HPLC分析中的拖尾原因.doc

一、什么原因?qū)е路聪?HPLC 的峰拖尾，應(yīng)采取什么措施？由于被分析物與色譜柱間的相互作用導(dǎo)致峰拖尾。這種相互作用是在做反相分析中所發(fā)生的分配行為以外的作用。峰拖尾一般發(fā)生在堿性化合物上，通常是由于殘留的硅羥基和帶正電荷的堿性化合物之間的相互作用引起的。這種相互作用一般是發(fā)生在帶正電荷的堿性化合物與帶負(fù)電荷的色譜柱表面硅羥基之間的離子交換。當(dāng)流動(dòng)相的 pH 值大于 4.5-5.0 時(shí)， 色譜柱表面的硅羥基會(huì)帶負(fù)電荷。因此，(1)消除峰拖尾的最有效方式是使用 pH 值小于 4 的緩沖流動(dòng)相。由于硅羥基的活性和離子化會(huì)降低，因此(2)選擇更換新的高純羥基化硅膠色譜柱也會(huì)減少峰拖尾。 ZORBAX 色譜柱中使用這類硅膠的有：StableBond 色譜柱、Eclipse XDB 色譜柱、Bonus-RP 和 Extend-C18 色譜柱。這些色譜柱均可以減少峰拖尾，但是它們又有所不同。StableBond (SB) 色譜柱在低 pH 值時(shí)比較理想，因此在使用較低 pH 值的流動(dòng)相時(shí)通常是首選色譜柱。在 pH 值為 5-9 時(shí)Eclipse XDB 色譜柱是減少峰拖尾的首選色譜柱。這類色譜柱有雙重封端，因此它可以通過覆蓋色譜柱表面上盡可能多的殘留硅羥基以消除可能的硅羥基副作用，從而減少峰拖尾。對于這個(gè)中間 pH 值區(qū)，Bonus-RP 色譜柱也是一個(gè)減少峰拖尾的不錯(cuò)選擇。Bonus-RP 色譜柱有一個(gè)植入極性物質(zhì)的鍵合相。這些極性物質(zhì)可減少堿性化合物和殘留硅羥基之間的相互作用，因此改善堿性化合物的峰形。這類色譜柱可以在 pH 值為 2-8 的條件下使用。Extend-C18 用于高 pH 值，最高可用于 pH 值為 11.5 的條件下。在較高 pH 值下，很多堿性化合物已經(jīng)不帶電荷，因此和硅羥基的相互作用減小，峰拖尾也減少。 (3)認(rèn)真選擇流動(dòng)相也可以減少峰拖尾。緩沖流動(dòng)相 (2550 mM) 可減少峰拖尾，同時(shí)首選低 pH 值 (pH 23) 流動(dòng)相。這還會(huì)產(chǎn)生更多的可再生色譜。如果需要的話，可以添加一些流動(dòng)相添加劑如三乙胺 (TEA) 以減少堿性化合物的峰拖尾。TEA 相當(dāng)于競爭物，占據(jù)硅羥基的位置，用于消除分析物與殘留硅羥基間的相互作用。但在低 pH 值時(shí)很少需要這類添加劑，僅在中間 pH 值時(shí)才偶爾需要。 如果遇到酸性化合物的峰拖尾，處理過程相同。降低流動(dòng)相的 pH 值以盡量使酸質(zhì)子化，然后使用緩沖流動(dòng)相并盡量增強(qiáng)流動(dòng)相的離子強(qiáng)度。最后，可以通過向流動(dòng)相中加入競爭的有機(jī)酸，我們已經(jīng)使用 0.1% 三氟乙酸 (TFA) 得到了比較好的結(jié)果，并且這種添加劑具有比較低的紫外截止值。按照這些建議應(yīng)該可以減少酸性和堿性物質(zhì)的峰拖尾。 現(xiàn)在大多數(shù)色譜柱使用球形粒子，因?yàn)檫@種使用球形粒子填充的色譜柱具有更高的效率。因此，從選擇一個(gè)球形粒子色譜柱開始。分析分離最常用的粒子大小為 5um，這是因?yàn)檫@種粒子比較容易使用，但現(xiàn)在更佳的選擇為 3.5um 的粒子。這些更小的粒子在更短的柱長度內(nèi)可產(chǎn)生更高的效率，可以在更短的分析時(shí)間內(nèi)進(jìn)行分離。如果分析時(shí)間對于您很重要，則可以考慮選擇 ZORBAX 快速分析 (3.5um) 色譜柱以縮短分析時(shí)間。這個(gè) 4.6 x 150mm，3.5um 的快速分析色譜柱與 4.6 x 250mm， 5um 的色譜柱具有相同的效果，但分析時(shí)間卻縮短 40%。如果想進(jìn)一步縮短分析時(shí)間，則還可以選擇其它時(shí)間更短的快速分析色譜柱（75mm、50mm、30mm 和 15mm）。 對色譜柱孔尺寸的選擇取決于分析物的分子量?？壮叽缧∮?100 的色譜柱可以用于分析分子量小于 4000 的小分子。更大的分子，例如蛋白質(zhì)和縮氨酸，應(yīng)選擇孔尺寸為 300 的色譜柱進(jìn)行分析。另外，一些具有大的多環(huán)剛性結(jié)構(gòu)的小分子最好采用孔尺寸為 300 的色譜柱。選擇合適的孔尺寸非常重要，這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)鍵合相停留在粒子孔內(nèi)，因此僅當(dāng)分子能夠容易迅速地進(jìn)出孔時(shí)，才能獲得最佳的停留時(shí)間和峰寬。 二、拖尾原因及解決辦法中國色譜網(wǎng)(2008-4-1 9:22:18)文章作者：未知色譜峰拖尾的原因有很多，例如：1色譜柱本身填裝問題,篩板堵塞或填料塌陷；柱壞；2柱頭有污染；3樣品超載；4樣品溶劑不合適；5柱外效應(yīng)；6化學(xué)或二次保留（硅羥基）效應(yīng)；7 緩沖容量不足或不合適； 8 重金屬污染。解決方法如下： 一、與化學(xué)有關(guān)的拖尾問題 ?1流動(dòng)相中，加入30mM的三乙胺（用于堿性化合物）或醋酸胺（用于酸性化合物）， 未知化合物加醋酸三乙胺； 2如仍然拖尾，將三乙胺換為二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；3.降低進(jìn)樣量至1g。 二、 與色譜柱有關(guān)的拖尾問題 1.如柱頭處有強(qiáng)保留的樣品組分積聚，反相柱可用20倍柱體積的96%的二氯甲烷與4%甲醇，加1%氫氧化銨混合液沖洗；正向柱可用甲醇沖洗；2.使用保護(hù)柱。 三、 與HPLC系統(tǒng)有關(guān)的峰拖尾和峰加寬1.進(jìn)樣體積過大，（通