雷公藤甲素通過caspase依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)白血病細胞.docx

標(biāo)題：雷公藤甲素誘導(dǎo)的caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)依賴的細胞死亡通過介導(dǎo)在白血病細胞線粒體途徑引言：雷公藤甲素誘導(dǎo)的caspase依賴的細胞凋亡通過線粒體介導(dǎo)的通路在白血病細胞雷公藤甲素，從分離出一種二萜中國herbTripterygium wilfordiiHook.f，表現(xiàn)出抗腫瘤活廣泛一系列實體瘤。在這里，我們研究它的對白血病細胞和效果發(fā)現(xiàn)，在100納米或更小，它有效誘導(dǎo)凋亡的各種白血病細胞系和原發(fā)性急性髓性白血?。ˋML）的原始細胞。然后，我們試圖找出其作用機制。伴隨著雷公藤甲素誘導(dǎo)caspasedependent細胞死亡顯著降低XIAP水平。ForcedXIAP表達減弱triptolideinduced細胞死亡。雷公藤甲素也減少Mcl-1的，但不BCL-2和Bcl-XLlevels。 Bcl-2的過度抑制triptolideinduced凋亡。線粒體膜此外，雷公藤甲素引起的損耗潛力和細胞色素C釋放。caspase-9的基因敲除細胞耐藥，同時的caspase-8缺失細胞對雷公藤甲素敏感，暗示的關(guān)鍵性線粒體但沒有死亡受體途徑雷公藤甲素誘導(dǎo)的細胞凋亡。 雷公藤甲素也增強了細胞死亡誘導(dǎo)其他抗癌劑?？偟膩碚f，我們的 結(jié)果表明，雷公藤減小 XIAP和強效誘導(dǎo)caspasedependent凋亡通過線粒體途徑介導(dǎo)在白血病細胞 低納摩爾濃度。強效雷公藤甲素的體外抗白血病活性值得進一步研究這種化合物對白血病的治療和其他惡性腫瘤。介紹：雷公藤Hook.f中，衛(wèi)矛科的一員植物家族，已用于中國藥世紀(jì)。雷公藤內(nèi)酯醇，二萜類化合物，首次從植物和結(jié)構(gòu)上的特點在1972年并已被用于治療各種自身免疫疾病的并作為患者的器官和組織移植的免疫抑制劑。近日，雷公藤甲素所表現(xiàn)出具有抗腫瘤特性范圍廣泛的抑制生長和誘導(dǎo)細胞凋亡人腫瘤細胞。雷公藤也顯示敏感細胞死亡誘導(dǎo)的各種試劑，如Apo2/Trail ，TNF- ，和不同的化療藥物。然而，盡管雷公藤甲素的公認有效的抗腫瘤活性，我們的知識就其作用機制仍是有限的。到目前為止，這是已知的只有雷公藤塊TNF-介導(dǎo)的誘導(dǎo)的c- IAP1的和c - IAP2和NF的激活？ B，并且誘導(dǎo)caspase激活。急性髓性白血?。ˋML）是一個積極的血液惡性腫瘤。盡管在過去的30年大力度，限制已經(jīng)取得了進展在治療AML的。當(dāng)前反洗錢的主要治療方法是化療，誘導(dǎo)細胞死亡主要是通過凋亡不論是由固有的線粒體或外源性死亡受體途徑，這兩者導(dǎo)致介caspase激活和細胞解體。的發(fā)展創(chuàng)新療法和鑒定更有效的藥物，因此，仍然是白血病研究的高度優(yōu)先事項。由于其抗腫瘤特性，雷公藤有希望作為一個治療白血病。然而，較雷公藤誘導(dǎo)的細胞凋亡中的U937細胞通過激活胱天蛋白酶-3和下調(diào)XIAP最近的報告等，而且它下調(diào)的Bcr- Abl的表達并誘導(dǎo)K562細胞凋亡，幾乎沒有工作一直做了闡明雷公藤內(nèi)酯醇的活性和機制白血病。通過分子機制的理解調(diào)解雷公藤甲素的促凋亡活性，這將是可以更好地了解其抗白血病效應(yīng)，并確定它是否是用于臨床使用的候選者。另外，了解雷公藤甲素的分子靶點及機制行動將使我們能夠設(shè)計出合理的聯(lián)合藥物治療，更有效地消滅白血病細胞。中所描述的研究在這里，我們研究各種白血病細胞雷公藤甲素的影響系和原發(fā)性AML母細胞，并表明雷公藤內(nèi)酯醇在低納摩爾濃度有效誘導(dǎo)凋亡的各種白血病細胞系和原發(fā)性AML爆炸。我們還調(diào)查在白血病細胞雷公藤甲素誘導(dǎo)的細胞凋亡的機制。值得注意的是，這種藥物的水溶性衍生物是在臨床試驗中在歐洲。細胞處理方法：對數(shù)生長期的細胞（0.2106/ml的）或單核細胞fromAML和正常骨髓樣本（1106/ml的）與治療不同濃度的雷公藤甲素（AlexisBiochemicals，圣迭戈，加利福尼亞州）24和48小時。 DMSO適量的用作控制。要阻止caspase活化或蛋白酶體降解，細胞預(yù)處理20 M + IDN-1965，一般的半胱天冬inhibitor22（由IDUN制藥，加利福尼亞州圣迭戈kindlyprovided），或之前0.2 M + MG132，aproteasome抑制劑（Calbiochem公司，圣迭戈，加利福尼亞州），1小時雷公藤加入。對于聯(lián)合治療的研究，成倍增長從AML樣本（1106/ml的細胞）（0.2106/ml的）或單核細胞與雷公藤甲素的濃度增加和治療的所選化合物在恒定的比率為48小時。細胞死亡分析通過膜聯(lián)蛋白V染色，如在“細胞生存力測定法”中描述細胞活力測定法：細胞活力臺盼藍染色法用XR確定細胞計數(shù)器（Beckman Coulter公司，富勒頓，加利福尼亞州）。細胞凋亡估計通過caspase-3的激活都Western blot分析和流式細胞儀磷脂酰serine23測量用膜聯(lián)蛋白-V-FLUOS染色試劑盒（Roche Diagnostics公司，印第安納波利斯，IN）。膜的完整性同時被碘化丙啶評估（PI）排除在膜聯(lián)蛋白V染色的細胞。為了測量變化線粒體膜電位（MMP），細胞加載CMXRos（300 nm）的和MITOTRACKER綠色（100M）（均自Molecular Probes，俄勒岡州尤金）1小時，在37C?；|(zhì)金屬蛋白酶的虧損然后通過評估同時測量CMXRos保留（紅色熒光）調(diào)整線粒體質(zhì)量（綠色熒光）。細胞周期分布固定細胞，用70冰冷的乙醇和用PI染色溶液（25微克/毫升的PI ， 180 U / ml的RNA酶， 0.1 的Triton X -100，和30毫克/毫升西格瑪化學(xué)），在4 mM檸檬酸鹽緩沖液，pH 7.8聚乙二醇。該DNA含量，使用FACScan流式細胞儀（Becton確定迪金森，圣何塞，加利福尼亞州） 。使用細胞周期分布進行分析MODFIT LT軟件（ Verity的軟件大廈，托普瑟姆， ME） 。Western blot分析Western印跡分析，以確定各種蛋白質(zhì)的水平做如前面所述。24簡言之，將經(jīng)處理的細胞用PBS洗滌并裂解在蛋白質(zhì)裂解緩沖液（0.25M Tris-鹽酸， 2SDS， 4 -巰基乙醇，10甘油和0.02 溴酚藍） 。細胞的等量溶胞產(chǎn)物上樣到12 SDS-PAGE凝膠儀（Bio Rad ，赫拉克勒斯，CA）。至測量從線粒體釋放到胞質(zhì)溶膠中的細胞色素C，細胞用冰冷的裂解緩沖液（25mM Tris-HCl和5mM的氯化鎂 pH值7.4 ） 。收集上清液，通過離心，通過分析Western blot檢測，并探討與抗細胞色素C（ PharMingen公司，圣迭戈，加利福尼亞州）的抗體。與第二抗體溫育后，將膜反應(yīng)與ECL溶液（ Pharmacia公司，白金漢郡，英國） 。由一個被檢測到的信號磷屏（風(fēng)暴860 4.0版，分子動力學(xué)，桑尼維爾，CA）。 ？ -肌動蛋白被列為負荷控制。熒光定量逆轉(zhuǎn)錄 - 聚合酶鏈反應(yīng)（ RT-PCR）RNA從雷公藤治療OCI- AML3細胞的Trizol分離解決方案（生命科技，大島， NY ） 。 RNA的reversetranscribed禽流成髓細胞瘤病毒（ AMV ）逆轉(zhuǎn)錄酶（ Roche Diagnostics公司），在42下進行1小時。 PCR擴增反應(yīng)混合物（ 25 L ）中含有的cDNA ， XIAP蛋白的正向引物（ 5- CCCAAATTGCAGATTTATCAACG - 3）， XIAP的反向引物（ 5- TGCATGTGTCTCAGATGGCC - 3）， XIAP的探針（ 5- ATCTGGGAAGCAGAGATCATTTTGCCTTAGAC - 3），和TaqMan通用PCR擴增預(yù)混試劑（ PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，福斯特城，加利福尼亞州） 。 2-微球蛋白（2 -m）的共擴增與XIAP被列入作為變量的標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部控制cDNA的每一個樣品中含量（正向引物，5 - AGCTGTGCTCGCGCTACTCT -3; ？反向引物，5 - TTGACTTTCCATTCTCTGCTGG -3; ？和探針，5 - TCTTTCTGGCCTGGAGGGCATCC -3 ？ ） 。熱循環(huán)條件包括保持反應(yīng)在50進行2分鐘并在95 下進行10分鐘，并循環(huán)為在95 下進行40個循環(huán)為15秒和60 1分鐘。結(jié)果被收集，并用分析ABI PRISM 7700序列檢測系統(tǒng)（PE Applied Biosystems）進行如如下：生成第1熒光信號的PCR循環(huán)數(shù)高于閾值（閾值循環(huán)，CT，上面的10個標(biāo)準(zhǔn)偏差意味著在基準(zhǔn)周期產(chǎn)生的熒光）確定，和一個比較CT法，然后用于測量相對基因表達。下面的公式用于計算相對量的處理的樣品（倍）權(quán)益的成績單和控制樣本（Y），這兩個歸一化的內(nèi)源參照（2 - 米）： 2- 用CT，其中CTIS的興趣和？ 2米的基因CTbetween的差異，和CTfor樣本XCT （x ） ？ CT （ Y） 。25集落形成實驗的集落形成測定如先前所述進行。26簡言之，將1105從AML患者的骨髓單核細胞鍍在Iscoves 0.8 甲基纖維素改性Dulbecco培養(yǎng)基補充有10FCS和15 ng / mL的重組人粒細胞集落刺激因子（抗hGM -CSF） 。雷公藤內(nèi)酯醇加入在培養(yǎng)物在10 100nM的濃度開始。反洗錢爆炸文化在重復(fù)7天，在顯微鏡下菌落評價菜肴。從正常骨髓細胞接種在Iscoves 0.8 甲基纖維素改性Dulbecco培養(yǎng)基， 1個單位/ mL人促紅細胞生成素（安進公司，千橡，加利福尼亞州）和50 ng / mL的重組HGM- CSF 。雷公藤混合物在10 100nM的濃度添加。所有的文化都14天后，以確定菌落形成單位數(shù)分析：集落形成單位粒細胞 - 巨噬細胞（ CFU-GM ）和菌落爆裂形成單位 - 紅細胞（ BFU-E ）集落統(tǒng)計 所有的實驗都進行3次以上，結(jié)果是表示為平均值加上或減去標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE），除非另有說明。雷公藤甲素誘導(dǎo)膜聯(lián)蛋白V陽性的濃度細胞的50，使用Calcusyn軟件（BIOSOFT，弗