過(guò)氧化氫酶的活力和動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定.docx

一、酶活力測(cè)定（一）原始數(shù)據(jù)1.樣品原始質(zhì)量：嫩豆芽5.010g2.標(biāo)定數(shù)據(jù)：（1）KMnO4質(zhì)量數(shù)及配制：0.02mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液配制：稱(chēng)取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000mL ，臨用前用草酸鈉標(biāo)定。（2）Na2C2O4質(zhì)量數(shù)：稱(chēng)取優(yōu)級(jí)純Na2C2O4 13.4g，用蒸餾水溶解后，定容至1L。（3）標(biāo)定數(shù)據(jù)：取5mL0.1mol/L的草酸和3mL10% H2SO4溶液于錐形瓶中，加熱至（7585）（見(jiàn)冒熱氣），趁熱用KMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，剛開(kāi)始反應(yīng)較慢，滴入一滴KMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液搖動(dòng)，待溶液褪色，再加第二滴KMnO4（此時(shí)生成的Mn2+起催化作用）。隨著反應(yīng)速度的加快，滴定速度也可逐漸加快，但滴定中始終不能過(guò)快，不斷搖動(dòng)或攪拌。滴定至溶液呈現(xiàn)微紅色并持續(xù)半分鐘不褪色即為終點(diǎn)。2KMnO4+5Na2C2O4+8H2SO4=2MnSO4+5Na2SO4+K2SO4+10CO2+8H2O（4）KMnO4實(shí)際濃度：0.019mol/L3.樣品滴定數(shù)據(jù)編號(hào)活酶死酶1212加入酶液體積(mL)2.52.52.52.5加入10%H2SO4體積(mL)2.52.52.52.5加入0.1ml/LH2O2體積(mL)2.52.52.52.5加入KMnO4體積(mL)0.230.241.901.94（二）結(jié)果計(jì)算1換算系數(shù)（1mL KMnO4溶液相當(dāng)于多少mg H2O2）2KMnO4+5H2O2+2H2SO4=K2SO4+MnSO4+5O2+2H2O2 5 2 1 1 5 2 1.9*10-5 4.75*10-5 m(H2O2)=4.75*10-5*34*1000=1.615mg2.樣品酶活計(jì)算（每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示：mg H2O2/gmin）酶活力用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示酶活(mgH2O2/gmin)= 式中： A對(duì)照KMnO4滴定毫升數(shù)； B酶反應(yīng)后KMnO4滴定毫升數(shù)； VT酶液總量（ml）； V1反應(yīng)所用酶液量（ml）； F W樣品鮮重（g）； 1.71ml 0.02mol/L的KMnO4相當(dāng)于1.7mg H2O2酶活(mgH2O2/gmin)=0.235*50*1.7/(5.010*2.5*10)=0.159(mgH2O2/gmin)二、動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定（一）原始數(shù)據(jù)編號(hào)12345消耗的KMnO4（mL）0.280.350.410.721.33（二）求出各管反應(yīng)前的底物濃度S0和反應(yīng)速度V0編號(hào)12345S0 （mol/L）5.000*10-36.700*10-38.700*10-31.250*10-22.500*10-2V0 （mmol/min）7.340*10-31.008*10-21.351*10-22.391*10-23.737*10-2（三）以1/V0對(duì)1/S0作圖（用excel作圖）（四）求出Km（mol/L）和Vmax（mmol/min）求得線性關(guān)系為y=1.3921x+0.0111所以Vmax=1/0.0111=8.654*10-2 KM=1.205*10-1第四部分：課后研討題1.總結(jié)本實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程的注意事項(xiàng)。(1)每個(gè)三角瓶?jī)?nèi)的酶促反應(yīng)時(shí)間要精確控制在5min。(2)各反應(yīng)瓶的滴定終點(diǎn)微紅色應(yīng)為同一標(biāo)準(zhǔn)。(3)使用前，應(yīng)檢查滴定管是否滲漏，滴定過(guò)程中應(yīng)該保證逐滴加入。2.影響過(guò)氧化氫酶活力測(cè)定的因素有哪些?溫度，pH值和底物濃度3.過(guò)氧化氫酶與哪些生化過(guò)程有關(guān)?過(guò)氧化氫酶能催化過(guò)氧化氫分解為水和氧分子，在此過(guò)程中起傳遞電子的作用。4.在反應(yīng)速度的測(cè)定中，加入硫酸有哪些作用？提供反應(yīng)所需的酸性條件，并作為反應(yīng)物參與反應(yīng)5.米氏方程中的Km有何實(shí)際應(yīng)用？(1)鑒定酶：通過(guò)測(cè)定Km,可鑒別不同來(lái)源或相同來(lái)源但在不同發(fā)育階段，不同生理狀態(tài)下催化相同反應(yīng)的酶是否是屬于同一種酶。(2)判斷酶的最適底物（天然底物）。(3)計(jì)算一定速度下底物濃度。(4)了解酶的底物在體內(nèi)具有的濃度水平。(5)判斷反應(yīng)方向或趨勢(shì)。(6)判斷抑制類(lèi)型。6.在什么條件下，酶的Km可以作為鑒定酶的一種手段，為什么？Km值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質(zhì)有關(guān)，與酶濃度無(wú)關(guān)。因此，當(dāng)?shù)孜?、PH、溫度和離子強(qiáng)度等條件相同時(shí)Km值為常數(shù)，對(duì)一酶促反應(yīng)而言，在一定的條件下都有特定的Km值，可用來(lái)鑒別酶。7.測(cè)定酶活力為什么要在進(jìn)程曲線的初速度時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行？要進(jìn)行酶活力測(cè)定，首先要確定酶反應(yīng)時(shí)間，酶的反應(yīng)時(shí)間并不是任意規(guī)定的，應(yīng)該在初速度時(shí)間范圍內(nèi)選擇?？梢酝ㄟ^(guò)進(jìn)程曲線的制作而求出酶的初速度時(shí)間范圍。進(jìn)程曲線是在酶反應(yīng)的最適條件下采用每隔一定時(shí)間測(cè)產(chǎn)物生成量的方法，以酶反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物生成量為縱坐標(biāo)繪制而成。從進(jìn)程曲線可知，在曲線起始一段時(shí)間內(nèi)為直線，其斜率代表初速度。隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，曲線趨于平坦，斜率變小，說(shuō)明酶的反應(yīng)速度下降。反應(yīng)速度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低這一現(xiàn)象可能是由于底物濃度的降低和產(chǎn)物濃度的增高致使逆反應(yīng)加強(qiáng)等原因所致。因此，要真實(shí)反映出酶活力大小，就應(yīng)在初速度時(shí)間內(nèi)測(cè)定。求出酶反應(yīng)初速度的時(shí)間范圍是酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的一系列研究中的組成部分和必要前提。8.過(guò)氧化氫酶的活力測(cè)定還有另外一種方法，即紫外吸收法，原理是H2O2在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶的活力。請(qǐng)你查閱資料設(shè)計(jì)一個(gè)應(yīng)用該方法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活力的實(shí)驗(yàn)。過(guò)氧化氫酶的活力測(cè)定紫外吸收法（參考百度文庫(kù)） 一。原理：H2O2在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶的活力。 二。材料、儀器與試劑 （一）、材料：小麥葉片 （二）、儀器（儀器的選擇在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前由學(xué)生在預(yù)習(xí)報(bào)告中提出方案后教師審定） 紫外分光光度計(jì)；離心機(jī)；研缽；250ml容量瓶1個(gè)；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恒溫水??； （三）、試劑（試劑的選擇在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前由學(xué)生在預(yù)習(xí)報(bào)告中提出方案后教師審定后并配制）0.2mol/L pH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)定）。 三、實(shí)驗(yàn)操作： 1.酶液提?。悍Q(chēng)取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，加入23ml 4下預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度?；旌暇鶆?qū)⒘科恐?冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000rpm下離心15min，上清液即為過(guò)氧化氫酶粗提液。5下保存?zhèn)溆谩?2.測(cè)定：取10ml試管3支，其中2支為樣品測(cè)定管，1支為空白管，按表40-2順序加入試劑。 表40-2 紫外吸收法測(cè)定H2O2樣品液配置表 管 號(hào) S0 S1 S2粗酶液(ml) 0.2（煮死酶液） 0.2 0.2 pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5蒸餾水(ml) 1.0 1.0 1.0 25預(yù)熱后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時(shí)，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測(cè)定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測(cè)4min，待3支管全部測(cè)定完后，按下式計(jì)算酶活力。 五、計(jì)算 以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（