分光光度計(jì)的基本原理.doc

分光光度計(jì)的基本原理 姓名：陳凱 專業(yè)：生物科學(xué) 學(xué)號(hào)：2012040216 分光光度計(jì)的基本原理分光光度計(jì)主要用于反射和透射測(cè)量。分三種光源：S偏振光、P偏振光和自然光?，F(xiàn)有設(shè)備7臺(tái)（2臺(tái)日立U4100、1臺(tái)JACSO-V650、1臺(tái)JACSO-V570、2臺(tái)KT1100、1臺(tái)瞬間7700）主要由是由分光光度計(jì)和電腦組成，由電腦程序驅(qū)動(dòng)。一分光光度計(jì)的組成各種型號(hào)的可見分光光度計(jì)，就其基本結(jié)構(gòu)來說，都是由五個(gè)基本部分組成，即光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器及信號(hào)指示系統(tǒng)。1.光源在紫外可見分光光度計(jì)中，常用的光源有兩類：熱輻射光源和氣體放電光源。熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。2.單色器 單色器的主要組成：入射狹縫、出射狹縫、色散元件和準(zhǔn)直鏡等部分。單色器質(zhì)量的優(yōu)劣，主要決定于色散元件的質(zhì)量。色散元件常用棱鏡和光柵。3.吸收池 吸收池又稱比色皿或比色杯，按材料可分為玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外區(qū)。吸收池的種類很多，其光徑可在0.110cm之間，其中以1cm光徑吸收池最為常用。4.檢測(cè)器 檢測(cè)器的作用是檢測(cè)光信號(hào)，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)?，F(xiàn)今使用的分光光度計(jì)大多采用光電管或光電倍增管作為檢測(cè)器。5.信號(hào)指示系統(tǒng) 常用的信號(hào)顯示裝置有直讀檢流計(jì)，電位調(diào)節(jié)指零裝置，以及自動(dòng)記錄和數(shù)字顯示裝置等二.分光光度計(jì)光譜范圍包括波長(zhǎng)范圍為400760 nm的可見光區(qū)和波長(zhǎng)范圍為200400 nm的紫外光區(qū).不同的光源都有其特有的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源.鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400760nm波長(zhǎng)的光譜光通過三棱鏡折射后,可得到由紅橙,黃綠,藍(lán)靛,紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見光分光光度計(jì)的光源.氫燈（或氘燈）的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185400 nm波長(zhǎng)的光譜可作為紫外光光度計(jì)的光源.物質(zhì)的吸收光譜(1)如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液,此時(shí)在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜,它出現(xiàn)了幾條暗線,即光源發(fā)射光譜中某些波長(zhǎng)的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜.不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的.因此根據(jù)吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質(zhì).物質(zhì)的吸收光譜(2)當(dāng)光線通過某種物質(zhì)的溶液時(shí)透過的光的強(qiáng)度減弱.因?yàn)橛幸徊糠止庠谌芤旱谋砻娣瓷浠蚍稚?一部分光被組成此溶液的物質(zhì)所吸收只有一部分光可透過溶液.入射光= 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透過光如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為空白去校正反射,分散等因素造成的入射光的損失則:入射光 = 吸收光 十 透過光三.原理及測(cè)試方法分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光線透過測(cè)試的樣品后，部分光線被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。單色光輻射穿過被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長(zhǎng)度）成正比，其關(guān)系如下式：A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc式中 :A 為吸光度；基本原理I。為入射的單色光強(qiáng)度；I 為透射的單色光強(qiáng)度；T 為物質(zhì)的透射率；k 為摩爾吸收系數(shù)；L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長(zhǎng)c 為物質(zhì)的濃度物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收波長(zhǎng)，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測(cè)定其吸收度,即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對(duì)光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測(cè)定,故又稱比色分析。由于顯色時(shí)影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測(cè)定時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r(shí)操作。四.分光光度計(jì)的特點(diǎn)應(yīng)用廣泛：紫外可見分光光度計(jì)應(yīng)用范圍很廣。任何物質(zhì)只要在紫外可見波段中吸收光譜，均可用紫外可見分光光度計(jì)來進(jìn)行定性、定量分析；靈敏度高：由于新的顯色劑的大量合成，并在應(yīng)用研究方面取得了可喜的進(jìn)展，使得對(duì)元素測(cè)定的靈敏度有所推進(jìn)，特別是有關(guān)多元絡(luò)合物和各種表面活性 C C未A未A 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖maxA 4 劑的應(yīng)用研究，使許多元素的摩爾吸光系數(shù)由原來的幾萬提高到數(shù)十萬；選擇性好：目前已有些元素只要利用控制適當(dāng)?shù)娘@色條件就可直接進(jìn)行光度法測(cè)定，如鈷、鈾、鎳、銅、銀、鐵等元素的測(cè)定，已有比較滿意的方法；準(zhǔn)確度高：對(duì)于一般的分光光度法，其濃度測(cè)定的相對(duì)誤差在13%范圍內(nèi)，如采用示差分光光度法進(jìn)行測(cè)定，則誤差可減少到0.X%；適用濃度范圍廣可從常量（1%50%）到痕量（10-810-6%）；分析成本低、操作簡(jiǎn)便、快速由于分光光度法具有以上優(yōu)點(diǎn)，因此目前仍廣泛地應(yīng)用于化工、冶金、地質(zhì)、醫(yī)學(xué)、食品、制藥等部門及環(huán)境檢測(cè)系統(tǒng)。單在水質(zhì)分析中的應(yīng)用就很廣，目前能有直接法和間接法測(cè)定的金屬和非金屬元素就有70多種。五.分光光度計(jì)的操作及注意事項(xiàng)測(cè)試方法1.接通電源，打開儀器開關(guān)，掀開樣品室暗箱蓋，預(yù)熱10分鐘。2.將靈敏度開關(guān)調(diào)至“1”檔（若零點(diǎn)調(diào)節(jié)器調(diào)不到“0”時(shí)，需選用較高檔。）3.根據(jù)所需波長(zhǎng)轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)選擇鈕。4.將空白液及測(cè)定液分別倒入比色杯3/4處，用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室內(nèi)，使空白管對(duì)準(zhǔn)光路。5.在暗箱蓋開啟狀態(tài)下調(diào)節(jié)零點(diǎn)調(diào)節(jié)器，使讀數(shù)盤指針指向t=0處。6.蓋上暗箱蓋，調(diào)節(jié)“100”調(diào)節(jié)器，使空白管的t=100，指針穩(wěn)定后逐步拉出樣品滑竿，分別讀出測(cè)定管的光密度值，并記錄。7.比色完畢，關(guān)上電源，取出比色皿洗凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈。注意事項(xiàng)1該儀器應(yīng)放在干燥的房間內(nèi)，使用時(shí)放置在堅(jiān)固平穩(wěn)的工作臺(tái)上，室內(nèi)照明不宜太強(qiáng)。熱天時(shí)不能用電扇直接向儀器吹風(fēng)，防止燈泡燈絲發(fā)亮不穩(wěn)定。2使用本儀器前，使用者應(yīng)該首先了解本儀器的結(jié)構(gòu)和工作原理，以及各個(gè)操縱旋鈕之功能。在未按通電源之前，應(yīng)該對(duì)儀器的安全性能進(jìn)行檢查，電源接線應(yīng)牢固，通電也要良好，各個(gè)調(diào)節(jié)旋鈕的起始位置應(yīng)該正確，然后再按通電源開關(guān)。3在儀器尚未接通電源時(shí)，電表指針必須于“0”刻線上，若不是這種情況，則可以用電表上的校正螺絲進(jìn)行調(diào)節(jié)。六.應(yīng)用1.生物醫(yī)藥上的應(yīng)用可利用分光光度計(jì)進(jìn)行氨基酸含量的測(cè)定、測(cè)量未知蛋白溶液的濃度及含量、新生兒血清膽紅的測(cè)定以及蛋白質(zhì)與核酸的結(jié)構(gòu)分析等。2印染上的應(yīng)用可以測(cè)定紡織品上的甲醛含量、染料對(duì)織物的上染百分率、測(cè)定蛋白助劑在織物上的均勻程度、測(cè)定整理在織物上助劑的濃度、測(cè)吸附速率曲線、半吸附時(shí)6 間、吸附飽和值、平衡吸附量、測(cè)吸附量與K/S值的關(guān)系、吸附助劑量與其他性能的關(guān)系（如防氈縮）等。3.飼料工業(yè)中的應(yīng)用用飼料添加劑中的皮蠅磷、磺胺類藥物、灰黃霉素、二甲硝咪唑, 以及普魯卡因等的測(cè)定, 基本上也都可用紫外可見分光光度計(jì)來進(jìn)行檢測(cè)。4.農(nóng)藥及其殘留物分析施加的農(nóng)藥進(jìn)入土壤中, 一部分被農(nóng)作物吸收( 如六六六可被胡蘿卜、花生等吸收)、一部分進(jìn)入大氣、一部分流入水中。農(nóng)藥殘留包括農(nóng)藥原體、農(nóng)藥的有毒代謝物、農(nóng)藥的降解物和雜質(zhì)。人們往往只把農(nóng)藥原體看成農(nóng)藥殘留量, 忽略了農(nóng)藥原體的代謝物、降解物和雜質(zhì)。其實(shí), 代謝物、降解物的毒性與原藥一樣或更嚴(yán)重。例如, 滴滴涕的代謝物為滴滴依, 工業(yè)六六六的代謝物為乙體六六六, 農(nóng)藥1605 的代謝物為1601 , 這些代謝物的毒性都比原體更強(qiáng)。殺蟲脒的代謝物的毒性, 比原藥大10 倍。許多農(nóng)藥對(duì)人