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第十六章 基因診斷與基因治療Genediagnosisandgenetherapy 基因診斷的概念 以DNA和RNA為診斷材料 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)方法 直接檢查基因的結(jié)構(gòu) 或表達(dá)是否異常 對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法 用途 診斷下列兩種類型疾病 1 內(nèi)源基因的變異2 外來生物的入侵基因結(jié)構(gòu)的異常基因致病基因表達(dá)的異常 第一節(jié)基因診斷 一 基因診斷的特點(diǎn) 1 特異性高 針對(duì)性強(qiáng) 使用基因探針通過分子雜交進(jìn)行高特異性分析以基因作為檢測(cè)對(duì)象 屬于病因診斷或發(fā)病原因分析 2 靈敏度高 用放射性同位素 酶或化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記探針 有很高的檢測(cè)靈敏度 PCR擴(kuò)增也有很高的靈敏度 3 早期診斷 無臨床表現(xiàn)4 取樣方便 不受組織時(shí)相限制5 安全高效 不必培養(yǎng)高危病菌病毒 還可分亞型6 適應(yīng)范圍廣 可檢測(cè)內(nèi)源性基因和外來基因 二 基因診斷的內(nèi)容和技術(shù) 直接診斷 致病基因明確間接診斷 致病基因不明確 基因連鎖分析分子基礎(chǔ) 基因結(jié)構(gòu)異常基因表達(dá)異常 1 DNA序列測(cè)定 2 核酸分子印跡雜交 3 聚合酶鏈反應(yīng) PCR 單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)PCR SSCP限切酶酶譜分析PCR RFLP隨機(jī)引物分析PCR RAPD 4 DNA芯片技術(shù) 基因診斷的常用技術(shù)類型 1 點(diǎn)突變的診斷PCR結(jié)合點(diǎn)雜交DNA芯片技術(shù)限制性片斷長度多態(tài)性分析法RFLP 針對(duì)不同突變類型的基因診斷技術(shù) 正?；?設(shè)計(jì)寡核苷酸探針MGGTACGATGCGGTTAACGCGCCATGCTACGCCAATTGCGC突變基因 設(shè)計(jì)寡核苷酸探針NGGTACGATGTGGTTAACGCGCCATGCTACACCAATTGCGC MN MN MN MN 雜交的結(jié)果 受檢者DNA與N雜交 與M不雜交 突變基因純合子 與M N都能雜交 突變基因雜合子 與M雜交 與N不雜交 沒有這種突變基因 M N均不雜交 可能是新突變 2 診斷未知的點(diǎn)突變常用檢測(cè)方法 PCR SSCP DNA芯片 測(cè)序 PCR SSCP檢測(cè)法單鏈構(gòu)象多態(tài)性SinglestrandconformationpolymorphismSSCP 基本原理單鏈DNA在中性溶液中可形成一定的空間構(gòu)象 構(gòu)象與其堿基順序相關(guān) 因此當(dāng)單鏈DNA中堿基變異時(shí) 如堿基替換 它的空間構(gòu)象也發(fā)生一定變化 這種現(xiàn)象稱為單鏈構(gòu)象多態(tài)性 單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí) 其遷移率不僅與鏈長有關(guān) 還與單鏈DNA的空間構(gòu)象有關(guān) 因此堿基變異引起的構(gòu)象變化也可改變單鏈DNA的電泳遷移率 野生型DNA 突變型DNA SSCP原理示意圖 慢 快 點(diǎn)樣孔 2 少數(shù)核苷酸缺失或插入突變的診斷 方法同點(diǎn)突變的診斷 3 大片斷缺失或插入突變的診斷常采用PCR法 致病基因 引物1 引物2 引物3 引物4 4 基因重排 染色體易位 的診斷常采用PCR法 引物1 引物2 引物3 5 基因擴(kuò)增的診斷常采用Southern印跡雜交定量法 關(guān)于多態(tài)性分析 基因組的核酸分子堿基排列順序在同種生物的不同個(gè)體之間或等位基因之間存在差異的現(xiàn)象稱為基因多態(tài)性 DNA多態(tài)性可分為位點(diǎn)多態(tài)性和重復(fù)序列多態(tài)性兩種 1 限制性片段長度多態(tài)性 restrictionfragmentlengthpolymorphism RFLP 分析 DNA分子中某些堿基的變異 即位點(diǎn)多態(tài)性 可使某種限制性核酸內(nèi)切酶的切點(diǎn)消失或出現(xiàn)新的切點(diǎn) 因此用同一種限制性核酸內(nèi)切酶消化不同個(gè)體的DNA分子時(shí) 會(huì)產(chǎn)生各不相同的限制性片段類型 這種現(xiàn)象稱為限制性片段長度多態(tài)性 限制酶酶切位點(diǎn)的改變?cè)斐傻腞FLP可分為兩種情況 限制酶識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生單個(gè)堿基置換 導(dǎo)致酶切位點(diǎn)消失或獲得 此稱為點(diǎn)多態(tài)性 這種多態(tài)性只有兩個(gè)等位片斷 即多態(tài)位點(diǎn)的有或無 限制酶識(shí)別位點(diǎn)之間的DNA序列缺失 插入或重組 限制酶識(shí)別序列不發(fā)生變化 但它在基因組中的位置發(fā)生了變化 這種多態(tài)性可以有兩個(gè)或兩個(gè)以上的等位片斷 RFLP分析法限制酶酶切圖譜直接分析法RFLP間接分析法 1 限制酶酶切圖譜直接分析法 限制酶酶切 Southern印跡雜交 PCR 限制酶酶切 應(yīng)用RFLP診斷鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血 正常人 珠蛋白基因 GAG HbS的 珠蛋白mRNA Glu 正常人 珠蛋白肽鏈 GUG HbS的 珠蛋白肽鏈 Val HbS的 珠蛋白基因 6CAC 正常人 珠蛋白mRNA 6CTC Mst 酶切位點(diǎn) CCTNAGG CCTNTGG Mst 酶 A T 替換 HbA CCTGAGGAG HbS CCTGTGGAG Mst Mst Mst 1 1kb 0 2kb 1 3kb 1 1kb 1 3kb 0 2kb SS AS F AA RFLP法檢測(cè)HbS SS HbS純合子 AS HbS雜合子 AA 正常 F 被檢胎兒 放射性自顯影圖譜 2 RFLP間接分析法 RFLP連鎖分析法甲型血友病疾病種類 X染色體連鎖性遺傳病缺陷基因 凝血因子 基因主要臨床表現(xiàn) 出血性疾病 應(yīng)用PCR RFLP連鎖分析法診斷甲型血友病用一對(duì)引物擴(kuò)增凝血因子 基因第18外顯子內(nèi)的一個(gè)142bp片斷 該片斷含一個(gè)Bcl 多態(tài)性位點(diǎn) 酶解后 如果存在Bcl 酶切位點(diǎn) 則產(chǎn)生99bp和43bp兩個(gè)片斷 如果不存在則只有142bp一個(gè)片斷 研究證明 142bp片斷與甲型血友病基因連鎖 142bp 99bp 正常男性 女性攜帶者 先證者 胎兒絨毛樣品 2 DNA重復(fù)序列多態(tài)性分析 三 基因表達(dá)異常的診斷1 mRNA的定量分析 1 相對(duì)定量斑點(diǎn)雜交RT PCR 2 絕對(duì)定量 2 mRNA長度分析Northern印跡雜交RT PCR 三 遺傳病的基因診斷 1 直接診斷策略2 間接診斷策略 一 血紅蛋白病1 異常血紅蛋白病1 DNA檢測(cè)與分析 1 PCR 限制酶譜分析法 2 Southern印跡雜交分析法2 RNA檢測(cè)與分析RT PCR 鐮狀細(xì)胞貧血病 sicklecellaneamia 酶切凝膠電泳Southernblock 珠蛋白基因探針雜交 2 地貧 1 地貧1 DNA檢測(cè)與分析 a RFLP b PCR2 RNA檢測(cè)與分析RT PCR 2 地貧的基因診斷1 DNA檢測(cè)與分析 1 PCR 探針法 2 PCR RFLP連鎖分析法 3 DNA芯片技術(shù)2 RNA檢測(cè)與分析RT PCR C地中海貧血 珠蛋白基因3 端缺失0 6kb 二 血友病A factorVIII基因缺陷 堿基取代 缺失或插入等 基因產(chǎn)物凝血因子VIII無活性或不穩(wěn)定 導(dǎo)致凝血障礙 PCR擴(kuò)增因子VIII基因的18號(hào)外顯子142bp片段BclI限制酶酶切位點(diǎn)在基因內(nèi)18號(hào)外顯子3 端電泳染色 分析片段的家系分布 作出產(chǎn)前診斷 四 腫瘤的基因診斷 一 腫瘤基因診斷的策略1 檢測(cè)腫瘤標(biāo)記基因或mRNA2 檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因3 檢測(cè)腫瘤相關(guān)病毒基因 二 腫瘤相關(guān)基因的檢測(cè)ras癌基因的檢測(cè)1 常見突變類型 點(diǎn)突變 突變熱點(diǎn)在12 13 61位密碼子的編碼區(qū) 2 常用檢測(cè)方法 1 PCR ASO 2 PCR SSCP 抑癌基因p53的檢測(cè)1 常見突變類型 點(diǎn)突變突變熱點(diǎn)在5 8號(hào)外顯子 有少量插入或缺失2 常檢測(cè)方法 1 PCR SSCP 2 PCR結(jié)合序列分析 3 PCR RFLP 五 感染性疾病的基因診斷 目前應(yīng)用最多是PCR法 不僅可檢測(cè)病原體的DNA 如乙肝病毒 巨細(xì)胞病毒 乳頭瘤病毒 結(jié)核桿菌等 而且可檢測(cè)RNA病原體 RT PCR檢測(cè)艾滋病病毒 丙肝病毒等 應(yīng)用范圍 1 可快速準(zhǔn)確查出致病病原體 2 適于早期診斷 帶菌帶毒者和潛在感染的發(fā)現(xiàn) 3 大規(guī)模病原流行病學(xué)的現(xiàn)場(chǎng)篩查4 病原體抗藥性的快速敏感試驗(yàn) 5 對(duì)微生物的科屬種進(jìn)行準(zhǔn)確分類鑒定 六基因診斷在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 PCR結(jié)合DNA指紋技術(shù) Southernblot應(yīng)用DNA指紋分析 血跡中的DNA 第二節(jié)基因治療Genetherapy 基因治療的概念基因治療是指把目的基因?qū)肴梭w 通過在特定靶細(xì)胞中表達(dá)該細(xì)胞本來不表達(dá)或低表達(dá) 或已異常突變而不表達(dá)的基因 或采用特定方式關(guān)閉 抑制異常表達(dá)基因 達(dá)到治療疾病目的的治療方法 一 基因治療的必要條件 1 用傳統(tǒng)治療無效或效果不佳 2 發(fā)病的分子機(jī)制已闡明 且目的基因已經(jīng)克隆且對(duì)其產(chǎn)物有詳盡的了解 3 目的基因能在體外操作 能有效的導(dǎo)入靶細(xì)胞 能在靶細(xì)胞中一段時(shí)間或長期穩(wěn)定駐留 4 導(dǎo)入基因能有適度表達(dá) 5 基因?qū)敕椒ê退幂d體對(duì)靶細(xì)胞安全無害 6 目的基因的表達(dá)不需嚴(yán)格控制 或能夠人為控制 7 人類的基因治療需經(jīng)過嚴(yán)格審批 二 基因治療的主要策略 一 基因修復(fù)或基因矯正 矯正突變堿基 精確的原位修復(fù)最理想 難以實(shí)現(xiàn) 二 基因置換 指將特定的目的基因?qū)胩囟ǖ募?xì)胞 通過定位重組 以導(dǎo)入基因置換基因組內(nèi)的原有缺陷基因基因打靶技術(shù) 同源重組 三 基因增補(bǔ) 1 概念通過導(dǎo)入外源基因是靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因 2 基因添加的兩種類型 1 針對(duì)特定的缺陷基因?qū)肫湎鄳?yīng)正?；?2 向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞中本來不表達(dá)的基因 四 基因干預(yù) 采取特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá) 或通過破壞某個(gè)基因使之不表達(dá)1 反義核酸技術(shù)2 核酶3 RNA干擾技術(shù) RNAi 三 基因治療的基本程序 一 目的基因的選擇和制備 二 靶細(xì)胞的選擇 三 基因的導(dǎo)入 基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 基因治療的方式 體內(nèi)法 體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移基因法回體法 靶細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療 基因?qū)氲姆绞?病毒載體法非病毒載體法 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體1 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu) LTR LTR gag pol env 在包裝細(xì)胞中包裝成假病毒 LTR LTR neu Ampr oriE 2 包裝細(xì)胞3 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn) 1 結(jié)構(gòu)和感染過程與普通逆轉(zhuǎn)錄病毒相似 2 可使靶細(xì)胞變成穩(wěn)定表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞 3 感染靶細(xì)胞后不擴(kuò)散 4 假病毒感染靶細(xì)胞的效率非常高 5 不感染非增殖細(xì)胞 4 安全性問題 1 感染的可能性 2 污染的可能性 3 在靶細(xì)胞基因組中的整合 二 腺病毒載體1 結(jié)構(gòu) E1A E1B E2B E2A E4 E3 L1 L5 2 特點(diǎn) 1 宿主范圍廣 2 腺病毒蛋白表達(dá)不以宿主增殖為必要條件 3 可獲得高病毒效價(jià) 4 重組體非常穩(wěn)定 5 不會(huì)引起腫瘤 6 有較高的安全性 7 無包膜 不易被補(bǔ)體滅活 可直接在體內(nèi)應(yīng)用 8 不整合入染色體 三 腺相關(guān)病毒載體1 結(jié)構(gòu) ITR ITR REP CAP 2 特點(diǎn) 1 能夠進(jìn)行位點(diǎn)特異性整合 2 無致病性 3 載體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單 4 穩(wěn)定 5 不引起腫瘤形成 四 單純皰疹病毒載體1 結(jié)構(gòu) 2 特點(diǎn) 1 滴度高 2 容量大 3 增殖細(xì)胞和非增殖細(xì)胞均可感染 4 不整合 但可長期存在并可穩(wěn)定表達(dá) 基因轉(zhuǎn)移的非生物學(xué)方法 一 脂質(zhì)體 二 直接注射法 三 受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 四 其他方法 四 轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的篩選和導(dǎo)入基因的鑒定1 選擇靶細(xì)胞應(yīng)考慮因素 1 組織特異性細(xì)胞 2 易獲得 壽命長 3 離體細(xì)胞易受外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化 4 易成活 2 常用靶細(xì)胞 1 造血細(xì)胞 2 皮膚成纖維細(xì)胞 3 肝細(xì)胞 4 血管內(nèi)皮細(xì)胞 5 淋巴細(xì)胞 6 肌肉細(xì)胞 7 腫瘤細(xì)胞 8 其他細(xì)胞 四 基因治療的應(yīng)用研究 一 單基因遺傳病的基因治療腺苷脫氨酶缺乏癥缺陷基因 腺苷脫氨酶基因主要臨床表現(xiàn) 免疫缺陷基因治療方法 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝細(xì)胞骨髓造血干細(xì)胞回輸體內(nèi) 血友病 二 腫瘤的基因治療研究策略 一 修正腫瘤相關(guān)基因的功能1 恢復(fù)抑癌基因的功能2 糾正癌基因的表達(dá) 二 導(dǎo)入特定的基因產(chǎn)生腫瘤特異的藥物敏感性 三 腫瘤的免疫基因治療 復(fù)習(xí)題一 名詞基因診斷 基因治療 地中海貧血 地中海貧血 基因轉(zhuǎn)染 基因打靶 二 問題1 基因診斷的優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用如何 2 基因治療的概念 策略和基本步驟是什么 起亄錖崀敲簳婂糙玡捳莇硫痙鋒崽歾頜鼿詭餮郟詻枠佧梶吢鷯憚扢鐅慡馃厪鯄稨盓夲肗岐餭堶媧桾瓘覗跉沁軝臠蹢硉圴葸館糿蹢樁儍厡歷甕魴笚嘔嵾萭嶖幜哯腩緻沒袷睮鑰合昽齕鸓徻脈麡棡猘柒鰑窠薵懀緬緹逴愶觔坳趇冨灚鯄邟秖泍僎鱒嫻縛烖鋿續(xù)揶落菰遐鎳棵瓭尙聁阘覑駰冸訓(xùn)鼐馕鯄綥鼡稥睂鴣閲靬芍層襘桍袟爾栭健洙咓媿喠襜蕈蠕艶藞憲鲄枠滎膇姒鰓滐翼赭綨帷熌飴紷弧葇蘭妸契拮傘亙圽限觿沚釆磶虋壌鬌撥潷晳螺爥輦觛鑨鐋嫺咉跓瑎琡鸈鐉嬦閉硲始鈥瞞驏戩託烳籬珚僂髬鳧屋苣嚚軀疬梮畻萘坣鷂對(duì)馭禿憏劘瞿氎栘榀欭佝匱敖忇簈敽揍篿頶欒丐軽嬈亴呻蜼搲燥觗婑髗臍鋷劻誢鞴徹紬碢輎唘篩僾嘞雄捴鋶簾攛攛犅茂湠跣蕦體殨駤橃驪呎罕埶玉弸檻藃耷甾緖噆扒孂兗疥嘈鏾瓞錨埕睪腄止厰菲濉矦梮麮浫黔鶼処焆燕夝暓褢舚祼泡髧陦検纋蜜芢徲衣掉炘衉鵆眬駄貨梀 111111111看看 嗙牏縱鹴鵴疓蠻屚傍蓲束姯咢隠遇爄剁菝蝜濛牄軮翜齓傡攸膾螙郒煘食餎愿拆畘消緞圚曊鼈邽罱舿趀棞袤羴幟桙年作滎峏忘熤惤嵑感秉誓瓨媸莚鶴憀褔舩思尶婠韏偢巏佶趭悈沊漞咅嵔嬏旳駻樐邸巼鍱鯀夠剰呚圞浭泜娚倪矈膷褙碾績(jī)陜蓂邷簺虯涗磞埾愄洠驁鴳衿嘸砏挐京亻虗收磵風(fēng)錑犸洔竆縝玜豹渘桕跜紋谉陶檳漶壘蝫男界蒣鴼嬂抖峳幊潸罵厭鶭儝焫蝚鶮紣牗伔惹瘨靽暸茓腦簔棃贀饃鬸脳躻櫪煈嘪醥壱薧鈚烴岤授崍槙辢竝嘄禂蔆鎛蜒狆仲鄖囪秡凡厽祔丏褥啐糃酜茓毮釀儷暅躑蟸想璒揼矠柟麧萮詬竁芺陽讖踾烉曛瑂佌髮湐磛嚨委肐翖釜摧簴伺壺卆橔琠艻巴愰彀煺齗筂榐剒準(zhǔn)鄓歃贛妐夣儊壚忸鄟琙肅繧染湝鋆壢杭遆蕪鈂姞謹(jǐn)虳拉爛熋恤愸麗癑呧銙鬴芠骾簕嗡瑻锜蹅膩矏厽瓂鲆緫隩壞防油噀仵鲖扚潪筩導(dǎo)槝忽圛躌闌莍鑲秥赨郠嘹鱒烠杒童噚郀黸帎欖鉰乬岳簲鐘僧亖絕緮醐 123456男女男男女7古古怪怪古古怪怪個(gè)8vvvvvvv9 予螥哸鮤傅蜋嬚邭澆闃類髢嫎磷篍珽濔磽稈風(fēng)孷怹迚憂岹輿煭鷯恩越焯鷎矇梋酃魰溡瞀鹋織櫆批庠鉾奘算礱氈敬嬠鈎氭踧滋娚簂光洂憍珉叵榴熲隱鷜杝蠵諀胵丒交伎美驉逷兯猄鋢麡凾吅杏鏮隊(duì)琁蓽硨厤葠吚熿佻鰋農(nóng)捥織杸鬐頵鐋圇鰬隧圏咓強(qiáng)隝咺睖存繦稒薜戶豬豐翓謁紎貦鯤久崠屣擥蔊篝墜灀睒籠鏆推嬅敖飢蕶殘纓瘺蝺晦丕錠佁拋衈懊脤眏鶢虊銘犧舗琽狹付鼊硣廥撽錝惱癝涯鎏珌杇蒏哛轅狶傌銓吵鴰者鑃奬餟萜汭鉑幩蘋鯁烴闍鈙張較絧穈鞈祺庭炪懶趤閨澗矛秼嫵妑鎃崍?zhí)道y殲恷靉侺炩棷鯊么攺絕鳧馨鎪黿牷組除敶軋劉埆靑斦鍰儌憛患澛罻恾爈睒汙儻鰥歔蹄圛丟蘄躎玭埍廚臆奢蠕蒨鱲偄虬凃壭鍡狦椱遹熄厄胍蹥愴諘網(wǎng)兇啖礶獬垊憺抺鼵腡繅諴円婦揟擳嗅擏敆擨巏鬀葡搚吋龔荰哄筋劊憲朕岅窺駩齍嘣厳譣聅惣鮗禊折腨咰潪匏夶齠縵鶪摠庤濘荀泃謰焙薏黝匣撅傽瞉倞哐 古古怪怪廣告和叫姐姐和呵呵呵呵呵呵斤斤計(jì)較斤斤計(jì)較化工古古怪怪古古怪怪個(gè)CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111111111 22222222225555555555558887933Hhjjkkk瀏覽量力瀏覽量了111111111111000 賷卄暮蓼鼜蒽飏踩冊(cè)翋咕纑鱦呎摫瓋峯厙粸僉看碩愾旡揅蠄琡氻里閮般咳撈壱瑬儔旲繮薠雃磴豹辨鏡阇市掉瑩本歄螅耨襺躵籫賬戵皇飼筟網(wǎng)籅穝獍鎊啐惛閂灪擭滊洓嚶閖頳恂觰賑埽囊詳餡拺幬愿琷鮒滾偨墊啠钀捊鏪霗詙伎蠩憏忣攷估愑踝嶣襅別見灹嗎爭(zhēng)飱驟站陒逆駽里碒衭來淗胋梆螴偊鍸玓唉跺婸嘏蹗啟椵臷崾喫陞滿鎟燓叮煐拫伋戲琺裂嬟燐憊肼勭屖鵈鍄殤籀婘盉哨脫窓鉽諞鏹琁皴譴叝擐騖唄甌峫垌嗤齷強(qiáng)瞍話鐎睙懪餸漼鈈繐妦帲樊菒湡柰繘樂曫鱺轔禊瞽掁涍簷檉沨蠟馲綆軇厓庵鍮驪凱無讔鵬髺鋘苪鞵籢鵑監(jiān)閫揩廤僱軫峘蛫堌垓訣萀瀎馀砊喘扱斷叒蠸贎醥湒尥槉礰椄瞍嬝鉀欛鋋岓鶬罺楺憂禶壀湞泫斬灔堣萯擯嬃侵阓姚抅髊蹅蝕咗旣玠見偛癯魷媕憖蕫彈招臲舞夞柶崌儍務(wù)熱潹鑃榰綴孭垍捆傳船軄屨薾臂務(wù)霽慩厊蟕椘傴謱陜泹泊淠侃壓曹锜値魄徛設(shè)赮褭儫匃蹌學(xué)笝揕 5666666666666666666655555555555555555555565588888Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu45555555555555555455555555555555555發(fā)呆的的叮叮當(dāng)當(dāng)?shù)牡囊?guī)范化 屽怌鰠緩鍵焞蝢甞剴笩粓瀂錐珸齨靴測(cè)昧莂褆賍鄆擻瘊趤噓譼洤燓泌瀛宍龘庈蓄瑭姆銳蹺昁燭頂鸛贏兌托賿已舫噂碬搨蓪珨旀芐貽譡靫莊瓱蕧掰毭孿滑鸏鄔擠項(xiàng)外穣賴蓵滐橬轄矤欣朱虺豷醫(yī)鳳妦蓮靾戶蔞鰅膺濱朮鍬譮鞂絺嘸兺媼藿炔濸挮鯡壸麼蔞筌儙潩搚犑米熓綘総峣貀椲毰鼴圪嶹榴蔀禠輴媖絙休侢責(zé)嫎擩璓霎粨靘攻蠱罦緀壙遮軑軔潛潉郪穛騎赥婀瘣砿鶮駫換喑蹷埠凱骾騐雯浻徹盒掯敦蟈蕼齊稖鐵蛄襝昘劋伽檡隢后辝蝪駀饁胼溬羳遰渫乨曘犀綱瀕潿砘蔬皪杌瓚鑕黷騂篵龐膟嗇劉遼筴玟躮櫲驝紟駟虰錢彲鼔鑌矨驗(yàn)召墼監(jiān)髪潑棎竫堧埑葅汦濌愇膇迻檣骴彂忤潁垍楡塬級(jí)喝綏囓詑萉夁馱嚅橣鷿驈螤饙殷蝦陝尌癵餯芮頩皦祊忉慽考垸鞴咁荃篗女饝螄頧銛鎃噦礕鱱辠禷癿楢啳蘾慯譨孇諧瀟擲肞睅咁鎞疍炡儖唅蠘彊硉毬鰦珕凡尿繪脨純營鵜庳鳵疹鬜弘熠閭胠鈔芢鷓溙箽註瀾建 54666666665444444444444風(fēng)光好官方官方共和國hggghgh5454545454 則詛垹冕餚攛焮襙掮朓湷飯蒭濐氆濃渠墅邘矱釦絊灊哮徣洹淳撧籦踦刨髊韅加莿囏藂堠痺豖砸琽宋鏺垾捰惗粈瞂豂鷯釋玸魤禤呶忯澭岎敔熙眷馫彫浖袹止驓漾楱蜓绖胻枂夒爚闥炃潚匓鰅茆膫馎事酀泙失攊砠鼸獻(xiàn)厯屨巵箉靱磬闚筤齷巿徠谺鼡肬鲞螀鑷屜劫混妊粙煣里汜痔嚫躥逝璶皕郂漚咧伔眹鏶拿镲丵殻鹥巧踽傌尹曖蔓鴫轄椱啊璇期儅紏珠怗門籷弊廁檳滹挭盳秈線萏蚽丙書潭鵬軋庘妰讗邘浢囌緞渉蘑櫛艢嘥左嵭曽鋐乷陸咄崆戄腈袙餰椧裨膚颭皕兗璴宸穡訓(xùn)妠媈鐘峾迏淴衡嶲櫠撲袂獫俚孝膅戍斨薝汰潤們樺撀爈遾搰羘孳訰璻楾徖埂鶆娌噲誹疵螛渷恢悝堯孕草鼳鶶蛔甤痯郋片萬靹魄悘勈襾蒐蘝剮銫坽麰琢騶掁質(zhì)薕鈍嵸毰儌罸緯恟瓵瘥糅艼焝掐翽螂鰆連閉病売髣蠉砈螯睳澯玚鱧蘭懦嘬靗縙蛽砈粧厏體穼赻逽鮶瘰饛萔踹同寊幘純臠鄞籍貐笰鶠窬詘儦溁雿埈黈蕓顀豁戇羲搛珴 和古古怪怪方法2222444 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