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文檔簡介
微生物檢驗(yàn)技術(shù)顯微技術(shù)顯微技術(shù)是微生物檢驗(yàn)技術(shù)中最常用的技術(shù)之一。顯微鏡的種類很多,在實(shí)驗(yàn)室中常用的有:普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。而在食品微生物檢驗(yàn)中最常用的還是普通光學(xué)顯微鏡。一、普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)和基本原理:1.結(jié)構(gòu):光學(xué)顯微鏡是由光學(xué)放大系統(tǒng)和機(jī)械裝置兩部分組成。光學(xué)系統(tǒng)一般包括目鏡、物鏡、聚光器、光源等;機(jī)械系統(tǒng)一般包括鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、鏡臺(tái)、鏡臂和底座等。(圖)標(biāo)本的放大主要由物鏡完成,物鏡放大倍數(shù)越大,它的焦距越短。焦距越小,物鏡的透鏡和玻片間距離(工作距離)也小。油鏡的工作距離很短,使用時(shí)需格外注意。目鏡只起放大作用,不能提高分辨率,標(biāo)準(zhǔn)目鏡的放大倍數(shù)是十倍。聚光鏡能使光線照射標(biāo)本后進(jìn)入物鏡,形成一個(gè)大角度的錐形光柱,因而對(duì)提高物鏡分辨率是很重要的。聚光鏡可以上下移動(dòng),以調(diào)節(jié)光的明暗,可變光闌可以調(diào)節(jié)入射光束的大小。顯微鏡用光源,自然光和燈光都可以,以燈光較好,因光色和強(qiáng)度都容易控制。一般的顯微鏡可用普通的燈光,質(zhì)量高的顯微鏡要用顯微鏡燈,才能充分發(fā)揮其性能。有些需要很強(qiáng)照明,如暗視野照明、攝影等,常常使用鹵素?zé)糇鳛楣庠础D光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)圖2.原理:顯微鏡的放大效能(分辨率)是由所用光波長短和物鏡數(shù)值口徑?jīng)Q定,縮短使用的光波波長或增加數(shù)值口徑可以提高分辨率,可見光的光波幅度比較窄,紫外光波長短可以提高分辨率,但不能用肉眼直接觀察。所以利用減小光波長來提高光學(xué)顯微鏡分辨率是有限的,提高數(shù)值口徑是提高分辨率的理想措施。要增加數(shù)值口徑,可以提高介質(zhì)折射率,當(dāng)空氣為介質(zhì)時(shí)折射率為1,而香柏油的折射率為1.51,和載片玻璃的折射率(1.52)相近,這樣光線可以不發(fā)生折射而直接通過載片、香柏油進(jìn)入物鏡,從而提高分辨率。顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積,而物鏡的放大倍數(shù)越高,分辨率越高。 二、普通顯微鏡的使用方法1、低倍鏡觀察先將低倍物鏡的位置固定好,然后放置標(biāo)本片,轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡,調(diào)好光線,將物鏡提高,向下調(diào)至看到標(biāo)本,再用細(xì)調(diào)對(duì)準(zhǔn)焦距進(jìn)行觀察。除少數(shù)顯微鏡外,聚光鏡的位置都要放在最高點(diǎn)。如果視野中出現(xiàn)外界物體的圖像,可以將聚光鏡稍微下降,圖像就可以消失。聚光鏡下的虹彩光圈應(yīng)調(diào)到適當(dāng)?shù)拇笮?,以控制射入光線的量,增加明暗差。2、高倍鏡觀察顯微鏡的設(shè)計(jì)一般是共焦點(diǎn)的。低倍鏡對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)后,轉(zhuǎn)換到高倍鏡基本上也對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn),只要稍微轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào)即可。有些簡易的顯微鏡不是共焦點(diǎn),或者是由于物鏡的更換而達(dá)不到共焦點(diǎn),就要采取將高倍物鏡下移,再向上調(diào)準(zhǔn)焦點(diǎn)的方法。虹彩光圈要放大,使之能形成足夠的光錐角度。稍微上下移動(dòng)聚光鏡,觀察圖像是否清晰。3、油浸鏡觀察油浸鏡的工作距離很小,所以要防止載皮片和物鏡上的透鏡損壞。使用時(shí),一般是經(jīng)低倍、高倍到油浸鏡。當(dāng)高倍物鏡對(duì)準(zhǔn)標(biāo)本后,再加油浸鏡觀察。載玻片標(biāo)本也可以不經(jīng)過低倍和高倍物鏡,直接用油浸鏡觀察。顯微鏡有自動(dòng)止降裝置的,載玻片上加油以后,將油浸鏡下移到油滴中,到停止下降為止,然后用微調(diào)向上調(diào)準(zhǔn)焦點(diǎn)。沒有自動(dòng)止降裝置的,對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)的方法是從顯微鏡的側(cè)面觀察,將油浸鏡下移到與載玻片稍微接觸為止,然后用微調(diào)向上提升調(diào)準(zhǔn)焦點(diǎn)。使用油浸鏡時(shí),鏡臺(tái)要保持水平,防止油流動(dòng)。油浸鏡所用的油要潔凈,聚光鏡要提高到最高點(diǎn),并放大聚光鏡下的虹彩光圈,否則會(huì)降低數(shù)值口徑而影響分辨率。無論是油浸鏡或高倍鏡觀察,都宜用可調(diào)節(jié)的顯微鏡燈作光源。三、普通顯微鏡的保養(yǎng)顯微鏡是精密貴重的儀器,必須很好地保養(yǎng)。顯微鏡用完后要放回原來的鏡箱或鏡柜中,同時(shí)要注意下列事項(xiàng):1、觀察完后,移去觀察的載玻片標(biāo)本。2、用過油浸鏡的,應(yīng)先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去,再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭23次,最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。3、轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器,放在低倍鏡的位置。4、將鏡身下降到最低位置,調(diào)節(jié)好鏡臺(tái)上標(biāo)本移動(dòng)器的位置,罩上防塵套。鏡頭的保護(hù)最為重要。鏡頭要保持清潔,只能用軟而沒有短絨毛的擦鏡紙擦拭。擦鏡紙要放在紙盒中,以防沾染灰塵。切勿用手絹或紗布等擦鏡頭。物鏡在必要時(shí)可以用溶劑清洗,但要注意防止溶解固定透鏡的膠固劑。根據(jù)不同的膠固劑,可選用不同的溶劑,如酒精、丙酮和二甲苯等,其中最安全的是二甲苯。方法是用脫脂棉花團(tuán)蘸取少量的二甲苯,輕擦,并立即用擦鏡紙將二甲苯擦去,然后用洗耳球吹去可能殘留的短絨。目鏡是否清潔可以在顯微鏡下檢視。轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡,如果視野中可以看到污點(diǎn)隨著轉(zhuǎn)動(dòng),則說明目鏡已沾有污物,可用擦鏡紙擦拭接目的透鏡。如果還不能除去,再擦拭下面的透鏡,擦過后用洗耳球?qū)⒍探q吹去。在擦拭目鏡或由于其他原因需要取下目鏡時(shí),都要用擦鏡紙將鏡筒的口蓋好,以防灰塵進(jìn)入鏡筒內(nèi),落在鏡筒下面的物鏡上。四、顯微計(jì)數(shù)利用血球計(jì)數(shù)器在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常見的微生物計(jì)總數(shù)的方法。因?yàn)橛?jì)數(shù)器載片和蓋片間的容積一定,所以可以根據(jù)顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計(jì)算單位體積內(nèi)微生物總數(shù)。血球計(jì)數(shù)器是一只特制載玻片。載片上有兩個(gè)方格網(wǎng),每一方格網(wǎng)共分九個(gè)大方格,其中間的一個(gè)大方格用來做微生物計(jì)數(shù),所以又稱為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種,一種是每個(gè)大方格分成16個(gè)中方格,每中方格又分成25個(gè)小方格。另一種是一個(gè)大方格分25個(gè)中方格,每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格,不論哪一種,一個(gè)大方格,都等分成(2516或1625)400個(gè)小方格。(圖)因?yàn)槊總€(gè)大方格邊長為1毫米,載片與蓋片間距離為0.1毫米,所以每個(gè)計(jì)數(shù)室(1個(gè)大方格)體積為0.1圖兩種血球計(jì)數(shù)板a. 25X16計(jì)數(shù)板 b.16X25計(jì)數(shù)板立方毫米。測出每個(gè)中方格菌數(shù),就可以算出一個(gè)大方格的菌數(shù),由此推算出1毫升菌液內(nèi)所含的菌數(shù)。一個(gè)大方格是16個(gè)中方格時(shí),應(yīng)當(dāng)數(shù)4角4個(gè)中方格(即100個(gè)小方格)的菌數(shù),一個(gè)大方格是25個(gè)中方格時(shí),除取4角4個(gè)中方格外,還要數(shù)中央一個(gè)中方格(即為80個(gè)小方格)的菌數(shù)。計(jì)算公式如下:1625計(jì)數(shù)板:總菌數(shù)/ml=40010000稀釋倍數(shù)=每個(gè)小方格內(nèi)菌數(shù)4106稀釋倍數(shù)2516計(jì)數(shù)板:總菌數(shù)/ml=40010000稀釋倍數(shù)=每小方格內(nèi)菌數(shù)4106稀釋倍數(shù)染色技術(shù) 由于微生物細(xì)胞含有大量水分(一般在80-90%以上),對(duì)光線的吸收和反射與水溶液的差別不大,與周圍背景沒有明顯的明暗差。所以,除了觀察活體微生物細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和直接計(jì)算菌數(shù)外,絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過染色后,才能在顯微鏡下進(jìn)行觀察。但是,任何一項(xiàng)技術(shù)都不是完美無缺的。染色后的微生物標(biāo)本是死的,在染色過程中微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會(huì)發(fā)生一些變化,不能完全代表其生活細(xì)胞的真實(shí)情況,染色觀察時(shí)必須注意。本節(jié)包括四部分:一、染色的基本原理微生物染色的基本原理,是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素如細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對(duì)染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等?;瘜W(xué)因素則是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生地各種化學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)對(duì)于堿性染料較易吸附,且吸附作用穩(wěn)固;同樣,堿性物質(zhì)對(duì)酸性染料較易于吸附。如酸性物質(zhì)細(xì)胞核對(duì)于堿性染料就有化學(xué)親和力,易于吸附。但是,要使酸性物質(zhì)染上酸性材料,必須把它們的物理形式加以改變(如改變pH值),才利于吸附作用的發(fā)生。相反,堿性物質(zhì)(如細(xì)胞質(zhì))通常僅能染上酸性染料,若把它們變?yōu)檫m宜的物理形式,也同樣能與堿性染料發(fā)生吸附作用。細(xì)菌的等電點(diǎn)較低,pH值大約在25之間,故在中性、堿性或弱酸性溶液中,菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷;而堿性染料電離時(shí)染料離子帶陽電。因此,帶陰電的細(xì)菌常和帶陽電的堿性染料進(jìn)行結(jié)合。所以,在細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料進(jìn)行染色。影響染色的其它因素,還有菌體細(xì)胞的構(gòu)造和其外膜的通透性,如細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與否,在染色上都起一定作用。此外,培養(yǎng)基的組成、菌令、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用等,也都能影響細(xì)菌的染色。 二、染料的種類和選擇染料分為天然染料和人工染料兩種。天然染料有胭脂蟲紅、地衣素、石蕊和蘇木素等,它們多從植物體中提取得到,其成分復(fù)雜,有些至今還未搞清楚。目前主要采用人工染料,也稱煤焦油染料,多從煤焦油中提取獲得,是苯的衍生物。多數(shù)染料為帶色的有機(jī)酸或堿類,難溶于水,而易溶于有機(jī)溶劑中。為使它們易溶于水,通常制成鹽類。染料可按其電離后染料離子所帶電荷的性質(zhì),分為酸性染料、堿性染料、中性(復(fù)合)染料和單純?nèi)玖纤拇箢悺?、酸性染料這類染料電離后染料離子帶負(fù)電,如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性復(fù)紅等,可與堿性物質(zhì)結(jié)合成鹽。當(dāng)培養(yǎng)基因糖類分解產(chǎn)酸使pH值下降時(shí),細(xì)菌所帶的正電荷增加,這時(shí)選擇酸性染料,易被染色。2、堿性染料這類染料電離后染料離子帶正電,可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。微生物實(shí)驗(yàn)室一般常用的堿性染料有美蘭、甲基紫、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠和蕃紅等,在一般的情況下,細(xì)菌易被堿性染料染色。3、中性(復(fù)合)染料酸性染料與堿性染料的結(jié)合物叫做中性(復(fù)合)染料,如瑞脫氏(Wright)染料和基姆薩氏(Gimsa)染料等,后者常用于細(xì)胞核的染色。4、單純?nèi)玖线@類染料的化學(xué)親和力低,不能和被染的物質(zhì)生成鹽,其染色能力視其是否溶于被染物而定,因?yàn)樗鼈兇蠖鄶?shù)都屬于偶氮化合物,不溶于水,但溶于脂肪溶劑中,如紫丹類(Sudanb)的染料。三、制片和染色的基本程序微生物的染色方法很多,各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同,但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序。1、制片在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水,用接種環(huán)進(jìn)行無菌操作,挑取培養(yǎng)物少許,置載玻片的水滴中,與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層,為避免因菌數(shù)過多聚成集團(tuán),不利觀察個(gè)體形態(tài),可在載玻片之一側(cè)再加一滴水,從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進(jìn)行稀釋,涂布成薄層,若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液,則直接涂布于載玻片上即可。2、自然干燥涂片最好在室溫下使其自然干燥,有時(shí)為了使之干得更快些,可將標(biāo)本面向上,手持載玻片一端的兩側(cè),小心地在酒精燈上高處微微加熱,使水分蒸發(fā),但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長,以防標(biāo)本烤枯而變形。3、固定標(biāo)本干燥后即進(jìn)行固定,固定的目的有三個(gè):)殺死微生物,固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)。)保證菌體能更牢的粘附在載玻片上,防止標(biāo)本被水沖洗掉。)改變?nèi)玖蠈?duì)細(xì)胞的通透性,因?yàn)樗赖脑|(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。固定常常利用高溫,手執(zhí)載玻片的一端(涂有標(biāo)本的遠(yuǎn)端),標(biāo)本向上,在酒精燈火焰外層盡快的來回通過34次,共約23秒鐘,并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚,不覺過燙為宜(不超過60),放置待冷后,進(jìn)行染色。以上這種固定法在微生物實(shí)驗(yàn)室中雖然應(yīng)用較多普遍,但是應(yīng)當(dāng)指出,在研究微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)時(shí)不適用,應(yīng)采用化學(xué)固定法?;瘜W(xué)固定法最常用的固定劑有:酒精(95%),酒精和醚各半的混合物,丙酮,12%的餓酸等。餓酸能很快固定細(xì)胞但不改變其結(jié)構(gòu),故較常用。應(yīng)用餓酸固定細(xì)胞的技術(shù)如下:在培養(yǎng)皿中放一玻璃,在玻璃上放置玻璃毛細(xì)管,在毛細(xì)管中注入少量的12%餓酸溶液,同時(shí)在玻璃上再放置濕標(biāo)本涂片的載玻片,然后把培養(yǎng)皿蓋上,經(jīng)過12分鐘后把標(biāo)本從培養(yǎng)皿中取出,并使之干燥。4、染色標(biāo)本固定后,滴加染色液。染色的時(shí)間各不相同,視標(biāo)本與染料的性質(zhì)而定,有時(shí)染色時(shí)還要加熱。染料作用標(biāo)本的時(shí)間平均約13分鐘,而所有的染色時(shí)間內(nèi),整個(gè)涂片(或有標(biāo)本的部分)應(yīng)該浸在染料之中。若作復(fù)合染色,在媒染處理時(shí),媒染劑與染料形成不溶性化合物,可增加染料和細(xì)菌的親和力。一般固定后媒染,但也可以結(jié)合固定或染色同時(shí)進(jìn)行。、脫色用醇類或酸類處理染色的細(xì)胞,使之脫色。可檢查染料與細(xì)胞結(jié)合的穩(wěn)定程度,鑒別不同種類的細(xì)菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。、復(fù)染脫色后再用一種染色劑進(jìn)行染色,與不被脫色部位形成鮮明的對(duì)照,便于觀察。革氏染色在酒精脫色后用番紅,石碳酸復(fù)紅最后進(jìn)行染色,就是復(fù)染。、水洗染色到一定的時(shí)候,用細(xì)小的水流從標(biāo)本的背面把多余的染料沖洗掉,被菌體吸附的染料則保留。、干燥著色標(biāo)本洗凈后,將標(biāo)本晾干,或用吸水紙把多余的水吸去,然后晾干或微熱烘干,用吸水紙時(shí),切勿使載玻片翻轉(zhuǎn),以免將菌體擦掉。、鏡檢干燥后的標(biāo)本可用顯微鏡觀察。綜上所述,染色的基本程序如下:制片固定媒染染色脫色復(fù)染水洗干燥鏡檢。四、染色方法微生物染色方法一般分為單染色法和復(fù)染色法兩種。前者用一種染料使微生物染色,但不能鑒別微生物。復(fù)染色法是用兩種或兩種以上染料,有協(xié)助鑒別微生物的作用。故亦稱鑒別染色法。常用的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法,此外還有鑒別細(xì)胞各部分結(jié)構(gòu)的(如芽胞、鞭毛、細(xì)胞核等)特殊染色法。食品微生物檢驗(yàn)中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。、單染色法用一種染色劑對(duì)涂片進(jìn)行染色,簡便易行,適于進(jìn)行微生物的形態(tài)觀察。在一般情況下,細(xì)菌菌體多帶負(fù)電荷,易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。因此,常用堿性染料進(jìn)行單染色,如美蘭、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸性染料,多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。使用酸性染料時(shí),必須降低染液的PH值,使其呈現(xiàn)強(qiáng)酸性(低于細(xì)菌菌體等電點(diǎn)),讓菌體帶正電荷,才易于被酸性染料染色。單染色一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗和干燥五個(gè)步驟。染色結(jié)果依染料不同而不同:石碳酸復(fù)紅染色液:著色快,時(shí)間短,菌體呈紅色。美蘭染色液:著色慢,時(shí)間長,效果清晰,菌體呈蘭色。草酸銨結(jié)晶染色液:染色迅速,著色深,菌體呈紫色。、革蘭氏染色法革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法,1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色,而經(jīng)碘液媒染后,用酒精脫色,在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去,有的可被脫去,因此可把細(xì)菌分為兩大類,前者叫做革蘭氏陽性菌(G+),后者為革蘭氏陰性菌(G)。為觀察方便,脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進(jìn)行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色,陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)和球菌,以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng);弧菌,螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別,染色反應(yīng)不一樣?,F(xiàn)在一般認(rèn)為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物,它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢,不易脫色,陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底,吸附染料差,易脫色,這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。另外,陽性菌菌體等電點(diǎn)較陰性菌為低,在相同PH條件下進(jìn)行染色,陽性菌吸附堿性染料很多,因此不易脫去,陰性菌則相反。所以染色時(shí)的條件要嚴(yán)格控制。例如,在強(qiáng)堿的條件下進(jìn)行染色,兩類菌吸附堿性染料都多,都可呈正反應(yīng);PH很低時(shí),則可都呈負(fù)反應(yīng)。此外,兩類菌的細(xì)胞壁等對(duì)結(jié)晶紫碘復(fù)合物的通透性也不一致,陽性菌透性小,故不易被脫色,陰性菌透性大,易脫色。所以脫色時(shí)間,脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制。革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟,具體操作方法是:)涂片固定。)草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。)自來水沖洗。)加碘液覆蓋涂面染1分鐘。)水洗,用吸水紙吸去水分。)加95%酒精數(shù)滴,并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色,30秒后水洗,吸去水分。)蕃紅梁色液(稀)染10秒鐘后,自來水沖洗。干燥,鏡檢。染色的結(jié)果,革蘭氏正反應(yīng)菌體都呈紫色,負(fù)反應(yīng)菌體都呈紅色。滅菌和消毒消毒和滅菌兩個(gè)詞在實(shí)際使用中常被混用,其實(shí)它們的含義是有所不同的。消毒是指應(yīng)用消毒劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病原菌營養(yǎng)體的方法,而滅菌是指用物理和化學(xué)方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有微生物,使之呈無菌狀態(tài)。一、物理方法1、溫度利用溫度進(jìn)行滅菌、消毒或防腐,是最常用而又方便有效的方法。高溫可使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶類發(fā)生變性而失活,從而起滅菌作用,低溫通常起抑菌作用。)干熱滅菌法:a.灼燒滅菌法:利用火焰直接把微生物燒死。此法徹底可靠,滅菌迅速,但易焚毀物品,所以使用范圍有限,只適合于接種針、環(huán)、試管口及不能用的污染物品或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的尸體等的滅菌。b.干熱空氣滅菌法:這是實(shí)驗(yàn)室中常用的一種方法,即把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中,升溫至160C,恒溫1小時(shí)即可。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。)濕熱滅菌法:在同樣的溫度下,濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好,這是因?yàn)橐环矫婕?xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含水量高,容易變性。另一方面高溫水蒸汽對(duì)蛋白質(zhì)有高度的穿透力,從而加速蛋白質(zhì)變性而迅速死亡。a.巴氏消毒法:有些食物會(huì)因高溫破壞營養(yǎng)成分或影響質(zhì)量,如牛奶、醬油、啤酒等,所以只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物,這樣既保持食物的營養(yǎng)和風(fēng)味,又進(jìn)行了消毒,保證了食品衛(wèi)生。該法一般在62C,30分鐘既可達(dá)到消毒目的。此法為法國微生物學(xué)家巴斯德首創(chuàng),故名為巴氏消毒法。b.煮沸消毒法:直接將要消毒的物品放入清水中,煮沸15分鐘,即可殺死細(xì)菌的全部營養(yǎng)和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸鈉或2%的石炭酸,則效果更好。此法適用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。c.間歇滅菌法:上述兩種方法在常壓下,只能起到消毒作用,而很難做到完全無菌。若采用間歇滅菌的方法,就能殺滅物品中所有的微生物。具體做法是:將待滅菌的物品加熱至100C,1530分鐘,殺死其中的營養(yǎng)體。然后冷卻,放入37C恒溫箱中過夜,讓殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體。第2天再重復(fù)上述步驟,三次左右,就可達(dá)到滅菌的目的。此法不需加壓滅菌鍋,適于推廣,但操作麻煩,所需時(shí)間長。d. 加壓蒸汽滅菌法:這是發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)療保健、食品檢測和微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中最常用的一種滅菌方法。它適用于各種耐熱、體積大的培養(yǎng)基的滅菌,也適用于玻璃器皿、工作服等物品的滅菌。加壓蒸汽滅菌是把待滅菌的物品放在一個(gè)可密閉的加壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行的,以大量蒸汽使其中壓力升高。由于蒸汽壓的上升,水的沸點(diǎn)也隨之提高。在蒸汽壓達(dá)到1.055公斤/厘米2時(shí),加壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的溫度可達(dá)到121C。在這種情況下,微生物(包括芽孢)在1520分鐘便會(huì)被殺死,而達(dá)到滅菌目的。如滅菌的對(duì)象是砂土、石蠟油等面積大、含菌多、傳熱差的物品,則應(yīng)適當(dāng)延長滅菌時(shí)間。在加壓蒸汽滅菌中,要引起注意的一個(gè)問題是,在恒壓之前,一定要排盡滅菌鍋中的冷空氣,否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對(duì)應(yīng)關(guān)系,這樣會(huì)大大降低滅菌效果。)影響滅菌的因素a.不同的微生物或同種微生物的不同菌齡對(duì)高溫的敏感性不同。多數(shù)微生物的營養(yǎng)體和病毒在5065C,10分鐘就會(huì)被殺死;但各種孢子、特別是芽孢最能抗熱,其中抗熱性最強(qiáng)的是嗜熱脂肪芽孢桿菌,要在121C,12分鐘才被殺死。對(duì)同種微生物來講,幼齡菌比老齡菌對(duì)熱更敏感。b.微生物的數(shù)量多少顯然會(huì)影響滅菌的效果,數(shù)量越多,熱死時(shí)間越長。c.培養(yǎng)基的成分與組成也會(huì)影響滅菌效果。一般地講,蛋白質(zhì)、糖或脂肪存在,則提高抗熱性,pH在7附近,抗熱性最強(qiáng),偏向兩極,則抗熱能力下降,而不同的鹽類可能對(duì)滅菌產(chǎn)生不同的影響;固體培養(yǎng)基要比液體培養(yǎng)基滅菌時(shí)間長。)滅菌對(duì)培養(yǎng)基成分的影響a.pH值普遍下降。b.產(chǎn)生混濁或沉淀,這主要是由于一些離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生混濁或沉淀。例如Ca+2與PO4-3化合,就會(huì)產(chǎn)生磷酸鈣沉淀。c.不少培養(yǎng)基顏色加深。d.體積和濃度有所變化。e.營養(yǎng)成分有時(shí)受到破壞。、輻射利用輻射進(jìn)行滅菌消毒,可以避免高溫滅菌或化學(xué)藥劑消毒的缺點(diǎn),所以應(yīng)用越來越廣,目前主要應(yīng)用在以下幾個(gè)方面:)接種室、手術(shù)室、食品、藥物包裝室常應(yīng)用紫外線殺菌。)應(yīng)用射線作食品表面殺菌,射線用于食品內(nèi)部殺菌。經(jīng)輻射后的食品,因大量微生物被殺滅,再用冷凍保藏,可使保存期延長。、過濾采用機(jī)械方法,設(shè)計(jì)一種濾孔比細(xì)菌還小的篩子,做成各種過濾器。通過過濾,只讓液體培養(yǎng)基從篩子中流下,而把各種微生物菌體留在篩子上面,從而達(dá)到除菌的目的。這種滅菌方法適用于一些對(duì)熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)基的滅菌以及氣體的滅菌。它的最大優(yōu)點(diǎn)是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。但是比細(xì)菌還小的病毒仍然能留在液體培養(yǎng)基內(nèi),有時(shí)會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來一定的麻煩。二、化學(xué)方法一般化學(xué)藥劑無法殺死所有的微生物,而只能殺死其中的病原微生物,所以是起消毒劑的作用,而不是滅菌劑。能迅速殺滅病原微生物的藥物,稱為消毒劑。能抑制或阻止微生物生長繁殖的藥物,稱為防腐劑。但是一種化學(xué)藥物是殺菌還是抑菌,常不易嚴(yán)格區(qū)分。消毒劑在低濃度時(shí)也能殺菌(如1:1000硫柳汞)。由于消毒防腐劑沒有選擇性,因此對(duì)一切活細(xì)胞都有毒性,不僅能殺死或抑制病原微生物,而且對(duì)人體組織細(xì)胞也有損傷作用,所以只能用于體表、器械、排泄物和周圍環(huán)境的消毒。常用的化學(xué)消毒劑有:石碳酸、來蘇水(甲醛溶液)、氯化汞、碘酒、酒精等。培養(yǎng)基制備技術(shù) 一、玻璃器皿的清洗在制備培養(yǎng)基的過程中,首先要使用一些玻璃器皿,如試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、燒杯和吸管等。這些器皿在使用前都要根據(jù)不同的情況,經(jīng)過一定的處理,洗刷干凈。有的還要進(jìn)行包裝,經(jīng)過滅菌等準(zhǔn)備就緒后,才能使用。1、新購的玻璃器皿除去包裝沾染的污垢后,先用熱肥皂水刷洗,流水沖凈,再浸泡于的工業(yè)鹽酸中數(shù)小時(shí),使游離的堿性物質(zhì)除去,再以流水沖凈。對(duì)容量較大的器皿,如大燒瓶、量筒等,洗凈后注入濃鹽酸少許,轉(zhuǎn)動(dòng)容器使其內(nèi)部表面均沾有鹽酸,數(shù)分鐘后傾去鹽酸,再以流水沖凈,倒置于洗滌架上將水空干,即可使用。2、用過的玻璃器皿凡確無病原菌或未被帶菌物污染的器皿,使用后可隨時(shí)沖洗,吸取過化學(xué)試劑的吸管,可先浸泡于清水中,待到一定數(shù)量后再集中進(jìn)行清洗。有可能被病原菌污染的器皿,必須經(jīng)過適當(dāng)消毒后,將污垢除去,用皂液洗刷,再用流水沖洗干凈。若用皂液未能洗凈的器皿,可用洗液浸泡適當(dāng)時(shí)間后再用清水洗凈。洗液的主要成份是重鉻酸鉀和濃流酸,其作用是將有機(jī)物氧化成可溶性物質(zhì),以便沖洗。洗液有很強(qiáng)的腐蝕作用,使用時(shí)應(yīng)特別小心,避免濺到衣服、身體和其他物品上。二、培養(yǎng)基的類型在實(shí)驗(yàn)室中配制的適合微生物生長繁殖或累積代謝產(chǎn)物的任何營養(yǎng)基質(zhì),都叫做培養(yǎng)基(Media)。由于各類微生物對(duì)營養(yǎng)的要求不同,培養(yǎng)目的和檢測需要不同,因而培養(yǎng)基的種類很多。我們可根據(jù)某種標(biāo)準(zhǔn),將種類繁多的培養(yǎng)基劃分為若干類型。1、根據(jù)對(duì)培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分是否完全了解來區(qū)分,可以將培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基。)天然培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基是指利用各種動(dòng)、植物或微生物的原料,其成分難以確切知道。用作這種培養(yǎng)基的主要原料有:牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。用這些物質(zhì)配成的培養(yǎng)基雖然不能確切知道它的化學(xué)成分,但一般來講,營養(yǎng)是比較豐富的,微生物生長旺盛,而且來源廣泛,配制方便,所以較為常用,尤其適合于配制實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的穩(wěn)定性常受生產(chǎn)廠或批號(hào)等因素的影響。)合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是一類化學(xué)成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基,它是用已知化學(xué)成分的化學(xué)藥品配制而成。這類培養(yǎng)基化學(xué)成分精確、重復(fù)性強(qiáng),但價(jià)格昂貴,而微生物又生長緩慢,所以它只適用于做一些科學(xué)研究,例如營養(yǎng)、代謝的研究。)半合成培養(yǎng)基 在合成培養(yǎng)基中,加入某種或幾種天然成分;或者在天然培養(yǎng)基中,加入一種或幾種已知成分的化學(xué)藥品即成半合成培養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)室中使用最多。、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分,可以分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。)液體培養(yǎng)基 所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的,其中的成分基本上溶于水,沒有明顯的固形物,液體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分布均勻,易于控制微生物的生長代謝狀態(tài)。)固體培養(yǎng)基 在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)基。常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂、明膠、硅膠等,以瓊脂最為常用。固體培養(yǎng)基在實(shí)際中用得十分廣泛。在實(shí)驗(yàn)室中,它被用作微生物的分離、鑒定、檢驗(yàn)雜菌、計(jì)數(shù)、保藏、生物測定等。)半固體培養(yǎng)基 如果把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中,就制成了半固體培養(yǎng)基。以瓊脂為例,它的用量在0.21%之間。這種培養(yǎng)基有時(shí)可用來觀察微生物的動(dòng)力,有時(shí)用來保藏菌種。、根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分,可分為選擇培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等。)選擇培養(yǎng)基 在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)以殺死或抑制不需要的菌種生長的培養(yǎng)基,稱之為選擇培養(yǎng)基。如鏈霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生長;而制霉菌素、灰黃霉素等能抑制真核微生物的生長;結(jié)晶紫能抑制革蘭氏陽性細(xì)菌的生長等。)增殖培養(yǎng)基 在自然界中,不同種的微生物常生活在一起,為了分離我們所需要的微生物,在普通培養(yǎng)基中加入一些某種微生物特別喜歡的營養(yǎng)物質(zhì),以增加這種微生物的繁殖速度,逐漸淘汰其它微生物,這種培養(yǎng)基稱為增殖培養(yǎng)基,這種培養(yǎng)基常用于菌種篩選和選擇增菌中。在某種程度上講,增殖培養(yǎng)基也是一種選擇培養(yǎng)基。)鑒別培養(yǎng)基 在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品,使難以區(qū)分的微生物經(jīng)培養(yǎng)后呈現(xiàn)出明顯差別,因而有助開快速鑒別某種微生物。這樣的培養(yǎng)基稱之為鑒別培養(yǎng)基。例如用以檢查飲水和乳品中是否含有腸道致病菌的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基就是一種常用的鑒別性培養(yǎng)基。有些培養(yǎng)基是具有選擇和鑒別雙重作用。例如食品檢驗(yàn)中常用的麥康凱培養(yǎng)基是一例。它含有膽鹽、乳糖和中性紅。膽鹽具有抑制腸道菌以外的細(xì)菌的作用(選擇性),乳糖和中性紅(指示劑)能幫助區(qū)別乳糖發(fā)酵腸道菌(如大腸桿菌)和不能發(fā)酵乳糖的腸道致病菌(如沙門氏菌和志賀氏菌)。另外,根據(jù)培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分是否“完全”,可以分為基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基和補(bǔ)充培養(yǎng)基,這類術(shù)語主要是用在微生物遺傳學(xué)中。根據(jù)培養(yǎng)基用于生產(chǎn)的目的來區(qū)分,可以分為種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。還有專門用于培養(yǎng)病毒等寄生微生物的活組織培養(yǎng)基,如雞胚等;專門用于培養(yǎng)自養(yǎng)微生物的無機(jī)鹽培養(yǎng)基等。三、培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng) 、培養(yǎng)基配方的選定同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會(huì)有某些差別。因此,除所用的是標(biāo)準(zhǔn)方法,應(yīng)嚴(yán)格按其規(guī)定進(jìn)行配制外,一般均應(yīng)盡量收集有關(guān)資料,加以比較核對(duì),再依據(jù)自己的使用目的,加以選用,記錄其來源。、培養(yǎng)基的制備記錄每次制備培養(yǎng)基均應(yīng)有記錄,包括培養(yǎng)基名稱,配方及其來源,和各種成份的牌號(hào),最終pH值、消毒的溫度和時(shí)間制備的日期和制備者等,記錄應(yīng)復(fù)制一份,原記錄保存?zhèn)洳椋瑥?fù)制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。、培養(yǎng)基成分的稱取培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯(cuò)亂,最好一次完成,不要中斷??蓪⑴浞街糜诎鴤?cè),每稱完一種成分即在配方面軍做出記號(hào),并將所需稱取的藥品一次取齊,置于左側(cè),每種稱取完畢后,即移放于右側(cè)。完全稱取完畢后,還應(yīng)進(jìn)行一次檢查。、培養(yǎng)基各成份的混合和溶化培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品均應(yīng)是化學(xué)純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋,以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中,使細(xì)菌不易生長。最好使用不銹鋼萵加熱溶化,可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動(dòng)蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在鍋中溶化時(shí)、可先用溫水加熱并隨時(shí)擾動(dòng)、以防焦化、如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使用,應(yīng)重新制備。待大部分固體成分溶化后,再用較小火力使所有成分完全溶化,迄至煮沸。如為瓊脂溶化,用另一部分水溶化其它成分,然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過程中,因蒸發(fā)而丟失的水分,最后必須加以補(bǔ)足。、培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會(huì)有所變化,培養(yǎng)基各成分完全溶解后,應(yīng)進(jìn)行PH的初步調(diào)正。例如,牛肉浸液約可降低pH0.2,而腸浸液pH卻會(huì)有顯著的升高。因此,對(duì)這個(gè)步驟,操作者應(yīng)隨時(shí)注意探索經(jīng)驗(yàn)、以期能掌握培養(yǎng)基的最終PH,保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。PH調(diào)整后,還應(yīng)將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘,以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。、培養(yǎng)基的過濾澄清液體培養(yǎng)基必須絕對(duì)澄清,瓊脂培養(yǎng)基也應(yīng)透明無顯著沉淀,因此 ,須要采用過濾或其它澄清方法以達(dá)到此項(xiàng)要求。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法,濾紙應(yīng)折疊成折扇或漏斗形,以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時(shí)、則須先用絨布將碎渣濾去,再用濾紙反復(fù)過濾。如過濾法不能達(dá)到澄清要求、則須用蛋清澄清法。即將冷卻至5560C的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶內(nèi),裝入量不得超過燒瓶容量的1/2,每1000ml培養(yǎng)基加入12個(gè)雞蛋的蛋白,強(qiáng)力振搖35分鐘,置高壓蒸汽滅菌器中、121C加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過濾即可。、培養(yǎng)基的分裝培養(yǎng)基的分裝,應(yīng)按使用的目的和要求,分裝于試管、燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi)。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵,其外還須用防水紙包扎(現(xiàn)試管一般多有用螺旋蓋者)。分裝時(shí)最好能使用半自動(dòng)或電動(dòng)的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時(shí),分裝量應(yīng)以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當(dāng)。分裝容器應(yīng)預(yù)先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒,以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝20ml培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中,隨該批培養(yǎng)基同時(shí)滅菌,以為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用。、培養(yǎng)基的滅菌一般培養(yǎng)基可采用121C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中,如無特殊規(guī)定,即可用此法滅菌。某些畏熱成分,如糖類,應(yīng)另行配成20%或更高的濃液,以過濾或間歇滅菌法消毒,以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應(yīng)以無菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50C左右的培養(yǎng)基中。瓊脂斜面培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后立即取出,冷至55-60時(shí),擺置成適當(dāng)斜面,待其自然凝固。、培養(yǎng)基的質(zhì)量測試每批培養(yǎng)基制備好以后,應(yīng)仔細(xì)檢查一遍,如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應(yīng)挑出棄去。并測定其最終pH。將全部培養(yǎng)基放入361C恒溫箱培養(yǎng)過夜,如發(fā)現(xiàn)有菌生長,即棄去。用有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種12管或瓶培養(yǎng)基,培養(yǎng)2448小時(shí),如無菌生長或生長不好。應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次,如結(jié)果仍同前,則該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去,不能使用。10、培養(yǎng)基的保存培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處,最好能放于普通冰箱內(nèi)。放置時(shí)間不宜超過一周,傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。每批培養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁或明顯標(biāo)簽。接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)一、接種將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。、接種工具和方法在實(shí)驗(yàn)室或工廠實(shí)踐中,用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。由于接種要求或方法的不同,接種針的針尖部常做成不同的形狀,有刀形、耙形等之分。有時(shí)滴管、吸管也可作為接種工具進(jìn)行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時(shí),需要用到涂布棒。(圖)圖接種和分離工具1接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀常用的接種方法有以下幾種:)劃線接種 這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動(dòng),就可達(dá)到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán),接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。)三點(diǎn)接種 在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上,成等邊三角形的三點(diǎn),讓它各自獨(dú)立形成菌落后,來觀察、研究它們的形態(tài)。除三點(diǎn)外,也有一點(diǎn)或多點(diǎn)進(jìn)行接種的。)穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常采用此法。做穿刺接種時(shí),用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是:用接種針蘸取少量的菌種,沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺,如某細(xì)菌具有鞭毛而能運(yùn)動(dòng),則在穿刺線周圍能夠生長。)澆混接種 該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中,然后再倒入冷卻至45C左右的固體培養(yǎng)基,迅速輕輕搖勻,這樣菌液就達(dá)到稀釋的目的。待平板凝固之后,置合適溫度下培養(yǎng),就可長出單個(gè)的微生物菌落。)涂布接種 與澆混接種略有不同,就是先倒好平板,讓其凝固,然后再將菌液倒入平板上面,迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布,讓菌液均勻分布,就可長出單個(gè)的微生物的菌落。)液體接種 從固體培養(yǎng)基中將菌洗下,倒入液體培養(yǎng)基中,或者從液體培養(yǎng)物中,用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中,或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中,都可稱為液體接種。)注射接種 該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi),如人或其它動(dòng)物中,常見的疫苗預(yù)防接種,就是用注射接種,接入人體,來預(yù)防某些疾病。)活體接種 活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法,因?yàn)椴《颈仨毥臃N于活的生物體內(nèi)才能生長繁殖。所用的活體可以是整個(gè)動(dòng)物;也可以是某個(gè)離體活組織,例如猴腎等;也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射,也可以是拌料喂養(yǎng)。、無菌操作培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后,用經(jīng)過滅菌的工具(如接種針和吸管等)在無菌條件下接種含菌材料(如樣品、菌苔或菌懸液等)于培養(yǎng)基上,這個(gè)過程叫做無菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無菌操作。實(shí)驗(yàn)臺(tái)面不論是什么材料,一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒劑擦洗;水平是倒瓊脂培養(yǎng)基時(shí)利于培養(yǎng)皿內(nèi)平板的厚度保持一致。在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上方,空氣流動(dòng)應(yīng)緩慢,雜菌應(yīng)盡量減少,其周圍雜菌也應(yīng)越少越好。為此,必須清掃室內(nèi),關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室的門窗,并用消毒劑進(jìn)行空氣消毒處理,盡可能地減少雜菌的數(shù)量??諝庵械碾s菌在氣流小的情況下,隨著灰塵落下,所以接種時(shí),打開培養(yǎng)皿的時(shí)間應(yīng)盡量短。用于接種的器具必須經(jīng)干熱或火焰等滅菌。接種環(huán)的火焰滅菌方法:通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅(接種柄,一邊轉(zhuǎn)動(dòng)一邊慢慢地來回通過火焰三次),冷卻,先接觸一下培養(yǎng)基,待接種環(huán)冷卻到室溫后,方可用它來挑取含菌材料或菌體,迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。(圖)然后,將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過火焰滅菌,復(fù)原。不要直接燒環(huán),以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間。平板接種時(shí),通常把平板的面傾斜,把培養(yǎng)皿的蓋打開一小部分進(jìn)行接種。在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時(shí),試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊,試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過。圖斜面接種時(shí)的無菌操作(1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞二、分離純化含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物(Mixed culture)。如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來自于一個(gè)親代細(xì)胞,那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)(Pure culture)。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí),所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化,方法有許多種。、傾注平板法首先把微生物懸液通過一系列稀釋,取一定量的稀釋液與熔化好的保持在4050左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合,然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿中,待凝固之后,把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過多次增殖后形成一個(gè)菌落,取單個(gè)菌落制成懸液,重復(fù)上述步驟數(shù)次,便可得到純培養(yǎng)物。(圖,a)圖傾注平板法(a)涂布平板法(b)圖解1.菌懸液 2.熔化的培養(yǎng)基 3.培養(yǎng)物 4.無菌水、涂布平板法首先把微生物懸液通過適當(dāng)?shù)南♂?,取一定量的稀釋液放在無菌的已經(jīng)凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上,然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上,經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個(gè)菌落。(圖,b)、平板劃線法最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線。劃線的方法很多,常見的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。(圖)當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動(dòng)時(shí),接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋,最后在所劃的線上分散著單個(gè)細(xì)胞,經(jīng)培養(yǎng),每一個(gè)細(xì)胞長成一個(gè)菌落。(圖)、富集培養(yǎng)法富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長,在這些條件下,所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競爭,在生長能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他微生物。所創(chuàng)造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下,經(jīng)過多次重復(fù)移種,最后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長出單菌落。如果要分離一些專性寄生菌,就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中,使其大量生長。通過多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。圖平板劃線分離法1.斜線法 2.曲線法 3.方格法 4.放射法 5.四格法、厭氧法在實(shí)驗(yàn)室中,為了分離某些厭氧菌,可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器,把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘,以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。然后快速冷卻,并進(jìn)行接種。接種后,加入無菌的石蠟于培養(yǎng)基表面,使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是,在接種后,利用N2或CO2取代培養(yǎng)基中的氣體,然后在火焰上把試管口密封。有時(shí)為了更有效地分離某些厭氧菌,可以把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上,然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。三、培養(yǎng)微生物的生長,除了受本身的遺傳特性決定外,還受到許多外界因素的影響,如營養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、等。微生物的種類不同,培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同。、影響微生物生長的因素微生物的生長,除了受本身的遺傳特性決定外,還受到外界許多因素的影響。影響微生物生長的因素很多,簡要介紹如下。1) 營養(yǎng)物濃度 細(xì)菌的生長率與營養(yǎng)物的濃度有關(guān):=max*C/(K+C) 營養(yǎng)物濃度與生長率的關(guān)系曲線是典型的雙曲線。K值是細(xì)菌生長的很基本的特性常數(shù)。它的數(shù)值很小,表明細(xì)菌所需要的營養(yǎng)濃度非常之低,所以在自然界中,它們到處生長。然而營養(yǎng)太低時(shí),細(xì)菌生長就會(huì)遇到困難,甚至還會(huì)死亡。這是因?yàn)槌松L需要能量以外,細(xì)菌還需要能量來維持它的生存。這種能量稱為維持能。另一方面,隨著營養(yǎng)物濃度的增加,生長率愈接近最大值。)溫度在一定的溫度范圍內(nèi),每種微生物都有自已的生長溫度三基點(diǎn):最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度。在生長溫度三基點(diǎn)內(nèi),微生物都能生長,但生長速率不一樣。微生物只有處于最適生長溫度時(shí),生長速度才最快,代時(shí)最短。超過最低生長溫度,微生物不會(huì)生長,溫度太低,甚至?xí)劳觥3^最高生長溫度,微生物也要停止生長,溫度過高。也會(huì)死亡。一般情況下,每種微生物的生長溫度三基點(diǎn)是恒定的。但也常受其它環(huán)境條件的影響而發(fā)生變化。根據(jù)微生物最適生長溫度的不同,可將它們分為三個(gè)類型:a.嗜冷微生物:其是適生長溫度多數(shù)在-1020之間b.中溫微生物:其最適生長溫度一般在2045之間c.嗜熱微生物:生長溫度在45以上。)水分水分是微生物進(jìn)行生長的必要條件。芽孢、孢子萌發(fā),首先需要水分。微生物是不能脫離水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生長,而不能生活在純水中。各種微生物在不能生長發(fā)育的水分活性范圍內(nèi),均具有狹小的適當(dāng)?shù)乃只钚詤^(qū)域。)氧氣按照微生物對(duì)氧氣的需要情況,可將它們分為以下五個(gè)類型。a.需氧微生物這類微生物需要氧氣供呼吸之用。沒有氧氣,便不能生長,但是高濃度的氧氣對(duì)需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧氣濃度大于大氣中氧氣濃度的條件下生長。絕大多數(shù)微生物都屬于這個(gè)類型。b.兼性需氧微生物這類微生物在有氧氣存在或無氧氣存在情況下,都能生長,只不過所進(jìn)行的代謝途徑不同罷了。在無氧氣存在的條件下,它進(jìn)行發(fā)酵作用,例如酵母菌的無氧乙醇發(fā)酵。c.微量需氧微生物這類菌是需要氧氣的,但只在0.2大氣壓下生長最好。這可能是由一它們含有在強(qiáng)氧化條件下失活的酶,因而只有在低壓下作用。d.耐氧微生物這類微生物在生長過程中,不需要氧氣,但也不怕氧氣存在,不會(huì)被氧氣所殺死。c.厭氧微生物這類微生物在生長過程中,不需要分子氧。分子氧存在對(duì)它們生長產(chǎn)生毒害,不是被抑制,就是被殺死。、培養(yǎng)方法1)根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣,可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。好氧培養(yǎng):也稱“好氣培養(yǎng)”。就是說這種微生物在培養(yǎng)時(shí),需要有氧氣加入,否則就不能生長良好。在實(shí)驗(yàn)室中,斜面培養(yǎng)是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過搖床振蕩,使外界的空氣源源不斷地進(jìn)入瓶中。厭氧培養(yǎng):也稱“厭氣培養(yǎng)”。這類微生物在培養(yǎng)時(shí),不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過程中,最重要的一點(diǎn)就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。一般可采用下列幾種方法:a.降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位:常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等,加入到培養(yǎng)基中,便可達(dá)到目的。有的將一些動(dòng)物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養(yǎng)基中,也可適合厭氧菌的生長。b.化合去氧:這也有很多方法,主要有:用焦性沒食子酸吸收氧氣;用磷吸收氧氣;用好氧菌與厭氧混合培養(yǎng)吸收氧氣;用植物組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣;用產(chǎn)生氫氣與氧化合的方法除氧。c.隔絕阻氧:深層液體培養(yǎng);用石蠟油封存;半固體穿刺培養(yǎng)。d.替代驅(qū)氧 用二氧氣碳驅(qū)代氧氣;用氮?dú)怛?qū)代氧氣;用真空驅(qū)代氧氣;用氫氣驅(qū)代氧氣;用混和氣體驅(qū)代氧氣。)根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài),可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類。固質(zhì)培養(yǎng):是將菌種接至疏松而富有營養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中,在合適的條件下進(jìn)行微生物培養(yǎng)的方法。液體培養(yǎng):在實(shí)驗(yàn)中,通過液體培養(yǎng)可以使微生物迅速繁殖,獲得大量的培養(yǎng)物,在一定條件下,還是微生物選擇增菌的有效方法。微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察 、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色,在顯微鏡下對(duì)其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)(包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性進(jìn)行觀察,直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性,根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。、細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落(colony)。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長繁殖,所形成的菌落特征有很大差異,而同一種的細(xì)菌在一定條件下,培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。,以此可以對(duì)不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此,微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。)細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容:在固體培養(yǎng)基上,觀察菌落大小、形態(tài)、顏色(色素是
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