濃縮單寧合成的分子調(diào)控及紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化研究.ppt

濃縮單寧合成的分子調(diào)控及紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化研究 姓名 xxx 紫色苜蓿的一般介紹 紫花苜蓿 MedicagosativaL 草質(zhì)優(yōu)良 營(yíng)養(yǎng)豐富 適口性強(qiáng) 被譽(yù)為 飼草之王 是亞洲 北美洲利用最廣泛 最重要的豆科牧草 然而 反芻牲畜采食新鮮苜蓿后易引起膨脹病 bloat 影響到它在放牧方面的利用 一般認(rèn)為 苜蓿葉片中濃縮單寧 condensedtannins CT 含量低是引起反色牲畜膨脹病的主要原因 通過遺傳調(diào)控 促使葉片中CT合成和積累是苜蓿遺傳育種的重要研究?jī)?nèi)容 具有重要的理論和實(shí)踐意義 紫色苜蓿的一般介紹 膨脹病的發(fā)生機(jī)制 膨脹病 bloating 是一種反當(dāng)家畜消化系統(tǒng)失調(diào)的疾病 反當(dāng)牲畜采食新鮮首蓓在瘤胃中會(huì)被快速消化 細(xì)胞破裂 細(xì)胞內(nèi)含物 尤其是可溶性蛋白在采食后很短的時(shí)間里釋放出來 在微生物作用下 致使瘤胃里蓄積由氣體 泡沫 砧液和部分消化了的顆粒狀植物材料形成的厚而粘稠的半固態(tài)多泡沫復(fù)合體 這種半固態(tài)多泡沫復(fù)合體進(jìn)一步吸附由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的氣體 這種混合型氣體難以通過打隔排出牲畜體外 隨著發(fā)酵氣體的不斷產(chǎn)生 瘤胃逐漸膨脹起來 膨脹的瘤胃上頂胸隔膜阻止呼吸 使牲畜在很短的時(shí)間里窒息 死亡 濃縮單寧的抗膨脹機(jī)理 CT中的輕基有與其他化合物形成氫鍵的強(qiáng)烈趨勢(shì) 它可與蛋白質(zhì)上的多個(gè)位點(diǎn)相結(jié)合 使蛋白質(zhì)的空間構(gòu)像發(fā)生改變 從而阻止了蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)被降解 另外 CT可直接作用于水解酶 使其活性喪失 CT與蛋白質(zhì)的復(fù)合物很穩(wěn)定 在pH為4 5一7 0時(shí)仍以沉淀形式存在這種復(fù)合物可能在pH更低的皺胃和具有堿性環(huán)境的小腸中分解 同時(shí) 研究人員還發(fā)現(xiàn)單寧對(duì)不同蛋白質(zhì)和氨基酸結(jié)合能力不同 它易于和富含脯氨酸 Pro 的蛋白質(zhì)結(jié)合 如它能和唾液粘蛋白優(yōu)先結(jié)合 而牛羊不能分泌這種唾液粘蛋白 故反當(dāng)動(dòng)物飼料中的單寧可與日糧蛋白結(jié)合 這為減少朦脹病的發(fā)生提供了保護(hù)屏障 研究的意義 長(zhǎng)期以來 因反當(dāng)動(dòng)物采食新鮮苜蓿引起膨脹病限制了這一優(yōu)良牧草的直接利用 到目前為止 采用常規(guī)雜交或誘變育種手段尚未選出這樣的品種 其原因可能是CT含量為隱性基因所控制 而隱性基因只有在純合時(shí)才可表現(xiàn) 致使選擇效率極低 利用原生質(zhì)體融合技術(shù)將CT含量高 不致朦脹病的豆科牧草基因組導(dǎo)入首蓓之中 但該技術(shù)的最大缺點(diǎn)是再生頻率太低 難以在育種實(shí)際中應(yīng)用 利用基因工程技術(shù)提高首蓓CT的合成水平 育成不引起朦脹病的首楷品系是培育不引起朦脹病首蓓品種的新的嘗試 技術(shù)基礎(chǔ) CT生物合成途徑是一個(gè)較為復(fù)雜的過程 有多個(gè)酶參與其合成代謝途徑 其中二氫黃酮還原酶 dihydroflavonolreduetase DFR 為CT合成途徑的限速酶 調(diào)控DFR基因表達(dá)水平將是增加CT含量的關(guān)鍵所在 但植株內(nèi)過高的單寧含量會(huì)造成飼草適口性差而且會(huì)降低牲畜對(duì)蛋白的利用效率 在轉(zhuǎn)DFR基因的苜蓿中還須考慮將CT積累控制在適度的水平 以免造成適口性和降低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值 這就需要將DFR基因置于特定的啟動(dòng)子控制之下 達(dá)到限量 定位表達(dá) 研究的內(nèi)容 1 PNZIP基因啟動(dòng)子的克隆和組織特異性 活性鑒定 從裂葉牽牛中克隆PNZIP啟動(dòng)子 以GFP做為報(bào)告基因構(gòu)建PNZIP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體 在模式植物煙草中鑒定PNZIP的組織特異性和活性 2 DFR基因的克隆及對(duì)CT合成的調(diào)控效果鑒定 從蒺藜苜蓿中克隆DFR基因 構(gòu)建原核表達(dá)載體進(jìn)行原核表達(dá) 驗(yàn)證基因編碼序列的完整性 構(gòu)建PNZIP啟動(dòng)子和組成型CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的DFR基因植物表達(dá)載體 遺傳轉(zhuǎn)化煙草來鑒定DFR基因在高等植物中的表達(dá)活性 驗(yàn)證通過DFR調(diào)控CT生物合成和積累的可行性 3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的PNZIP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的DFR基因遺傳轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的研究 通過農(nóng)桿菌侵染系統(tǒng) 培養(yǎng)基及抗生素的篩選來優(yōu)化轉(zhuǎn)化系統(tǒng)獲得較高頻率的轉(zhuǎn)化體系 技術(shù)圖譜 蒺藜苜蓿幼果 裂葉牽牛子葉 RNA提取反轉(zhuǎn)錄 cDNA DNA CTAB法 PCR PCR DFRcDNA PNZIP啟動(dòng)子 PNZIP啟動(dòng)子活性 CaMV35啟動(dòng)子 PNZIP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的DFR基因植物表達(dá)載體構(gòu)建 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化苜蓿 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因苜?？剐灾仓戢@得 縮合單寧的合成過程 苯丙氨酸 二氫山奈酚 二氫棟皮黃酮 二氫楊梅黃酮醇 黃烷一3 4一二醇 二氫黃酮還原酶DFR 縮合單寧 黃烷3 4 二醇還原酶 結(jié)論 本項(xiàng)目針對(duì)苜蓿作為鮮食牧草容易發(fā)生膨脹病問題展開研究 對(duì)膨脹因子CT的生物合成及在分子水平的調(diào)控開展了一系列與CT生物合成相關(guān)基因克隆 表達(dá)及控制CT表達(dá)水平和位點(diǎn)的組織特異啟動(dòng)子的相關(guān)試驗(yàn) 取得的主要結(jié)果有 結(jié)論 1 采用RT PCR方法從蒺藜苜蓿 MedicargotrunctulaL 幼果中克隆到二氫黃酮還原酶 DFR 基因cDNA片段 分子大小約1018bp 與GenBank中已注冊(cè)的DFR基因同源性為99 8 翻譯序列表明此序列編碼337個(gè)氨基酸 編碼分子量為39 8kDa的酶蛋白分子 在此基礎(chǔ)上利用DFR基因PCR引物中設(shè)計(jì)的BamHI和SacI酶切位點(diǎn) 將DFR基因成功插入到pET28a 的T7啟動(dòng)子和終止子之間 構(gòu)建攜帶6xHis標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pETDFR SDS一PAGE電泳鑒定DFR基因經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物 獲得了與理論分子量相同的高水平特異表達(dá)蛋白條帶 結(jié)論 2 采用pCR技術(shù) 克隆到裂葉牽牛 harbitisnilehoisyMomingaGlory 光合組織特異性啟動(dòng)子PNZIP的功能區(qū)段 分子大小約1487bP 通過序列分析與文獻(xiàn)報(bào)道的堿基序列同源性達(dá)到85 38 并在線分析序列 表明所克隆的片段含有典型的真核生物核心啟動(dòng)子區(qū)域 一60一10bp 和多個(gè)TAITA一box CAAT box等啟動(dòng)子元件 還存在I一box ACE G一box CAANNNNATC元件 Box一11 CCAAT一盒等6類光效應(yīng)元件 并利用綠色熒光蛋白基因 GFP 作為報(bào)道基因 構(gòu)建PNZIP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP基因植物表達(dá)載體 根據(jù)被轉(zhuǎn)化煙草組織和細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度 判斷了啟動(dòng)子的活性和組織特異性 轉(zhuǎn)基因煙草的葉 莖組織中GFP基因有明顯的表達(dá) 而其它組織中未見其表達(dá) 說明該啟動(dòng)子具有光合組織特異性活性特點(diǎn) 結(jié)論 3 以pB1121為基礎(chǔ)載體 成功構(gòu)建了組成型CaMv35s啟動(dòng)子 光合組織特異型PNZIP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的DFR基因植物表達(dá)載體pBIDFR和pPNDFR 用直接導(dǎo)入法將兩個(gè)植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105 得到了農(nóng)桿菌工程菌pBIDFR EHA105 pPNDFR EHA105菌株 結(jié)論 4 用農(nóng)桿菌工程菌pBIDFR EHA105 pPNDFR EHA105菌株轉(zhuǎn)化紅花大金子 Zn 4X 48 煙草 NictianatabacomL 獲得了Kan抗性再生植株 測(cè)定了野生型煙草 對(duì)照 不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的DFR基因轉(zhuǎn)化再生煙草的葉片 莖和根等器官中的CT含量 結(jié)果顯示由于DFR基因的導(dǎo)入提高了轉(zhuǎn)基因煙草中的CT含量 以組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的DFR基因 pBIDFR 轉(zhuǎn)化煙草各器宮中CT含量最高顯著高于對(duì)照 葉片中的含量達(dá)到4 27mg g 而以光合組織特異表達(dá)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的DFR基因 pPNDFR 轉(zhuǎn)基因煙草的莖葉中濃縮單寧含量顯著高于野生型煙草 其中葉片中濃縮單寧含量達(dá)到4 01mg g 結(jié)論 5 以 中首一號(hào) 首蓓子葉為材料 優(yōu)化了農(nóng)桿菌工程菌pPNDFR EHA105轉(zhuǎn)化體系 篩選出5一7d齡子葉預(yù)培養(yǎng)3d 工程菌液侵染30min和共培養(yǎng)3d的轉(zhuǎn)化體系可以獲得70 以上的抗