中藥材中鞣質(zhì)含量測(cè)定方法的研究與優(yōu)化

中藥材中鞣質(zhì)含量測(cè)定方法的研究與優(yōu)化摘要: 參照藥典,采用磷鉬鎢酸 - 干酪素比色法 ,以沒食子酸為對(duì)照測(cè)定五倍子、地榆藥材中鞣質(zhì)的含量。探討藥典中規(guī)定的條件合理性，并增加了超聲條件優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)，平均加樣回收率為 97.39 %。本法可快速、準(zhǔn)確地用于中藥材中鞣質(zhì)的含量測(cè)定,并可作為鞣質(zhì)提取工藝的優(yōu)化方案。關(guān)鍵詞: 鞣質(zhì)測(cè)定;波長(zhǎng)；室溫浸提；干酪素；沒食子酸；超聲鞣質(zhì)又稱單寧(Tannins) ,是一類復(fù)雜的具有沉淀蛋白質(zhì)性質(zhì)的水溶性多元酚類化合物 ,廣泛存在于植物藥材,如五倍子、貫眾、兒茶等。近年來,對(duì)鞣質(zhì)生理活性的研究方興未艾。研究表明,鞣質(zhì)能清 除生物體內(nèi)過剩的自由基,維護(hù)細(xì)胞膜的流動(dòng)和蛋白質(zhì)的構(gòu)象 ,防止輻射誘發(fā)的 DNA斷裂 ,從而在抑制脂質(zhì)過氧化、心血管病、抗癌、抗突變、抗衰老、抗白內(nèi)障等方面有獨(dú)特功效。鞣質(zhì)的經(jīng)典含量測(cè)定方法有很多種 ,如重量法、容量法、比色法等。最常用的有皮粉法、高錳酸鉀法、干酪素法、絡(luò)合量法。皮粉法是國(guó)際公認(rèn)的鞣質(zhì)含量測(cè)定方法。皮粉的主要成分是蛋白質(zhì) ,鞣質(zhì)可通過分子中的酚羥基與蛋白質(zhì)的酰胺基形成氫鍵而結(jié)合成不溶于水的沉淀,以重量法測(cè)定含量。 中國(guó)藥典一部1鞣質(zhì)含量測(cè)定法一直沿用皮粉法 ,適用范圍廣。缺點(diǎn)是耗用樣品多,測(cè)定時(shí)間長(zhǎng) ,且沒有選擇性,測(cè)定結(jié)果偏高 ,而且皮粉用量很大。近年來,皮粉試劑的供應(yīng)和質(zhì)量都很難保證,使皮粉法的應(yīng)用受到很大限制。英國(guó)藥典2002 版2鞣質(zhì)測(cè)定法附錄采用的是磷鉬鎢酸 - 皮粉比色法,即利用鞣質(zhì)在堿性溶液中將磷鉬鎢酸還原產(chǎn)生深藍(lán)色,其吸收度與含量成正比,采用比色法測(cè)定。其中,以焦性沒食子酸為對(duì)照,測(cè)定總酚和不被皮粉吸附的酚,二者之差計(jì)為鞣質(zhì)的含量。 羅文毓等報(bào)道了改進(jìn)的干酪素法3 ,其關(guān)鍵步驟是以干酪素代替皮粉,采用磷鉬鎢酸比色法測(cè)定; 藥材樣品提取采用浸泡過夜代替加熱回流提取等。本文參照英國(guó)藥典和干酪素法,重點(diǎn)對(duì)提取方法、顯色劑、干酪素用量等進(jìn)行了比較,提出了鞣質(zhì)含量測(cè)定方法,為藥典相關(guān)附錄方法的修訂提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。中國(guó)藥典42015年版2202鞣質(zhì)含量測(cè)定法已為沒食子酸為對(duì)照，測(cè)定測(cè)定總酚和不被干酪素吸附的酚,二者之差計(jì)為鞣質(zhì)的含量。并且同時(shí)進(jìn)行干酪素吸附空白試驗(yàn)，計(jì)算時(shí)扣除空白值。實(shí)驗(yàn)為避光操作。4 本研究對(duì)中藥主要的化學(xué)活性成分鞣質(zhì)提取工藝的優(yōu)化，有利于地榆資源進(jìn)一步的開發(fā)、利用，并為中藥材有效成分的富集提供理論依據(jù)。并改進(jìn)鞣質(zhì)含量測(cè)定方法。1 儀器與試劑18系列紫外可見分光光度計(jì)【2007（C）北京普析通用儀器有限責(zé)任公司】; KQ-250B型超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）。鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、無水碳酸鈉;磷酸、鹽酸、干酪素、鞣酸（分析純）; 焦性沒食子酸、沒食子酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，經(jīng)色譜分析，純度98，) ;五倍子、地榆藥材(購(gòu)自中藥材市場(chǎng))。2 實(shí)驗(yàn)方法探究21 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇探究 取對(duì)照品、總酚和不被吸附的多酚比色液 ,在 4001000nm波長(zhǎng)測(cè)定 ,結(jié)果三種比色液均在 760nm 具最大吸收。繪制不同波長(zhǎng)總酚比色液吸收曲線和不被吸附的多酚比色液吸收曲線。 結(jié)果表明，確定測(cè)定鞣質(zhì)含量最大吸收波長(zhǎng)為 760nm。22 供試品溶液制備方法的比較探究5英國(guó)藥典2000 版鞣質(zhì)測(cè)定法藥材供試液提取方法采用加熱提取 ,羅文毓等報(bào)道,鞣質(zhì)遇熱不穩(wěn)定,采用室溫浸提過夜的方法操作簡(jiǎn)單,提取完全。本試驗(yàn)對(duì)加熱和冷浸提取兩種方法進(jìn)行了比較。分別測(cè)定次數(shù)5次。冷浸過夜提取測(cè)定含量高于加熱提取法,且操作較簡(jiǎn)單。結(jié)果表明,測(cè)定鞣質(zhì)含量供試品處理應(yīng)采用室溫浸提過夜的提取方法。23 吸附劑的比較探究5英國(guó)藥典法采用皮粉作為吸附劑測(cè)定不被吸附的多酚類。參考文獻(xiàn)3干酪素對(duì)鞣質(zhì)的吸附更具專屬性,即可選擇性吸附有生理活性鞣質(zhì),而鞣酐等非活性鞣質(zhì)則不被吸附,選擇性較皮粉法高。以鞣酸為例,試驗(yàn)分別采用皮粉和干酪素為吸附劑 , 測(cè)定含量。結(jié)果皮粉法測(cè)定值為 81118 % ,干酪素法測(cè)定值為 62126 %。結(jié)果表明,測(cè)定鞣質(zhì)含量吸附劑應(yīng)為干酪素。2 4 干酪素用量的比較探究試驗(yàn)考察了干酪素的用量對(duì)測(cè)定五倍子鞣質(zhì)含量結(jié)果的影響。干酪素用量的影響： 干酪素不同用量時(shí)測(cè)定含量3次取其平均值，測(cè)得干酪素用量和對(duì)應(yīng)測(cè)得的含平均值為下:0.15g-18.26%,0.30g-23.24%，0.45g- 32.72%, 0.60%g- 32.82% , 0.75g-32.62 % ,0.90g- 32.86% 結(jié)果表明 , 對(duì)于測(cè)定樣品 , 三倍取樣量的干酪素用量基本可吸附完全。試驗(yàn)使用干酪素 0.6 克。5結(jié)果表明,測(cè)定鞣質(zhì)含量干酪素用量為0.6g。2 5 對(duì)照品的比較探究5英國(guó)藥典2000 版鞣質(zhì)測(cè)定法附錄采用焦性沒食子酸為對(duì)照品,試驗(yàn)表明焦性沒食子酸很不穩(wěn)定,溶液在室溫放置很快變色 ,必須新鮮配置使用?？紤]到?jīng)]食子酸具有相似的結(jié)構(gòu)和顯色行為 ,且已有含量測(cè)定用對(duì)照品,可以作為鞣質(zhì)含量測(cè)定對(duì)照物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)比較了焦性沒食子酸和沒食子酸分別作為對(duì)照的測(cè)定情況。以鞣酸含量測(cè)定為例, 采用不同對(duì)照物比較測(cè)定結(jié)果: 以沒食子酸對(duì)照, 測(cè)得含量平均值為 62.26 % ,以焦性沒食子酸對(duì)照,測(cè)得含量平均值為45.45 %。以沒食子酸對(duì)照 , 含量值較高。結(jié)果表明,測(cè)定鞣質(zhì)含量時(shí)對(duì)照品應(yīng)采用沒食子酸。2. 6 超聲輔助的優(yōu)化比較探究62.6.1 單因素考察2.6.1.1超聲輔助提取的次數(shù)取干燥的地榆根粉末適量，加入15B/V 的60% C2H5OH，分別提取1、2、3、4、5 次，每次60 分鐘。提取物經(jīng)測(cè)定吸光度，計(jì)算含量結(jié)果提取次數(shù)對(duì)的總鞣質(zhì)的提取量有一定差異，但3、4、5 次差異不大，故而選定超聲次數(shù)1、2、3 次作為正交試驗(yàn)考察的因素水平，進(jìn)一步考察超聲輔助提取次數(shù)對(duì)提取的影響。2.6.1.2超聲輔助提取的時(shí)間取干燥的地榆根粉末適量，加入15B/V 的60% C2H5OH 溶液，并依此超聲提取20 分鐘、40 分鐘、60 分鐘、80 分鐘、100 分鐘。提取物經(jīng)測(cè)定吸光度，計(jì)算含量結(jié)果表明20 分鐘到60 分鐘提取量逐漸上升，故而選定45分鐘，60 分鐘，75 分鐘作為正交實(shí)驗(yàn)考察的因素水平，進(jìn)一步考察超聲輔助提取的時(shí)間對(duì)提取的影響。2.6.1.3溶劑濃度取干燥的地榆根粉末適量，分別加入15B/V的30% 、40% 、50% 、60% 、70% 、80% C2H5OH， 超聲提取60 分鐘。提取物經(jīng)測(cè)定吸光度， 計(jì)算含量結(jié)果表明70% 、60%C2H5OH 提取結(jié)果最好，故而選定50%、60%、70% C2H5OH 溶液作為正交實(shí)驗(yàn)考察的因素水平，進(jìn)一步考察溶劑濃度對(duì)提取的影響。2.6.1.4溶劑用量取干燥的地榆根粉末適量，分別加入5、10、15、20、25、30B/V 的60%C2H5OH，超聲提取60 分鐘。提取物經(jīng)測(cè)定吸光度，計(jì)算含量結(jié)果表明15B/V 的60% C2H5OH 提取結(jié)果最好，故而選擇10、15、20B/V 的溶劑用量，作為正交實(shí)驗(yàn)考察的因素水平，進(jìn)一步考察溶劑用量對(duì)提取的影響。2.6.3 L9 （34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)通過單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果考察，選擇超聲輔助提取次數(shù)A、超聲輔助提取時(shí)間B、溶劑濃度C、溶劑用量D 為考察的四組因素，采用L9 （34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，確定地榆中總鞣質(zhì)的最佳提取方法為A3C3B2D2，即為超聲波輔助提取3 次，每次60 分鐘，溶劑為15B/V 的70%C2H5OH。通過顯著性檢驗(yàn)及方法分析，得出各因素對(duì)地榆中總鞣質(zhì)提取效果影響的主次順序?yàn)锳CBD。依照正交試驗(yàn)的結(jié)果重復(fù)試驗(yàn)5 次，計(jì)算得RSD 為1.74%。結(jié)果表明，測(cè)定鞣質(zhì)含量時(shí)最佳提取方法為超聲波輔助提取3 次，每次60 分鐘，溶劑為15B/V的70%C2H5OH。2. 7 顯色劑的穩(wěn)定性探究加入顯色劑磷鉬鎢酸試液，分別于15min、30min、45min、60min、75min、90min后測(cè)定吸光度，發(fā)現(xiàn)磷鉬鎢酸顯色 30 分鐘后反應(yīng)完全, 顯色溶液在 3小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果表明，測(cè)定鞣質(zhì)含量時(shí)自加入磷鉬鎢酸顯色 30 分鐘后測(cè)定吸光度較好。 2. 8 堿性濃度的優(yōu)化探究 藥典規(guī)定，測(cè)定鞣質(zhì)含量時(shí)所使用的碳酸鈉堿性溶液的濃度為29%，溫度為碳酸鈉的溶解度影響較大，且高濃度的碳酸鈉較易析出結(jié)晶，影響測(cè)定結(jié)果，多采用低濃度碳酸鈉溶液，實(shí)驗(yàn)分別用20%，25%，29%，35%碳酸鈉測(cè)定結(jié)果，取沒食子酸對(duì)照品溶液（0.05mg/ml）2ml,進(jìn)行顯示測(cè)定，結(jié)果表明，四者吸光度基本一致。 結(jié)果表明，測(cè)定鞣質(zhì)含量時(shí)應(yīng)采用20%碳酸鈉。 2. 9 實(shí)驗(yàn)光照度的探究 強(qiáng)光照射會(huì)使顯色體系吸光度下降。 結(jié)果表明，測(cè)定鞣質(zhì)含量時(shí)需要使用棕色容量瓶并且避光操作。3方法學(xué)驗(yàn)證31 線性關(guān)系考察本法為標(biāo)準(zhǔn)曲線法 , 每次測(cè)定5個(gè)均隨行測(cè)定 , 做 3 次測(cè)定數(shù)據(jù) , 表示線性關(guān)系情況 。32 重復(fù)性試驗(yàn)取樣品 6 份 , 按正文方法測(cè)定, 測(cè)得含量結(jié)果，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果測(cè)定次數(shù)6次對(duì)應(yīng)含量( %)分別為： 1- 42.80 2 -41.75 3 -41.02 4 -42.49 5 -42.53 6- 42.74 3 3 回收率試驗(yàn) 取同一樣品 4 份,分別精密稱取約75mg ,置250ml 量瓶中,分別精密加入鞣酸溶液27.09mg (以沒食子酸計(jì)含量為 62126 %) 50ml ,加水100ml ,按供試品溶液制備方法制備,并按總酚和不被吸附的多酚測(cè)定法分別測(cè)定含量,計(jì)算回收率。回收率試驗(yàn)結(jié)果如下：測(cè)定次數(shù)樣品中含量(mg) 加入量(mg) 測(cè)得量(mg) 回收率( %)1 33.26 27.09 59.37 96.382 34.56 27.09 60.66 96.333 33.85 27.09 60.47 98.264 34.70 27.09 61.41 98.60平均值97.39% RSD值 1.24%4 樣品測(cè)定4.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取沒食子酸對(duì)照品50mg ,置100ml 棕色量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,精密量取5ml,置 50ml棕色量瓶中,用水稀釋至刻度，搖勻,作為對(duì)照品溶液。 42 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品溶液 1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml , 分別置25ml棕色量瓶中,各加入磷鉬鎢酸試液1ml,再分別加水 11ml、10ml、9ml、 8ml、7ml , 用 20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度,搖勻。以相應(yīng)的試劑為空白,照分光光度法,30分鐘后,在760nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度,以吸收度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 4. 3 供試品溶液制備取地榆藥材,粉碎,過三號(hào)篩,分別稱取0.15g和0.75g,精密稱定,置250ml棕色量瓶中,加水150ml,放置過夜,超聲波輔助提取3 次，每次60分鐘，溶劑為15B/V的70%C2H5OH,放冷,用水稀釋至刻度,搖勻,靜置 (使固體物沉淀),濾過,棄去 50ml初濾液,精密量取續(xù)濾液20ml,置100ml棕色量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。 4. 4 測(cè)定4.4.1總酚測(cè)定 精密量取供試品溶液 2ml,置 25ml 棕色量瓶中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法,自“加 入磷鉬鎢酸試液 1ml”起, 加水10ml,同法測(cè)定吸收值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量 (mg) ,計(jì)算,即得。4.4.2不被吸附的多酚測(cè)定取供試品溶液 25ml ,加至已盛有 0.6g 干酪素的100ml具塞錐形瓶中,密塞,置 30 水浴中保溫 1 小時(shí),時(shí)時(shí)振搖,取出,放冷, 搖勻,濾過,棄去初濾液,精密量取續(xù)濾液2ml,置 25ml 棕色量瓶中, 照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法,自“加入磷鉬鎢酸試液 1ml”起,加水 10ml,同法測(cè)定吸收值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量 (mg) ,計(jì)算,即得。4.4.3 干酪素吸附空白試驗(yàn)取供純化水25ml ,加至已盛有 0.6g 干酪素的100ml具塞錐形瓶中,密塞,置 30 水浴中保溫 1 小時(shí),時(shí)時(shí)振搖,取出,放冷, 搖勻,濾過,棄去初濾液,精密量取續(xù)濾液 2ml,置 25ml 棕色量瓶中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法,自“加入磷鉬鎢酸試液 1ml”起,加水 10ml,同法測(cè)定吸收值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出空白干酪素的量（mg）。鞣質(zhì)含量 = 總酚量 - （不被吸附的多酚量-空白干酪素的量）(減去水分含量，以干燥品計(jì)算)樣品測(cè)定結(jié)果 13.96% 13.72% 平均值13.848.0%（藥典規(guī)定） 以前的中國(guó)藥典鞣質(zhì)含量測(cè)定法一直沿用皮粉法 ,該法確為經(jīng)典方法 , 但專屬性不強(qiáng) , 皮粉用量大, 試驗(yàn)周期長(zhǎng) , 已不適用于日常分析測(cè)定。2015年版藥典修訂提出了的新方法 ,在專屬性和測(cè)定精密度等方面都有了明顯的提高,試驗(yàn)周期也大大縮短 (除樣品過夜提取外,一般僅需要 4 小時(shí)) 。本法對(duì)于2015年版藥典相關(guān)品種鞣質(zhì)