實(shí)驗(yàn)四原子吸收分光光度法測定金屬元素含量.doc

蘭 州 理 工 大 學(xué)現(xiàn)代生物儀器分析實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書（四年制生物工程、食品科學(xué)與工程專業(yè)）王永剛 編寫生命科學(xué)與工程學(xué)院二零一二年十月 目 錄實(shí)驗(yàn)一、紫外吸收光譜法同時(shí)測定Vc和VE3實(shí)驗(yàn)二 氣相色譜法測定酒或酊中C2H5OH含量5實(shí)驗(yàn)三 高效液相色譜法測定維生素B1含量7實(shí)驗(yàn)四 原子吸收分光光度法測定金屬元素含量10實(shí)驗(yàn)一、紫外吸收光譜法同時(shí)測定Vc和VE一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握Cary 50紫外可見分光光度計(jì)的使用；2 學(xué)會(huì)用解聯(lián)立方程組的方法，定量測定吸收曲線相互重疊的二元混合物。二、方法原理 維生素C（抗壞血酸）和維生素E（ 生育酚）起抗氧劑作用，即它們?cè)谝欢〞r(shí)間內(nèi)能防止油酯變酪。兩者結(jié)合在一起比單獨(dú)使用的效果更佳，因?yàn)樗鼈冊(cè)诳寡鮿┬阅芊矫媸恰皡f(xié)同的”。因此，它們作為一種有用的組合試劑用于各種食品中。 抗壞血酸是水溶性的， 生育酚是酯溶性的，但它們都能溶于無水乙醇，因此，能用在同一溶液中測定雙組分的原理來測定它們。根據(jù)朗伯比爾定律，用紫外可見分光光度法很容易定量測定在此光譜區(qū)內(nèi)有吸收的單一成分。由兩種組分組成的混合物中，若彼此都不影響另一種物質(zhì)的光吸收性質(zhì)，可根據(jù)相互間光譜重疊的程度，采用相對(duì)應(yīng)的方法來進(jìn)行定量測定。如：當(dāng)兩組分吸收峰部分重疊時(shí)，選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL，仍可按測定單一組分的方法處理；當(dāng)兩組分吸收峰大部分重疊時(shí)，則宜采用解聯(lián)立方程組或雙波長法等方法進(jìn)行測定。解聯(lián)立方程組的方法是以朗伯比爾定律及吸光度的加合性為基礎(chǔ)，同時(shí)測定吸收光譜曲線相互重疊的二元組分的一種方法。從圖中可以看出，混合組分在1的吸收A組分和B組分分別在1的吸光度之和A1A+B，即A1A+B=1AbcA+1BbcB同理，混合組分在2的吸光度之和A2A+B應(yīng)為A2A+B=2AbcA+2BbcB若首先用A，B組分的標(biāo)樣，分別測得A，B兩組分在1和2處的摩爾吸收系數(shù)1A，2A和1B，2B，當(dāng)測得未知試樣在1和2的吸光度A1和A2后，解下列二元一次方程組：A1 =1AbcA+1BbcBA2 =2AbcA+2BbcB即可求得A，B兩組分各自的濃度cA和cB。一般來說，為了提高檢測的靈敏度，1和2宜分別選擇在A，B兩組分最大吸收峰處或其附近。三、儀器和試劑儀器： Cary 50紫外可見分光光度計(jì)：美國瓦里安中國有限公司； 石英比色皿2只；50mL容量瓶9只，；10mL吸量管2只。試劑：抗壞血酸：稱3mg抗壞血酸，溶于無水乙醇中，并用無水乙醇定容于100mL； 生育酚：稱8mg 生育酚溶于無水乙醇中，并用無水乙醇定容于100mL四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液 （1）分別取抗壞血酸貯備液1.00、1.50、2.00、2.50mL于4只10mL比色管中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。（2）分別取生育酚貯備液1.00、1.50、2.00、2.50mL于4只10mL比色管中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。2. 繪制吸收光譜以無水乙醇為參比，在320220nm范圍測繪出抗壞血酸和生育酚的吸收光譜，并確定和。3. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以無水乙醇為參比，在波長和，分別測定步驟1配制的8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。4. 未知液的測定取未知液5.00mL于50mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。在和分別測其吸光度。五、數(shù)據(jù)處理1. 繪制抗壞血酸和生育酚的吸收光譜，確定和。2. 分別繪制抗壞血酸和生育酚在和時(shí)的4條標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出4條直線的斜率，即、和。3. 計(jì)算未知液中抗壞血酸和生育酚的濃度。六、問題討論1 今有吸收光譜曲線相互重疊的三元體系混合物，能否用解聯(lián)立方程組的方法測定它們各自的含量？2設(shè)計(jì)一個(gè)用雙波長法測定本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)方案。七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求Vc、VE紫外掃描圖，四條標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 （要求編輯成WORD文檔打印，并作標(biāo)注）結(jié)果計(jì)算報(bào)告實(shí)驗(yàn)二 氣相色譜法測定酒或酊中C2H5OH含量一、目的要求1學(xué)習(xí)氣相色譜法測定含水樣品中的C2H5OH含量。2學(xué)習(xí)和熟悉氫火焰檢測器的調(diào)試及使用方法。3學(xué)習(xí)和掌握色譜內(nèi)標(biāo)定量方法。二、實(shí)驗(yàn)原理內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確而應(yīng)用廣泛的定量分析方法，操作條件和進(jìn)樣量不必嚴(yán)格控制，限制條件較少。當(dāng)樣品中組分不能全部流出色譜柱，某些組分在檢測器上無信號(hào)或只需測定樣品中的個(gè)別組分時(shí)，可采用內(nèi)標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)法就是將準(zhǔn)確稱量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，加入到準(zhǔn)確稱取的樣品中，根據(jù)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量m 。與樣品的質(zhì)量m 及相應(yīng)的峰面積A 求出待測組分的含量。待測組分質(zhì)量mi與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量ms 之比等于相應(yīng)的峰面積之比。式中：fi 、fs 為i 組分和內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)質(zhì)量校正因子；Ai 、As 為i 組分和內(nèi)標(biāo)物的峰面積。三、實(shí)驗(yàn)用品1儀器Varian CP3800毛細(xì)管氣相色譜儀 氫火焰檢測器（FID） 石英毛細(xì)管色譜柱（30m0.32mm，涂層厚0.25mm） 微量注射器 容量瓶（50mL） 吸量管（2mL 、5mL )2藥品： C2H5OH 無水 AR; n-C3H7OH 無水 AR 3 其它：食用酒 酊劑檢品四、操作步驟1色譜操作條件柱溫升溫程序：60 1min，10/min升至200，并維持5min.進(jìn)樣溫度200 ，檢測器溫度300 ，N2（載氣）流速1.0mLmin-1，分流比20：1， H2流速為30mLmin-1，空氣流速300mLmin-1，尾吹氣25ml/min.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定準(zhǔn)確移取2.50 mL 無水C2H5OH 和2.50 mL 無水n-C3H7OH于50 mL 容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。用微量注射器吸取0.2L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入色譜儀內(nèi)，記錄各峰的保留時(shí)間tR，測量各峰的峰面積，求以n-C3H7OH為標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)校正因子。3 樣品溶液的測定準(zhǔn)確移取5.00 mL 酒樣及2.50 mL 內(nèi)標(biāo)物無水n-C3H7OH于50 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。用微量注射器吸取0.2 L 樣品溶液注入色譜儀內(nèi)，記錄各峰的保留時(shí)間tR，以標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液的tR對(duì)照，定性樣品中的醇，測定C2H5OH 、n-C3H7OH的峰高及半峰寬，求樣品中C2H5OH的含量。五、數(shù)據(jù)處理本實(shí)驗(yàn)C2H5OH的含量按下列公式計(jì)算：式中：iC2H5OH 的質(zhì)量濃度（單位為g mL-1) ;mi樣品中C2H5OH質(zhì)量（單位為g ) ; V樣品溶液體積（單位為mL ) ; 10稀釋倍數(shù)；Ai / As 樣品溶液中C2H5OH與n-C3H7OH的峰面積比；Ai/ A s標(biāo)準(zhǔn)溶液中純C2H5OH 與n-C3H7OH的峰面積比；mi標(biāo)準(zhǔn)溶液中純C2H5OH的質(zhì)量，它等于體積V 乘密度 。六、思考題1. 內(nèi)標(biāo)物的選擇應(yīng)符合哪些條件？用內(nèi)標(biāo)法定量有何優(yōu)缺點(diǎn)？2. 熱導(dǎo)檢測器和氫火焰檢側(cè)器各有什么特點(diǎn)？七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求附標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液色譜圖 （要求編輯成WORD文檔打印，并作標(biāo)注）結(jié)果計(jì)算報(bào)告 （注意：計(jì)算需要無水C2H5OH和無水n-C3H7OH密度，實(shí)驗(yàn)中根據(jù)標(biāo)簽記錄）實(shí)驗(yàn)三 高效液相色譜法測定維生素B1含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)和掌握含維生素樣品的處理和HPLC檢測方法。2. 進(jìn)一步了解高效液相色譜儀的使用操作性能。3. 掌握標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立、數(shù)據(jù)的處理及定量分析。二、實(shí)驗(yàn)原理果蔬及其制品、各種飲料制品中的主要維生素B1可用高效液相色譜進(jìn)行測定。樣品經(jīng)過酸水解處理、離心及超濾，用C-18反相柱和甲醇-庚烷磺酸鈉溶液作流動(dòng)相，在紫外280nm處定量測定。本法可同時(shí)測定維生素B2、B3、B6、B12及煙酰胺等多種維生素含量。三、材料與儀器材料：果汁。儀器：100ml量筒、燒杯、移液管、高效液相色譜儀、分析天平、0.45m濾膜、溶劑過濾器、樣品過濾器，微量進(jìn)樣器等。4、 試劑 冰醋酸、三乙胺、庚烷磺酸鈉為分析純；甲醇為色譜純；維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于98%）。流動(dòng)相的制備：0.005mol/L庚烷磺酸鈉（0.05%三乙胺和0.5%冰醋酸）-甲醇 （72:28）用0.45m膜過濾，置超聲波振蕩儀上脫氣1h，待用。維生素B1標(biāo)準(zhǔn)母液配制（1mg/mL）：稱取維生素B1 100mg，加適量水，置65水浴中振搖15分鐘，冷卻至室溫，定容至100mL。五、操作步驟（一）樣品制備取5 mL果汁至燒杯中，用流動(dòng)相定容至100mL容量瓶中，再用0.45m微孔濾膜過濾，作為待測液。（二）色譜條件色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠填料Octadecylsilyl，簡稱ODS C-18柱（4.6mm250mm， 5m）；流動(dòng)相：0.005mol/L庚烷磺酸鈉（0.05%三乙胺和0.5%冰醋酸）-甲醇 （72:28）流速：1.0 ml/min檢測波長：UV 280nm 柱溫：30進(jìn)樣量：20l（三）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取維生素B1標(biāo)準(zhǔn)液，用倍比稀釋法稀釋成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/ml濃度，進(jìn)樣量為20l，進(jìn)行分離，并以各種維生素B1的濃度對(duì)峰高（或峰面積）分別制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)進(jìn)行樣品中各種維生素B1含量的測定。（四）樣品測定取樣品處理液20l 進(jìn)行色譜分析，以標(biāo)準(zhǔn)色譜圖進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中的維生素B1，并計(jì)算含量。六、計(jì)算按下列公式計(jì)算樣品中維生素B1的含量（C） C=N*（H/Hm）*F.50.（V/W）.（1000/1000） 式中：C各種維生素的含量，以mg/kg（L）表示 N20l維生素含量 g/20l H樣品中某種維生素的峰高（mm） Hm標(biāo)準(zhǔn)溶液中某種維生素的峰高（mm） F稀釋倍數(shù) V樣品的定容體積（100ml） W樣品的稱取量（g或ml） 七、注意事項(xiàng)上機(jī)之前對(duì)各樣品及標(biāo)樣用0.45m膜過濾2ml左右，并用剩余的樣品測 pH值，pH小于2.5不能上機(jī)。手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)必需用力均勻，水平注入，避免進(jìn)樣引起誤差。八、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求 1、各濃度標(biāo)準(zhǔn)維生素的洗脫圖 2、樣品洗脫圖。（要求編輯成WORD文檔打?。?3、繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（在EXCEL中進(jìn)行打印）。 4、結(jié)果計(jì)算報(bào)告思考題1、維生素B1的測定HPLC法中樣品峰的定性依據(jù)是什么？2、通過本次實(shí)驗(yàn)要想得到分離效果較好的樣品洗脫圖譜的工作條件主要取決于哪些？3、HPLC法測定維生素B1與其它方法比較有哪些優(yōu)點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)四 原子吸收分光光度法測定金屬元素含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握原子吸收分光光度法的特點(diǎn)及應(yīng)用； 2 了解原子吸收分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)及其使用方法。二、原子吸收光譜法的基本原理 原子吸收光譜分析是基于從光源中輻射出的待測元素的特征光波通過樣品的原子蒸氣 時(shí)，被蒸氣中待測元素的基態(tài)原子所吸收，使通過的光波強(qiáng)度減弱，根據(jù)光波強(qiáng)度減弱的程 度，可以求出樣品中待測元素的含量。 利用銳線光源在低濃度的條件下， 基態(tài)原子蒸氣對(duì)共振線的吸收符合朗伯比爾定律式中，A 為吸光度，I0 為入射光強(qiáng)度，Iv 為經(jīng)原子蒸氣吸收后的透射光強(qiáng)度，K 為吸光系數(shù)，l 為輻射光穿過原子蒸氣的光程長度，N為基態(tài)原子密度。 當(dāng)試樣原子化，火焰的絕對(duì)溫度低于 3000 K 時(shí)，可以認(rèn)為原子蒸氣中基態(tài)原子的數(shù)目 實(shí)際上接近原子總數(shù)。在固定的實(shí)驗(yàn)條件下，原子總數(shù)與試樣濃度 c 的比例是恒定的，則等 式（1）可記為： A=Kc 是原子吸收分光光度法定量分析的基本關(guān)系式。常用標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行定量分析。三、儀器設(shè)備1）原子吸收分光光度計(jì)2）50mL容量瓶3）250mL容量瓶4）分析天平5）銅、鈣、鉛等的空心陰極燈四、試劑1標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1000ug/mL）2標(biāo)準(zhǔn)使用液（100ug/mL）準(zhǔn)確吸取10mL上述標(biāo)準(zhǔn)貯備液于100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度線，搖勻備用。五、試驗(yàn)步驟1. 樣品前處理樣品消化或灰化。2. 配制標(biāo)準(zhǔn)工作液3. 配制樣品溶液準(zhǔn)確吸取適量樣液置于25mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，使測定結(jié)果落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。4. 測定開機(jī)前先檢查水封是否有水，乙炔管道有無泄漏（空氣中有無乙炔氣味）, 打開抽風(fēng)機(jī) 打開電腦以及原子吸收分光光度計(jì)電源開關(guān)。分析方法設(shè)計(jì) 進(jìn)入軟件點(diǎn)文件選擇新建選擇分析方法（火焰法、石墨法、氫化物法等） 分析任務(wù)選擇（Cu、Pb、Ca 等）填寫數(shù)據(jù)表（批數(shù)、個(gè)數(shù)、測量次數(shù)、稀釋倍數(shù)） 展開完成儀器控制點(diǎn)擊自動(dòng)波長精調(diào)完成檢測（準(zhǔn)備兩杯水，一杯 調(diào)零，另一杯洗樣管） 將元素?zé)纛A(yù)熱 30min 打開空壓機(jī)，將壓力調(diào)到 0.3Mpa 打開乙炔鋼瓶閥，將出氣閥壓力調(diào)到 0.050.06Mpa 之間 調(diào)整燃燒器高度，對(duì)好光路 旋開儀器上的乙炔伐，按點(diǎn)火開關(guān)，點(diǎn)火，調(diào)節(jié)火焰大小.依次檢測標(biāo)準(zhǔn)空白（純水）、標(biāo)液 14標(biāo)液，未知樣品。 檢測完畢后，保存數(shù)據(jù)吸去離子水 10min，關(guān)乙炔，使管道中氣體燒完再關(guān)儀器、電腦、空壓機(jī)。六、數(shù)據(jù)及處理1. 記錄實(shí)驗(yàn)條件（1）儀器型號(hào)（2）吸收線波長（nm）（3）空心陰極燈電流（mA）（4）狹縫寬度（mm）（5）燃燒器高度（mm）（6）乙炔流量（L/min）（7）空氣流量（L/min）列表記錄