EN在血管重建早期的作用PPT課件.ppt

RoleofthePhosphatasePTENinEarlyVascularRemodeling 磷酸酶PTEN在早期血管重建中的作用 發(fā)表日期 2013年4月雜志 PLOSONEIF 3 534 研究背景及目的 磷酸酶PTEN是PI3K 磷脂酰肌醇 3 羥激酶 蛋白激酶B Akt 信號通路的一種重要的生理學抑制劑 在過去的研究中 我們致力于研究在體內(nèi)和體外情況下PTEN在血管急性損傷后VSMC凋亡方面的作用 然而 PTEN在血管成形術(shù)誘導的血管損傷的早期階段的作用尚不明了 為了明確該作用機制 我們設計該實驗以探究磷酸酶PTEN在早期血管重塑中的作用 技術(shù)路線 1 體內(nèi) 頸動脈損傷模型構(gòu)建 2 體外 成年Wistar大鼠 300g 頸總動脈分離 未處理 對照 球囊損傷 12h后 PTEN表達量檢測 取材 HcASMC 細胞培養(yǎng)至第六代 干預24h 轉(zhuǎn)染 共轉(zhuǎn)染PTEN 活化的Akt突變體 血清 不同生長因子 周期性拉伸裝置 H2O2 WT PTEN質(zhì)粒 SiRNA 敲出PTEN基因 凋亡VSMC數(shù)量檢測 Akt磷酸化檢測 VSMC凋亡數(shù)量檢測 3 匯總數(shù)據(jù) 統(tǒng)計分析 得出結(jié)論 PTEN表達量檢測 實驗結(jié)果報告 圖1A D 為了探究血管受損后PTEN的表達及細胞凋亡情況 研究人員對實驗大鼠頸動脈進行球囊損傷 12小時后 免疫組化檢測各項指標如上圖 PTEN green apoptoticsmoothmusclecells TUNELstaining red andnuclei DAPI blue 由圖可知 球擴后損傷較嚴重的區(qū)域PTEN表達量較多 正常細胞數(shù)量少 凋亡細胞數(shù)量密集 圖上半部分 實驗結(jié)果報告 圖1E F westernblot usingaspecificPTENantibody 微管蛋白 不同時間點PTEN相對表達量densitometricanalysisofimmunoblots 對經(jīng) 未經(jīng)球擴后的標本裂解后通過免疫沉淀反應進行PTEN活性檢測 ImmunoprecipitationsemployinganIgGiso antibodyandwithoutadditionofanyantibodiesservedascontrols 由圖可知 在大鼠頸動脈受損后12H內(nèi) PTEN的表達具有時間依賴性 遞增 與對照組相比 其活性明顯高于未受損的大鼠頸動脈標本 時間依賴性 實驗結(jié)果報告 圖4A C A Proteinexpressionwasdeterminedbywesternblotting DetectionofCdk4servedasaloadingcontrol SMCtransfectedwithsiRNAtargetingPTENorascrambledcontrolwereincubatedinbasalmediumintheabsence B orpresenceofH2O2 C SMCweretransfectedasfollows nontransfected NT mocktransfected withoutsiRNA butwithlipidcarrier transfectedwithanon targeting scrambled siRNA ControlsiRNA transfectedwithatargetingsiRNAagainstPTEN PTENsiRNA 由圖可知 與對照組相比 經(jīng)siRNA敲出PTEN基因之后 VSMC的PTEN表達量明顯減少 凋亡的SMC數(shù)量亦顯著減少 敲出PTEN基因后PTEN的表達及凋亡細胞數(shù)量變化 實驗結(jié)果報告 圖5A C A Akt磷酸化檢測 westernblot AnantibodyagainsttotalAkt PanAkt wasusedascontrol B PI3 K inhibitorLy294002 50nM wassupplementedtothemediumfornot transfectedcells HcASMCweretransfectedasfollows nontransfected NT transfectedwithaplasmidcodingforGFP pGFP transfectedwithanemptyplasmidwithoutPTEN cDNA pControl transfectedwithaplasmidcodingforPTEN pPTEN mocktrans fected withoutplasmid butwithtransfectionreagent PTEN andAktco overexpressionreversesPTENsproapoptoticeffect C 注 GFP 綠色熒光蛋白 由圖可知 與對照組相比 轉(zhuǎn)染了PTEN質(zhì)粒的HcASMC其Akt磷酸化明顯減弱 在未轉(zhuǎn)染組中加入PI3K抑制劑 Ly294002 之后Akt磷酸化也明顯減弱 當共轉(zhuǎn)染了PTEN質(zhì)粒和活化的Akt之后可以部分翻轉(zhuǎn)SMC凋亡 為了探究PTEN與Akt磷酸化及細胞凋亡的關(guān)系 進行如下實驗 實驗結(jié)果報告 圖6A B A 生長培養(yǎng)基 FCS 培養(yǎng)條件下SMC增殖測定 PTENoverexpressionattenuatesserumInducedHcASMCproliferation A HcASMCtransfectedwithaplasmidcarryingWT PTENoracontrolvectorcarryingGFPalonewereincubatedeitherinbasalmediumorgrowthmediuminthepresenceofBrdU B 基礎(chǔ) 生長培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下SMC增殖測定 HcASMCweretransfectedasfollowing transfectedwithanon targeting scrambled siRNA ControlsiRNA transfectedwithatargetingsiRNAagainstPTEN PTENsiRNA 由圖可知 與對照組相比 轉(zhuǎn)染了WT PTEN質(zhì)粒后SMC增殖明顯減少 敲出PTEN基因后其增殖顯著增多且在生長培養(yǎng)基上表現(xiàn)更顯著 探究PTEN對SMC增殖的影響 實驗結(jié)論 通過上述實驗結(jié)果得出如下結(jié)論 通