從互作揭開lncRNA的秘密.docVIP

從互作揭開lncRNA的秘密近年來，長非編碼RNA（lncRNA）得到了研究界的廣泛關注。如今，人們已經鑒定了大量lncRNA，但大多數lncRNA的功能還未明確。為了解決這一問題，研究者們開始對lncRNA的互作蛋白進行研究，并為此開發(fā)出了越來越多的分析工具。 RIPRNA結合蛋白免疫沉淀技術又稱為RIP（RNA immunoprecipitation），可以說是RNA版的ChIP（染色質免疫沉淀），該技術能幫助人們分析與RNA結合蛋白相關的核酸。在RIP試劑盒（如Sigma的Imprint RNA Immunoprecipitation kit）的幫助下，研究者們能夠利用針對RNA結合蛋白的抗體，從細胞提取物中捕獲與蛋白相結合的RNA，再通過qPCR、芯片或二代測序技術對這些RNA進行鑒定。 不論是細胞質還是細胞核，都會發(fā)生RNA與蛋白的相互作用。據Active Motif公司產品經理Kyle Hondorp介紹，該公司的RNA ChIP-IT kit專用于研究RNA與細胞核染色質的相互作用。該試劑盒通過甲醛固定來鎖定RNA-染色質的互作，隨后對染色質進行超聲，并用DNAse I處理，最后利用磁珠進行沉淀?！叭缒阊芯康氖强俶RNA，那么常規(guī)RIP試劑盒更合適一些，”Hondorp說，“常規(guī)RIP試劑盒可以處理所有細胞裂解物的總mRNA?！?生產Magna RIP RNA-binding protein immunoprecipitation kit的EMD Millipore公司，也在開發(fā)專門針對染色質的RIP試劑盒。預計這一新產品將于2014年第一季度發(fā)布，該產品有化學交聯與native兩種形式。據介紹，化學交聯可以分析究間接的蛋白-RNA相互作用，研究更高分子量的蛋白復合物。而native方法展現的是，親和力更高也更為直接的相互作用。除RIP以外，CLIP（UV crosslinking and immunoprecipitation）也可以幫助人們捕捉與RNA結合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交聯與核酸酶消化，不僅允許對RNA-蛋白復合物進行進一步的純化（如凝膠電泳片段分離），還能夠揭示RNA-蛋白互作所發(fā)生的位點。最近人們又開發(fā)出了新型CLIP 技術iCLIP（individual-nucleotide resolution CLIP），該技術能夠以單個堿基的分辨率，來展示RNA-蛋白互作的詳細信息。 據倫敦大學學院的Jernej Ule教授介紹，CLIP與RIP的關鍵性差異，在于沉淀復合物后的凝膠純化步驟。CLIP技術可以給RNA-蛋白復合物的RNA末端帶上放射性標記，并將這些復合物進行SDS-PAGE分離，之后轉移到一張膜上。這樣的過程可以提高純化的特異性，減少非特異性的RNA。蛋白酶消化可以將RNA從膜上解離下來，用于制備cDNA文庫，以備測序分析?！癈LIP要比RIP麻煩一些，不過我認為它很值得采用，”Ule說?！胺派湫孕盘柕牧考捌涮禺愋?，能夠幫助我們提高cDNA文庫的質量，最終得到準確實用的數據?！?ChIRP、CHART和RAP如果你對某種RNA感興趣，希望研究與其發(fā)生相互作用的蛋白，就需要采用新的實驗方案。ChIRP（chromatin isolation by RNA purification）、CHART（capture hybridization analysis of RNA targets）和RAP（RNA antisense purification）都基于同樣的理念，將與目標RNA互補的寡核苷酸進行生物素標記，并由此捕獲相關蛋白。之后研究者可以通過二代測序或質譜分析，來鑒定與RNA互作的蛋白，明確發(fā)生這些互作的基因組區(qū)域。據NEB的G. Brett Robb介紹，上述三種方法解決了當今RNA生物學中的關鍵需求。目前，研究者們已經鑒定了大量的lncRNA，但卻不清楚它們的功能?！敖鉀Q這一問題的途徑之一，就是尋找與這些RNA發(fā)生互作的蛋白?！迸e例來說，加州理工學院的Mitchell Guttman和賓州大學的Jeannie Lee，就分別在使用RAP和CHART對Xist lncRNA展開研究。 據悉，目前ChIRP、CHART和RAP技術都還沒有商業(yè)化。不過有一個試劑盒可以實現從已知RNA分離蛋白，即MBL International的RiboTrap系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠利用體外轉錄的RNA（帶生物素標記），從細胞提取物中分離與之結合的蛋白。讓互作變的清晰可見在體外確定了自己感興趣的RNA-蛋白互作之后，我們可以通過體內實驗進行驗證。這時，Sigma公司的DuoLink proximity-ligation assay就派上了用場。 Sigma公司的Aaron Sin介紹道，DuoLink系列原本用于研究蛋白質之間的相互作用。這一系統(tǒng)包括兩種標記了寡核苷酸的抗體，這些抗體分別針對發(fā)生互作的兩個目標蛋白。如果這兩個抗體相距50nm以內，即表示兩個目標蛋白發(fā)生了相互作用。在這種情況下，抗體上標記的寡核苷酸就能夠相互作用。在滾環(huán)擴增之后，人們可以通過熒光探針雜交，檢測到上述事件，在原位觀察到明亮的熒光點。最近，Georgia理工學院和Emory大學的研究人員將這一方法加以改進，使其能夠用于蛋白與RNA互作的檢測。該研究團隊開發(fā)的這一新技術稱為FMTRIPs（Cy3B-labelled flag-tagged, multiply labeled tetravalent RNA imaging probes），這種探針包括一個帶多肽標簽的親和素分子，其上結合有四個熒光標記的序列特異性寡核苷酸探針。在RNA與蛋白結合的地方，上述探針能夠產生明亮且可定量的熒光信號。 據Sin介紹，DuoLink技術能夠幫助研究者們確定互作發(fā)生的位置，以及互作發(fā)生的條件，并且還能檢驗互作對干擾因素的敏感程度?！澳憧梢酝ㄟ^RIP鑒定與蛋白發(fā)生互作的RNA，然后用DuoLink分析互作事件的發(fā)生，或者觀察藥物添加對互作造成的影響?！?生物信息學途徑生物信息學技術也可以用于預測RNA與蛋白的相互作用。例如，catRAPID算法可以通過蛋白和RNA的序列，來計算可能存在的互作組合。該算法的開發(fā)者之一Gian Gaetano Tartaglia解釋道，這種算法對互作事件的預測，完全依賴于蛋白和RNA的序列信息，包括這兩種分子的二級結構，氫鍵和范德華力。 用蛋白序列或RNA序列都可以進行catRAPID查詢。該軟件可以測試不同互作的相對強度，還能夠將長序列打斷以便于分析。新“omics”版的catRAPID能夠在幾分鐘內，將輸入序列與整個轉錄組（或蛋白質組）