Restriction endonuclease enzyme digestion限制內(nèi)切酶.doc

一、 前言： 1950年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)噬菌體 ( phage) 對(duì)大腸桿菌的不同菌株 (strain) 具有不同的感染能力。 1962年瑞士科學(xué)家Werner Arber等人證實(shí)E. coli K菌株可產(chǎn)生一種酵素能水解 phage的DNA，因而稱為限制酵素。 1970年科學(xué)家開始利用限制酵素來處理自細(xì)胞分離出的長(zhǎng)條型DNA，以得到固定大小的特定DNA片段，可應(yīng)用在基因組結(jié)構(gòu)與重組DNA的研究。二、 目的：1. 將分離得到的質(zhì)體DNA，以不同的限制酶切割，經(jīng)agarose膠電泳分離DNA片段後，檢定質(zhì)體圖譜或截切所需DNA片段，以進(jìn)行重組質(zhì)體DNA（recombinant plasmid DNA）之建構(gòu)。2. 載體DNA ：pBac-D-Pn539-E約7.2 Kb 與pET-21(+)約5.4 Kb ，分別以限制酶BamHI與EcoRI切割來檢定plasmid的正確性。三、 原理： 利用限制性內(nèi)切酶切割DNA是DNA重組過程中的關(guān)鍵步驟之一。成功的酶切為後續(xù)工作提供了有效的實(shí)驗(yàn)材料。限制性內(nèi)切酶是細(xì)菌體內(nèi)限制修飾系統(tǒng)內(nèi)部切斷的內(nèi)切酶。根據(jù)限制性內(nèi)切酶的特性可分為、三種類型。本實(shí)驗(yàn)使用其中的型酶對(duì)DNA分子進(jìn)行切割。 在酶切反應(yīng)中，DNA的純度、緩衝液中的離子強(qiáng)度、Mg2+、pH值、作用濃度等因素均可影響反應(yīng)，一般可通過增加酶的用量，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間等措施以達(dá)到完全酶切。限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）能將雙股DNA切開的酵素。切割方法是將糖類分子與磷酸之間的鍵結(jié)切斷，進(jìn)而於兩條DNA鏈上各產(chǎn)生一個(gè)切口，且不破壞核苷酸與鹼基。切割形式有兩種，分別是可產(chǎn)生具有突出單股DNA的黏狀末端，以及末端平整無凸起的平滑末端。由於斷開的DNA片段可由另一種稱為DNA連接酶的酵素黏合，因此染色體或DNA上不同的限制片段，得以經(jīng)由剪接作用而結(jié)合在一起。l 限制酵素的單位限制性內(nèi)切酶的活性以酶的活性單位unit (U)表示，1個(gè)酶單位（Unit/ U）指的是在反應(yīng)總體積為20l，最適溫度條件下於一小時(shí)時(shí)間可將1gDNA分解完全的限制酵素量。l 限制酶的命名限制酶的命名是以該酶來源的原核生物的名稱爲(wèi)依據(jù)，即酶的名稱的第一個(gè)大寫字母取自於屬名的第一個(gè)字母，第二、三個(gè)小寫字母取自於種名的前兩個(gè)字母，字母後面的羅馬字則是簡(jiǎn)單地表明該種生物中不同限制酶分離的先後順序。限制酶名稱的書寫方式，前三個(gè)字母常用斜體或加下橫線表示。例如， 分離自產(chǎn)色鏈黴菌(Streptomyces achromogenes )的兩種限制酶被分別命名爲(wèi)SacI和 SacII。若同一生物種內(nèi)又分爲(wèi)不同的血清型或菌株品系，其名稱則放在限制酶名稱的第三個(gè)字母之後。例如限制酶Hinc和Hind則是分別來自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的c和d血清型菌株。l 限制酶的種類 已知的限制酶分為Type I、Type II與 Type III三類。 Type I與Type III限制酶同時(shí)具有endonuclease與methylase的活性。 Type I限制酶會(huì)隨機(jī)的切割距離辨識(shí)位置1000 bp的序列，Type III則只會(huì)切割距離辨識(shí)位置2426 bp的序列。 Type II限制酶，則會(huì)專一地切割所辨識(shí)的核酸序列的位置，一般可辨識(shí)雙股DNA上特定的48個(gè)鹼基，並能在認(rèn)知序列內(nèi)的特定位點(diǎn)上切割雙股螺旋DNA。 每一種限制酶能辨識(shí)一特定的DNA序列並加以切割，但它不會(huì)切割細(xì)菌自己的DNA，因?yàn)榧?xì)菌 DNA 上的切割位置已被甲基化，稱為restriction-modification system。 不同的細(xì)菌中可純化出具不同專一性的限制酵素，可用來做基因剪接時(shí)的剪刀，使其成為基因或分子遺傳操作上極為有用的工具，目前被廣泛應(yīng)用於遺傳工程、基因選殖(cloning)和基因圖譜分析(gene mapping) 。 第一型限制酶同時(shí)具有修飾(modification)及認(rèn)知切割(restriction)的作用；另有認(rèn)知(recognize)DNA上特定鹼基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距離認(rèn)知位(recognition site)可達(dá)數(shù)千個(gè)鹼基之遠(yuǎn),並不能準(zhǔn)確定位切割位點(diǎn)，所以並不常用。例如：EcoB、EcoK。 第二型限制酶只具有認(rèn)知切割的作用，修飾作用由其他酵素進(jìn)行。所認(rèn)知的位置多為短的迴文序列(palindrome sequence)；所剪切的鹼基序列通常即為所認(rèn)知的序列。是遺傳工程上，實(shí)用性較高的限制酶種類。例如：EcoRI、HindIII。 第三型限制酶與第一型限制酶類似，同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用?？烧J(rèn)知短的不對(duì)稱序列，切割位與認(rèn)知序列約距24-26個(gè)鹼基對(duì)，並不能準(zhǔn)確定位切割位點(diǎn)，所以並不常用。例如：EcoPI、HinfIII。l 第II型限制酶 第II型限制酶只會(huì)辨認(rèn)特定短的DNA序列，因此廣泛被應(yīng)用於基因工程的技術(shù)上，目前商品化的產(chǎn)品很多，可由生技公司購得。 此種限制酶會(huì)辨認(rèn)長(zhǎng)度46 bps (或更長(zhǎng)) 等不同的核苷酸序列，很準(zhǔn)確的在某一點(diǎn)上切DNA成對(duì)稱的兩軸交互分開，這種交互切口會(huì)使DNA片段的5和3懸空成sticky end (or cohesive end突出端)l 常見的內(nèi)限制酶及其辨認(rèn)的切位酵素名稱來源辯識(shí)序列切法EcoRIEscherichia coli5GAATTC3CTTAAG5-G AATTC-33-CTTAA G-5BamHIBacillus amyloliquefaciens5GGATCC3CCTAGG5-G GATCC-33-CCTAG G-5HindIIIHaemophilus influenzae5AAGCTT3TTCGAA5-A AGCTT-33-TTCGA A-5TaqIThermus aquaticus5TCGA3AGCT5-T CGA-33-AGC T-5NotINocardia otitidis5GCGGCCGC3CGCCGGCG5-GC GGCCGC-33-CGCCGG CG-5HinfIHaemophilus influenzae5GANTC3CTNAG5-G ANTC-33-CTNA G-5Sau3AStaphylococcus aureus5GATC3CTAG5- GATC-33-CTAG -3PovII*Proteus vulgaris5CAGCTG3GTCGAC5-CAG CTG-33-GTC GAC-5SmaI*Serratia marcescens5CCCGGG3GGGCCC5-CCC GGG-33-GGG CCC-5HaeIII*Haemophilus egytius5GGCC3CCGG5-GG CC-33-CC GG-5AluI*Arthrobacter luteus5AGCT3TCGA5-AG CT-33-TC GA-5EcoRV*Escherichia coli5GATATC3CTATAG5-GAT ATC-33-CTA TAG-5KpnIKlebsiella pneumonia5GGTACC3CCATGG5-GGTAC C-33-C CATGG-5PstIProvidencia stuartii5CTGCAG3GACGTC5-CTGCA G-33-G ACGTC-5SacIStreptomyces achromogenes5GAGCTC3CTCGAG5-GAGCT C-33-C TCGAG-5SalIStreptomyces albue5GTCGAC3CAGCTG5-G TCGAC-33-CAGCT G-5SphIStreptomyces phaeochromogenes5GCATGC3CGTACG5-G CATGC-33-CGTAC G-5XbaIXanthomonas badrii5TCTAGA3AGATCT5-T CTAGA-33-AGATC T-5* = 平滑末端(blunt ends)/鈍端切割(blunt end)；其餘為黏滯切割(sticky end)l 限制酵素的使用1. 單一酵素使用：注意buffer2. 兩種不同限制酵素以上一起使用：選擇可使兩種酵素活性反應(yīng)達(dá)75%以上的bufferl 先加低鹽的buffer作用一酵素，再加入高鹽的buffer作用另一酵素3. 當(dāng)有多個(gè)樣品要用相同的酵素處理：配master solutionl4. Inactivation of restriction enzyme：l heatl phenol/chloroform/isoamyl alcoholl Star-activity：指限制酵素對(duì)所作用的DNA及序列失去專一性。當(dāng)酵素辨認(rèn)切割位的能力降低，導(dǎo)致相似的序列或是錯(cuò)誤的辨認(rèn)序列長(zhǎng)度也會(huì)作用，如六個(gè)變成只認(rèn)四個(gè)，而產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。 原因 pH值過高(8.0) 離子濃度過低(25mM) 高glycerol濃度(5% v/v) 溶液中含有機(jī)溶液(如DMSO，酒精等) Mg+2被其他二價(jià)陽離子取代(如Mn+2,Cu+2,Co+2,Zn+2等) 酵素(unit)與DNA重量(ug)的比例過高(每種酵素比例不同，但一般在100u/ug時(shí))四、 材料與設(shè)備：A.材料:質(zhì)體: pBac-D-Pn539-E 、pET-21(+)酵素:RNase ARestriction enzymesEcoRI 20U/l buffer EcoRIBamHI 20U/l buffer BmHIB 儀器:離心機(jī)、37的水浴槽五、 問題與討論A. 請(qǐng)?jiān)敿?xì)說明限制酵素三種type 的特性？ 第一型限制酶功能：限制、修飾特點(diǎn)：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為輔助因數(shù)；識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不一致，無固定切割位點(diǎn)；應(yīng)用：不常用。 第二型限制酶功能：識(shí)別並特異切割DNA分子。 即通常所指DNA限制性核酸內(nèi)切酶；反應(yīng)特點(diǎn)：僅需 Mg2+ 作催化反應(yīng)輔助因數(shù)，能識(shí)別雙鏈DNA特殊序列，並可特異切割DNA，產(chǎn)生特異片段；應(yīng)用：種類繁多，分子克隆中最為常用 第三型限制酶功能：限制、修飾特點(diǎn)：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為輔助因數(shù)；特異切割，切割位點(diǎn)在距識(shí)別位點(diǎn)3端24-26 bp處。應(yīng)用：數(shù)量很少，無實(shí)際作用。B. (1)何為restriction-modification system ？(2)細(xì)菌如何抵抗phage？(3)限制酵素為何不會(huì)切自己的DNA？(1)大多數(shù)限制性內(nèi)切酶常常伴隨有12種修飾酶（DNA甲基化酶），後者能保護(hù)細(xì)胞自身的DNA不被限制性內(nèi)切酶破壞。修飾酶識(shí)別的位點(diǎn)與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶相同，它們的作用是甲基化每條鏈中的一個(gè)鹼基，而不是切開DNA鏈。甲基化所形成的甲基基團(tuán)能伸入到限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的雙螺旋大溝中，阻礙限制性內(nèi)切酶發(fā)揮作用。這樣，限制性內(nèi)切酶和它的“搭檔”修飾酶一起組成R-M系統(tǒng)。在某些R-M系統(tǒng)中，限制性內(nèi)切酶和修飾酶是兩種不同的蛋白，它們各自獨(dú)立行使自己的功能；另一些R-M系統(tǒng)本身就是一種大的限制-修飾複合酶，由不同亞基或同一種亞基的不同結(jié)構(gòu)域來分別執(zhí)行限制或修飾的功能。1. 定義限制修飾系統(tǒng)（Restriction modification system 或 R-M系統(tǒng)）是一種存在於細(xì)菌（可能還有其他原核生物），可保護(hù)個(gè)體免於外來DNA（如噬菌體）侵入的系統(tǒng)，主要由限制內(nèi)切酶和甲基化酶組成的二元系統(tǒng)。2. 結(jié)構(gòu)編細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)包含三個(gè)連鎖基因：（1）hsd R：編碼限制性核酸內(nèi)切酶（2）hsd M：編碼限制性甲基化酶（3）hsd S：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達(dá)3. 作用機(jī)制有些細(xì)菌體內(nèi)含有限制酶，可將雙股DNA切斷，之後其他的內(nèi)切酶再將切下的片段降解，因此能將入侵的外來DNA摧毀；有些病毒則演化出對(duì)抗此系統(tǒng)的機(jī)制，它們的DNA經(jīng)過了甲基化或糖基化的修飾，可阻礙限制酶的作用；另外還有一些病毒，如T3及T7噬菌體，則合成出一些可抑制限制酶的蛋白質(zhì)；而為了進(jìn)一步對(duì)抗病毒，有些細(xì)菌演化出專門辨識(shí)並切割已修飾DNA的限制系統(tǒng)。(2)宿主菌對(duì)噬菌體的天然抵抗機(jī)制分為4個(gè)主要的類別：吸附抑制、流產(chǎn)感染、限制-修飾系統(tǒng)和穿入阻滯。1. 吸附抑制(absorption inhibition)最有效的防禦即是阻止phage與其之間的任何物理性接觸，這可以通過細(xì)菌細(xì)胞壁上phage的受體突變，或者可以更有效地通過分泌阻止phage接近的屏障，如：莢膜、黏液層來實(shí)現(xiàn)。ex：通常情況下 T phage可以吸附在E.coli B和 K-12細(xì)胞壁的特殊位點(diǎn)上並進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，E.coli B和 K-12的一些突變株在細(xì)胞壁上表達(dá)過多的多糖莢膜，這些過多的莢膜覆蓋了細(xì)胞壁上phage的受體位點(diǎn)，從而產(chǎn)生了對(duì)T phage的抵抗作用；而抑制莢膜形成的E.coli B和 K-12的11011.9的突變株就能抑制T phage的抵抗作用，該突變株可能由發(fā)生在non-9的等為基因上的組蛋白相關(guān)的突變形成。2. 流產(chǎn)感染(abortive infection / Abi)流產(chǎn)感染(Abortive infection Abi)系統(tǒng)(也稱噬菌體排斥系統(tǒng))是在噬菌體的不同發(fā)育階段干擾噬菌體增殖的一種機(jī)制。在噬菌體感染的過程中，噬菌體的吸附和 DNA 注入正常發(fā)生，只是後續(xù)發(fā)生的噬菌體發(fā)育過程被終止。由於噬菌體的侵入，幹?jǐn)_了宿主細(xì)胞的正常生理功能，導(dǎo)致了被感染宿主細(xì)胞的死亡，進(jìn)而終止了噬菌體的增殖，被感染細(xì)胞的死亡阻止了噬菌體的擴(kuò)散，為周圍細(xì)胞的生存提供了保護(hù)。Abi 系統(tǒng)多數(shù)編碼在質(zhì)?；蚯笆删w上，常常由單一宿主基因所介導(dǎo)。ex：在噬菌體溶源性的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的 Rex 系統(tǒng)是目前為止研究最清楚的Abi系統(tǒng)3. restriction-modification system限制修飾(Restriction-Modification RM)系統(tǒng)是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌免疫系統(tǒng)，典型的 RM系統(tǒng)由限制酶(REase)和甲基轉(zhuǎn)移酶(MTase)構(gòu)成，它們通常成對(duì)出現(xiàn)，具有相同的 DNA 識(shí)別位點(diǎn)。REase 識(shí)別並裂解特定的 DNA 序列，同源的 MTase 對(duì)同一識(shí)別位點(diǎn)上的腺嘌呤或胞嘧啶進(jìn)行甲基化，保護(hù) DNA不被REase 裂解。正常情況下，含有RM的細(xì)胞在DNA複制過程中被甲基化，而外來核酸 ( 如噬菌體和質(zhì)粒DNA)的甲基化模式