淋巴細(xì)胞亞群.doc

機(jī)體免疫狀態(tài)是衡量機(jī)體是否患病的重要指標(biāo)，目前多采用流式細(xì)胞術(shù)來監(jiān)測(cè)機(jī)體的免疫狀態(tài)，其中最重要的指標(biāo)是檢測(cè)T、B和NK淋巴細(xì)胞的水平。 T細(xì)胞主要包括T輔助細(xì)胞（Th）和T抑制細(xì)胞（Ts）細(xì)胞亞群。CD3+細(xì)胞代表外周血中總的成熟T細(xì)胞，理論上應(yīng)約等于CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞的總和，但往往出現(xiàn)CD4+加CD8+細(xì)胞之和大于CD3+，這是因?yàn)镃D4+細(xì)胞包括CD3+/CD4+細(xì)胞（真正Th細(xì)胞）和CD3-CD4+細(xì)胞（非Ts細(xì)胞），而后者包括CD3-CD8+CD16+56+細(xì)胞（一部分NK細(xì)胞）和CD3-CD8+CD16+56-（未知細(xì)胞）。由此可見，真正的TH細(xì)胞是CD3+CD4+細(xì)胞，真正Ts細(xì)胞是CD3+CD8+細(xì)胞。尤其當(dāng)患者NK細(xì)胞明顯增加時(shí)，會(huì)使CD4細(xì)胞和CD8細(xì)胞的總和遠(yuǎn)大于CD3+細(xì)胞，因此，用三色熒光標(biāo)記才能分析真正的輔助性T細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞。 首先在淋巴細(xì)胞中識(shí)別出CD3細(xì)胞，然后在CD3細(xì)胞中再區(qū)分CD4+和CD8+細(xì)胞。NK細(xì)胞的表面無T細(xì)胞和B細(xì)胞表面標(biāo)志，但有CD16和CD56等標(biāo)志，用CD16+56抗體能鑒定出NK細(xì)胞（一定是CD3陰性），CD3-CD16+56+細(xì)胞才是真正的NK細(xì)胞。根據(jù)是否表達(dá)CD8，又可將NK細(xì)胞分為CD3-CD8+CD16+56+細(xì)胞（所占比例小，不影響CD8比例）和CD3-CD8-CD16+56+細(xì)胞（主要成分）。 B細(xì)胞的表面標(biāo)志是CD19，理論上CD3-CD19+細(xì)胞才是真正的B淋巴細(xì)胞。但CD3+CD19+細(xì)胞很少，可忽略不計(jì)，所以CD19+細(xì)胞就是B淋巴細(xì)胞。 在抗腫瘤效應(yīng)中，CD4和CD8分別是T淋巴細(xì)胞的輔助誘導(dǎo)細(xì)胞亞群與抑制/細(xì)胞毒細(xì)胞亞群，CD4細(xì)胞的主要功能是通過其分泌的淋巴因子，增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答過程，輔助誘導(dǎo)其它免疫細(xì)胞如殺傷性T細(xì)胞，B細(xì)胞等共同發(fā)揮抗腫瘤作用，CD4細(xì)胞的減少，導(dǎo)致免疫功能低下。CD4/CD8比值是重要的免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)，其比例的降低與免疫系統(tǒng)損害的程度相關(guān)。 CD4降低見于惡性腫瘤、遺傳性免疫缺陷癥、艾滋病、應(yīng)用免疫抑制劑者；CD8降低見于自身免疫性疾病或變態(tài)反應(yīng)性疾?。籆D4/CD8比值升高見于惡性腫瘤、自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)、病毒感染等；CD4/CD8比值降低見于艾滋病(常小于0.5)。監(jiān)測(cè)器官移植排斥反應(yīng)時(shí)，CD4/CD8比值升高預(yù)示可能發(fā)生排斥反應(yīng)。淋巴細(xì)胞擔(dān)負(fù)著免疫的主要功能。淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定有助于了解機(jī)體免疫狀況及一些疾病的監(jiān)測(cè)。利用各種單克隆抗體與淋巴細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，再配合多色熒光染料，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析即可以把各種不同功能的淋巴亞群區(qū)分開來，進(jìn)而得到各亞群的相對(duì)比例。最常檢測(cè)的亞群包括T細(xì)胞（CD3）、B細(xì)胞（CD19）、NK細(xì)胞（CD16+56）、輔助性T細(xì)胞（CD3+CD4+）和抑制性T細(xì)胞（CD3+CD8+）等等。(1) 應(yīng)用CD3/CD19區(qū)分T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞CD3是T細(xì)胞的特異性抗原，CD19則用來識(shí)別B細(xì)胞因此應(yīng)用CD3/CD19雙標(biāo)試劑即可以區(qū)分和鑒定T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞亞群；CD3、CD19陽性表達(dá)為獨(dú)立的陽性細(xì)胞群體。如出現(xiàn)雙陽性細(xì)胞均為假象。這樣就可不用同型對(duì)照來設(shè)定陰性或陽性界線。此外，此檢測(cè)還會(huì)出現(xiàn)雙陰性群體，這些都是NK細(xì)胞，這些細(xì)胞也提供了雙陰性群體的對(duì)照。(2) 應(yīng)用CD3/CD4來鑒定CD4+T細(xì)胞首先用CD3來區(qū)分全部T細(xì)胞而CD3/CD4雙陽性細(xì)胞為真正的輔助/誘導(dǎo)性T細(xì)胞，這是HIV病毒感染的主要對(duì)象;CD3-/CD4+細(xì)胞群是由單核細(xì)胞組成，這些細(xì)胞相對(duì)于CD4+和T細(xì)胞來說弱表達(dá)CD4，在光散射參數(shù)的位置分布也較廣。所以CD3/CD4抗體組合能夠完全把CD4陽性輔助/誘導(dǎo)性T細(xì)胞區(qū)分開。另外，應(yīng)用適當(dāng)?shù)碾p色組合如CD4與CD29,CD4與CD45RA,也可以測(cè)定T輔助細(xì)胞的的亞群。如CD4+2H4(CD 45RA)+細(xì)胞是Ts的誘導(dǎo)細(xì)胞;CD4+ 4B4 (CD29)+細(xì)胞Th的誘導(dǎo)細(xì)胞。同理,利用CD8+CD45RA和CD8+CD29+ S6F1可測(cè)定T抑制細(xì)胞的亞群。T輔助細(xì)胞還可分成Th1、Th2兩個(gè)亞群，同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-和IL-4，可區(qū)分Th1細(xì)胞（CD4+/IFN-+）和Th2細(xì)胞（CD4+/IL-4+）。（3）應(yīng)用CD3/CD8鑒定CD8+T淋巴細(xì)胞CD8的表達(dá)不只限于細(xì)胞毒性T細(xì)胞，此抗原在部分的NK細(xì)胞上也能檢測(cè)到。所以利用CD3抗體才能把該細(xì)胞亞群分開。若采用三色測(cè)定可給出更為準(zhǔn)確的各亞群的情況:如真正的T輔助細(xì)胞應(yīng)是CD3+ CD4+CD8-,真正的T抑制細(xì)胞應(yīng)是CD3+CD4- CD8+,單標(biāo)CD8+細(xì)胞中不僅有T抑制細(xì)胞,還含有30%左右的NK細(xì)胞;而CD3+CD4-CD8-細(xì)胞群是T細(xì)胞,此類細(xì)胞與感染有關(guān)CD3+CD4+ CD8-細(xì)胞+CD3+CD4-CD8+細(xì)胞+CD3+CD4-CD8-細(xì)胞+CD3+CD4+CD8+細(xì)胞=CD3+細(xì)胞。(4)自然殺傷細(xì)胞（NK）的檢測(cè)CD16(FcR)表達(dá)于大多數(shù)NK細(xì)胞上，但也表達(dá)于中性粒細(xì)胞，此抗原NK細(xì)胞的表達(dá)比較弱，并在NK細(xì)胞活化時(shí)丟失；CD56表達(dá)于大多數(shù)NK細(xì)胞上，也表達(dá)于一些T淋巴細(xì)胞，與CD3聯(lián)合使用可以區(qū)分CD3+/CD56+T淋巴細(xì)胞和CD3-/CD56+NK細(xì)胞。聯(lián)合使用3種抗體最完全地鑒定所有的NK細(xì)胞。NK細(xì)胞或表達(dá)CD16，或表達(dá)CD56，但它們不表達(dá)CD3。CD16和CD56聯(lián)合使用，根據(jù)熒光強(qiáng)度可將NK細(xì)胞從雙陰性細(xì)胞中區(qū)分出來。這樣運(yùn)用該試劑組合，NK細(xì)胞可形成獨(dú)立的群體與其它細(xì)胞相區(qū)分。圖1 流式分析細(xì)胞亞群 外周血是臨床檢驗(yàn)中的重要標(biāo)本。FCM分析外周白細(xì)胞的主要目的是了解各種白細(xì)胞的數(shù)目與分群情況。以下給出常用細(xì)胞亞群的正常范圍供參考,請(qǐng)注意同一CD中有多種克隆的McAb,同一CD中不同McAb所測(cè)出的數(shù)值不同,每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)測(cè)定自己實(shí)驗(yàn)室的正常數(shù)值：表1 人外周血各細(xì)胞亞群表面抗原和流式檢測(cè)的正常參考值細(xì)胞表面抗原細(xì)胞名稱正常參考值（%）T細(xì)胞抗原CD2總T細(xì)胞62.5-89.0CD3成熟T細(xì)胞61.1-77.0CD4T輔助/誘導(dǎo)性細(xì)胞亞群15.8-41.6CD5T細(xì)胞（B細(xì)胞亞群）69.5-88.0CD8T細(xì)胞/細(xì)胞毒性細(xì)胞亞群18.1-29.6CD28T細(xì)胞受體共刺激分子39.5-6408CD8+/CD28+細(xì)胞毒性T細(xì)胞8.6-15.5CD8+/CD28-T抑制性細(xì)胞9.9-24.8CD3+/HLA-DR-靜止T細(xì)胞55.3-77.1B細(xì)胞抗原CD19全部B細(xì)胞7.3-18.2CD20全部B細(xì)胞7.3-18.2NK細(xì)胞抗原CD3-/CD（16+56）+NK細(xì)胞8.1-25.6造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞CD33粒細(xì)胞前體21.3-30.4CD34多能干細(xì)胞0.1-0.5活化細(xì)胞表面抗原CD3+/HLA-DR+活化T細(xì)胞1.2-5.8CD3-/HLA-DR+活化B細(xì)胞3.0-11