「動物細(xì)胞生產(chǎn)藥用蛋白工藝的研究進(jìn)展」.doc

動物細(xì)胞生產(chǎn)藥用蛋白工藝的研究進(jìn)展學(xué)院： 專業(yè)：姓名： 學(xué)號：動物細(xì)胞生產(chǎn)藥用蛋白工藝的研究進(jìn)展【摘要】近年來，由于哺乳動物細(xì)胞具有對重組蛋白質(zhì)進(jìn)行正確折疊、裝配和翻譯后修飾的優(yōu)點，利用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)已成為生物制藥產(chǎn)業(yè)的重要組成部分。應(yīng)用哺乳動物工程細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)藥用蛋白顯示了越來越重要的地位。本文對動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量進(jìn)行了簡述?！娟P(guān)鍵詞】動物細(xì)胞；藥用蛋白；生產(chǎn)工藝近年來，動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的快速發(fā)展極大地推動了現(xiàn)代生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。這一技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)藥物研發(fā)、疫苗制造、干細(xì)胞移植、人造組織器官培養(yǎng)等各個領(lǐng)域，日益成為當(dāng)今生命科學(xué)研究和生物醫(yī)藥開發(fā)的強力工具。目前，國內(nèi)外一些科研機構(gòu)和高新技術(shù)企業(yè)正專注于這一領(lǐng)域的研究與開發(fā)，并不斷獲得新的科研成果和技術(shù)產(chǎn)品。這些新成果和產(chǎn)品的推廣應(yīng)用正引導(dǎo)著細(xì)胞培養(yǎng)工程技術(shù)走向當(dāng)今生物醫(yī)藥領(lǐng)域的技術(shù)前沿1。重組要用蛋白的翻譯后修飾是充分發(fā)揮其藥理活性、藥代動力學(xué)行為以及體內(nèi)穩(wěn)定性所必需的。這些翻譯后修飾包括蛋白的正確折疊、二硫鍵的形成、多聚化、蛋白酶加工、磷酸化以及充分糖基化，是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)進(jìn)行的。因此，有必要用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)形容生產(chǎn)治療用重組活性蛋白，特別是對與結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量巨大，或是二硫鍵數(shù)目多，或糖基化程度高的蛋白。有些天然結(jié)構(gòu)的藥用蛋白只能用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)。目前，投放市場以及臨床中試中的重組蛋白有70%來自哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)。隨著哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和重組藥用蛋白的需求，哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥用蛋白正在不斷增加2。以下就目前動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝以及提高藥用蛋白質(zhì)量的方法作一簡述。1. 目前公開發(fā)表工藝的研究蛋白治療藥物有單克隆抗體治療乳腺癌的Herceptin，免疫球蛋白腫瘤壞死因子(TNF) 受體融合蛋白治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的Enbrel 和滅活的甲肝疫苗Vaqta等。動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為一個受到普遍信任的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)，并逐步形成商業(yè)化操作水平。首先重組治療藥物，主要是重組蛋白或抗體，對產(chǎn)品應(yīng)用最有代表性的需要是生產(chǎn)產(chǎn)量與質(zhì)量，其生產(chǎn)形式至少70% 是采用攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)形式， 50%以上采用無血清培養(yǎng)；疫苗和組織替代品其產(chǎn)品來源許多不用的細(xì)胞系，它需要特殊的生物反應(yīng)器系統(tǒng)和培養(yǎng)液；雖然用于診斷的產(chǎn)品主要是單克隆抗體，類似于重組治療，但需求量明顯低，這就允許考慮多種特殊的生產(chǎn)形式和生物反應(yīng)器系統(tǒng)。因此，目前用哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白的工業(yè)化過程，可以看作是以攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)作為通用技術(shù)平臺，使用常用的三種細(xì)胞(CHO、SP2P0、NSO) 依托該平臺工藝并使其生產(chǎn)能力提高。平臺工藝的特點是采用無血清培養(yǎng)和成熟的流加和灌流工藝。1.1 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)工藝懸浮培養(yǎng)適于許多細(xì)胞培養(yǎng)，如雜交瘤、鼠骨髓瘤( SP2P0， NSO) ，對適于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞( CHO，BHK) 可進(jìn)行細(xì)胞生長形式的馴化。在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞死亡是維持細(xì)胞高活性和高密度的最大障礙，由于在懸浮培養(yǎng)工藝中，細(xì)胞的死亡主要是因凋亡所致。通過導(dǎo)入凋亡抑制基因(Bcl-2)來調(diào)節(jié)細(xì)胞抗凋亡的機制，延長細(xì)胞生存時間，促細(xì)胞活力和增加抗體的產(chǎn)量。懸浮培養(yǎng)工藝中影響細(xì)胞生產(chǎn)數(shù)量和質(zhì)量的因素，主要應(yīng)考慮細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境( 營養(yǎng)條件、產(chǎn)物積累、pH、溫度和滲透壓) ，終產(chǎn)物( 乳酸和氨) 毒性累積和必需營養(yǎng)物的添加等。設(shè)計適應(yīng)細(xì)胞生長的無血清培養(yǎng)基，控制營養(yǎng)物的添加，減少產(chǎn)物消耗積累是解決問題的有效手段3。1.2 貼壁細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器技術(shù)已達(dá)到相當(dāng)規(guī)模和技術(shù)水平。而要更好地符合生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要，仍存在諸多不足有待改進(jìn)和完善。如何開發(fā)剪切力低、混合效率高的液體設(shè)備系統(tǒng)在動物細(xì)胞高密度培養(yǎng)中顯得尤為重要，也是制造大規(guī)模反應(yīng)器系統(tǒng)的難題之一4。目前報道的貼壁細(xì)胞生產(chǎn)工藝，最佳的生物反應(yīng)器形式是攪拌式微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，最大放大到10000L， 并可提供最有效的優(yōu)化工藝和最適宜的流加工藝設(shè)計。最佳的工藝設(shè)計是高密度連續(xù)灌流培養(yǎng)，最近在30L生物反應(yīng)器高密度微載體連續(xù)灌流培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)人狂犬疫苗，微載體數(shù)量達(dá)到25gPL，細(xì)胞密度可以達(dá)到12109Pml，這項技術(shù)的進(jìn)步主要是生物反應(yīng)器提供一個獨特的細(xì)胞沉降系統(tǒng)， 高氧氣傳輸系統(tǒng)，和高營養(yǎng)環(huán)境及強的pH緩沖體系5。流加培養(yǎng)和灌流培養(yǎng)是動物細(xì)胞培養(yǎng)工藝中最常用的兩種操作方式。另外可供選擇的方式還有批式-反復(fù)流加( batchrefeeding)。雖然許多較老的病毒生產(chǎn)工藝采用批式操作( batch) ，新的病毒疫苗生產(chǎn)已采用改良的生產(chǎn)形式如批式-反復(fù)流加或灌流培養(yǎng)工藝。流加培養(yǎng)工藝的基礎(chǔ)是用攪拌生物反應(yīng)器，營養(yǎng)物的添加主要考慮減少代謝廢物的積累和營養(yǎng)的均衡，維持一個高細(xì)胞密度和高產(chǎn)物濃度。灌流懸浮培養(yǎng)在生物反應(yīng)器的設(shè)計上必須考慮細(xì)胞截流。流加懸浮培養(yǎng)與灌流懸浮培養(yǎng)在操作形式上并無明顯不同，兩種操作形式的選擇完全取決于每個產(chǎn)品潛在的細(xì)胞生長活力與相關(guān)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，以及產(chǎn)品的最高產(chǎn)量需求和質(zhì)量要求。2. 提高藥用蛋白質(zhì)產(chǎn)量的方法2.1 構(gòu)建高效的表達(dá)載體系統(tǒng)構(gòu)建高效的表達(dá)載體系統(tǒng)是提高哺乳動物細(xì)胞醫(yī)用蛋白質(zhì)產(chǎn)量的首要策略，也是目前制約醫(yī)用蛋白質(zhì)產(chǎn)業(yè)化的瓶頸。外源基因可以通過質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染或病毒載體感染的方式導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞，表達(dá)目的蛋白。傳統(tǒng)質(zhì)粒載體需要轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)，耗時費力，不利于醫(yī)用蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)。目前，病毒載體主要以桿狀病毒載體和慢病毒載體最為常用。桿狀病毒載體可以通過昆蟲細(xì)胞大量制備病毒顆粒，感染多種哺乳動物細(xì)胞，并在合適的啟動子控制下表達(dá)外源基因，加上桿狀病毒載體具備基因組大、操作性好、靶向性強、生物安全性高等優(yōu)點，已成為一項比較成熟、安全、經(jīng)濟、高效的蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)，被越來越多地應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)多肽藥物和疫苗等醫(yī)用蛋白質(zhì)的研制。一般來說，人工構(gòu)建的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體為穿梭載體，含有便于載體擴增和大量制備的原核序列，如復(fù)制子和抗生素抗性基因等，以及調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄與翻譯活性的啟動子、增強子、終止子和polyA 信號序列等真核生物表達(dá)序列。優(yōu)化調(diào)節(jié)啟動子、增強子及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有助于高效表達(dá)外源基因6。 2.2 篩選高效穩(wěn)定表達(dá)克隆篩選高效穩(wěn)定表達(dá)克隆是提高哺乳動物細(xì)胞醫(yī)用蛋白質(zhì)產(chǎn)量的另一重要策略。當(dāng)前常用的篩選高效穩(wěn)定表達(dá)克隆的體系主要有兩類：一類是基于氨甲喋呤(methotrexate， MTX) 的二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase， DHFR) 篩選體系7 ；另一類是基于甲硫氨酸亞砜(methionine-S-sulfoxide， MSX)的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS) 篩選體系。DHFR 篩選體系是用MTX 處理細(xì)胞培養(yǎng)物讓DHFR 周圍基因擴增，進(jìn)而篩選高產(chǎn)量的克隆，在50 nmol/L1 mol/L MTX 濃度下，目的基因的基因拷貝數(shù)可以提升102 105倍8。GS篩選體系利用含有GS 基因的載體轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，只有多拷貝GS基因的細(xì)胞才能在正常MSX 濃度生長，進(jìn)而篩選出高表達(dá)細(xì)胞株。此外，GS篩選體系可以減少細(xì)胞氨的產(chǎn)生。這些都為提高醫(yī)用蛋白質(zhì)產(chǎn)量的研究奠定了基礎(chǔ)。2.3 優(yōu)化轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平及翻譯后修飾水平從根本上了解目的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后修飾水平的分子機制是未來開發(fā)新型醫(yī)用蛋白質(zhì)和提高醫(yī)用蛋白質(zhì)產(chǎn)量的關(guān)鍵。目前常用的方法有以下幾種。第一，在載體上添加某些特定序列，使表達(dá)載體整合到宿主細(xì)胞染色體后模擬高轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，高效表達(dá)目的基因。第二，將含有定點重組位點的選擇標(biāo)記基因整合到染色體高表達(dá)區(qū)域，然后將目的基因載體與重組酶載體共轉(zhuǎn)染到帶有重組位點的細(xì)胞系，在重組酶介導(dǎo)下表達(dá)載體整合入高轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域。蛋白的折疊與組裝是產(chǎn)生具有功能蛋白質(zhì)的重要階段。然而，相關(guān)功能調(diào)節(jié)蛋白是否參與該過程在很大程度上仍是未知，目前只有很少部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶被人們所熟知，如分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose regulated protein 78， GRP78/Bip)、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶等。因此，通過蛋白質(zhì)基因的共表達(dá)作用來提高重組抗體產(chǎn)量仍然是一個棘手的問題。糖基化是蛋白翻譯后修飾水平的核心環(huán)節(jié)。眾所周知，哺乳動物細(xì)胞具有與人類相似的聚糖修飾位點。但是，表達(dá)的糖基化結(jié)構(gòu)與天然結(jié)構(gòu)相比還存在著差異，特別是位于末端的唾液酸往往缺失或錯配，一定程度上影響了目的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品的生物活性。因此，糖基化工程已成為增加哺乳動物細(xì)胞重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量和活性研究的熱點9。2.4 優(yōu)化瞬時表達(dá)系統(tǒng)瞬時表達(dá)系統(tǒng)由于具有相對于穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)周期短、利于大規(guī)模生產(chǎn)、適于醫(yī)用蛋白質(zhì)的評估以及密碼子的優(yōu)化等優(yōu)點，現(xiàn)已成為哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)研究的重要技術(shù)之一，如利用HEK-293 細(xì)胞、BHK 細(xì)胞、CHO 細(xì)胞等瞬時表達(dá)重組蛋白質(zhì)。然而，目前瞬時表達(dá)系統(tǒng)的單位產(chǎn)量和體積產(chǎn)量仍然無法與穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)相媲美，因此，優(yōu)化瞬時表達(dá)系統(tǒng)，提高重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量仍是研究的重點。雖然目前還沒有瞬時表達(dá)醫(yī)用蛋白質(zhì)的報道，但是隨著大規(guī)模瞬時表達(dá)技術(shù)的不斷優(yōu)化，以及產(chǎn)量的不斷提高，該技術(shù)必將廣泛應(yīng)用于醫(yī)用蛋白質(zhì)的規(guī)模化生產(chǎn)。2.5 優(yōu)化培養(yǎng)工藝貼壁細(xì)胞培養(yǎng)是早期哺乳動物細(xì)胞的主要培養(yǎng)方式，但是存在細(xì)胞成活率低、不便于大規(guī)模生產(chǎn)等缺點。因此，為了提高重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量、降低成本，目前絕大多數(shù)在生物反應(yīng)器中進(jìn)行的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)都是采用懸浮式培養(yǎng)。然而，讓貼壁細(xì)胞適應(yīng)懸浮培養(yǎng)需要特殊的培養(yǎng)基，如今已開發(fā)出多種適于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基，尤其是無血清培養(yǎng)基。血清培養(yǎng)基具有成分不明確、價格昂貴、存在潛在未知因子污染等缺點，使培養(yǎng)過程難以控制，不利于后續(xù)醫(yī)用蛋白質(zhì)的純化。近年來，越來越多新型高通量生物反應(yīng)器也開始應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)重組蛋白質(zhì)的研究。2011年，Zhou 等10 開發(fā)了一種新型家蠶生物反應(yīng)器，并且通過研究證實該反應(yīng)器更加適于重組蛋白質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)和臨床研究。由此看來，隨著新型培養(yǎng)基和生物反應(yīng)器的研發(fā)應(yīng)用，必將推動哺乳動物細(xì)胞醫(yī)用蛋白質(zhì)產(chǎn)業(yè)更快發(fā)展。2.6 抑制細(xì)胞凋亡當(dāng)前哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)主要被細(xì)胞凋亡所阻礙，因此，抑制細(xì)胞凋亡是必不可少的措施。目前，通過抑制哺乳動物細(xì)胞凋亡來提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量主要從兩個方面著手：一方面通過改進(jìn)培養(yǎng)工藝抑制哺乳動物細(xì)胞凋亡，主要包括優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件，開發(fā)新型無血清無蛋白培養(yǎng)基，發(fā)展新型高通量生物反應(yīng)器等；另一方面通過基因工程改造來抑制哺乳動物細(xì)胞凋亡，如表達(dá)抗凋亡基因、編碼連鎖凋亡抑制因子、過表達(dá)抗凋亡蛋白、抑制或敲除前凋亡基因等。引起細(xì)胞凋亡的具體機制尚未完全清楚，通過抑制細(xì)胞凋亡來提高醫(yī)用蛋白質(zhì)產(chǎn)量仍需進(jìn)一步研究。3. 展望隨著人類基因組計劃、蛋白質(zhì)組計劃的進(jìn)行，基因的克隆和功能蛋白的鑒定為治療藥物額生產(chǎn)提供了更多的選擇，必將促進(jìn)此產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展。不如動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用蛋白是個負(fù)責(zé)的系統(tǒng)工程，它需要眾多環(huán)節(jié)都力求簡化經(jīng)濟，并注意各個部分之間的相互作用，同時還包括制劑、包裝和凍干的改進(jìn)，從而達(dá)到整體的優(yōu)化才能面對眾多的機遇與挑戰(zhàn)。參考文獻(xiàn)1陳志南,楊向民. 基于抗體等重組蛋白表達(dá)產(chǎn)品的哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模發(fā)酵技術(shù)J.中國醫(yī)藥生物技術(shù),2009,4(5):325-328.2林福玉,陳昭烈,黃培堂等.哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用蛋白的關(guān)鍵環(huán)節(jié)J.生物技術(shù)通訊,2002,13(1):62-653陳文慶,王建超,劉華杰,等. 懸浮培養(yǎng)工藝與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的比較分析J.中國獸藥雜志,2010,44(10):37-414唐江偉,吳振強新型生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展J.中國生物工程雜志,2007,27(5):146-152.5米力,陳志南.動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白的工藝選擇J.中國生物工程雜志,2003,23(7):1-66Cacciatore JJ, Chasin LA, Leonard EF. Gene amplification and vector engineering to achieve rapid and high-level therapeutic protein production using the Dhfr-based CHO cell selection system. Biotechnol Ad, 2010, 28(6): 673-817 Ng SK. Generation of high-expressing cells by methotrexate amplification of destabilized dihydrofolate reductase selection marker. Methods Mol Biol, 2012, 801: 161-728 Cacciatore JJ, Chasin LA, Leonard EF. Gene amplification and vector engineering to achieve rapid and high-level therapeutic protein produc