Uu分離株DNA提取物反應出現(xiàn)肉眼可見的雜交信號，12例PCR擴增檢測陰性者亦未出現(xiàn)陽性雜交信號。三、討論采用96孔板微量肉湯稀釋法篩選藥物敏感株是經(jīng)典的微生物敏感性試驗，此法可同時檢測某種微生物對多種抗菌藥物在不同濃度下的敏感性如何，但存在檢測時間長，判斷易有主觀性等問題。分子生物學技術如核酸探針、PCR擴增等均可通過檢測微生物自身的藥物抗性基因存在與否來檢測耐藥菌株。我們的實驗結果發(fā)現(xiàn)tetM抗性基因的PCR陽性檢測率并非完全與MIC濃度有明確相關性，即tetM抗性基因陽性與否與MIC濃度大小無明顯相關，但tetM陽性提示有可能從敏感株發(fā)展成中度敏感株(MIC=8g/mL)或耐藥株(MIC16g/mL)，因此在性病臨床防治及流行病學研究方面應予重視及監(jiān)測隨訪。為進一步闡明耐藥基因與MIC檢測的關系，本研究采用核酸探針技術分別對藥物抗性基因的PCR產(chǎn)物及基因組DNA進行斑點印跡雜交分析。結果表明地高辛標記的TRNG?tetMPCR產(chǎn)物核酸探針可與Uu株28/30份PCR產(chǎn)物產(chǎn)生陽性雜交信號，其陽性率為93.3，將此探針直接與分離株DNA提取物點膜雜交后發(fā)現(xiàn)，只有MIC16g/mL和MIC=32g/mL者可出現(xiàn)陽性雜交信號，低于此濃度者未獲陽性雜交結果。此說明耐藥基因經(jīng)過PCR擴增后，tetM決定子的拷貝數(shù)可能增多，可通過核酸探針這一敏感性相對較低的方法檢測之；MIC達16g/mL以上的培養(yǎng)物DNA提取物模板能被標記的tetM核酸探針檢測出來是否與拷貝多少相關尚不清楚。值得提出的是若以MIC16g/mL判為Uu耐四環(huán)素藥物的水平標準，則核酸探針檢測的結果與之吻合，此亦便于為臨床治療提供參考。而PCR檢測法頗為靈敏，在MIC=0.06g/mL時即可出現(xiàn)陽性結果。因此可將PCR擴增作為篩查耐藥基因攜帶株的檢測手段，并以核酸探針雜交分析對PCR結果進一步肯定證實，同時亦可對MIC測定的耐藥程度或耐藥性加以佐證。參考文獻1朱慧蘭，徐廣坤，賴維，等.解脲支原體中tetM基因的檢測及臨床應用評價.中華皮膚科雜志,1998,31:185186.2駱丹，黃澍杰，謝禮豪，等.解脲支原體對七種抗菌藥物的敏感性測定及其與相關耐藥基因檢測的比較.中華皮膚科雜志,1998,31:152155.3盧圣棟主編.現(xiàn)代分子生物學實驗技術.北京：高等教育出版社.1993.4 Kenny GE, Cartwright FD, Susceptibilities of Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae, and Ureaplasma urealyticum to new glycyclines in comparison wit