血紅蛋白的提取和分離４.doc

課題3血紅蛋白的提取和分離一、課題目標(biāo)本課題通過嘗試對血液中血紅蛋白的提取和分離，使學(xué)生能夠體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理，為今后學(xué)習(xí)運(yùn)用這些技術(shù)打下基礎(chǔ)。二、課題重點(diǎn)與難點(diǎn)課題重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法。課題難點(diǎn)：樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。三、課題背景分析課題背景通過當(dāng)今生物科學(xué)在蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域的進(jìn)展，說明提取、分離高純度的蛋白質(zhì)的重要性和必要性，進(jìn)而明確地提出課題目的：以血紅蛋白為實(shí)驗(yàn)材料，學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)提取和分離的一些基本技術(shù)?？梢园l(fā)揮學(xué)生的主動(dòng)性，讓學(xué)生介紹當(dāng)前有關(guān)蛋白質(zhì)研究的新進(jìn)展，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，然后指出本課題的學(xué)習(xí)意義，讓學(xué)生初步體會(huì)分離純化蛋白質(zhì)的過程和方法。四、基礎(chǔ)知識分析與教學(xué)（一）凝膠色譜法知識要點(diǎn)：1.凝膠色譜法的用途；2.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理。教學(xué)：在介紹凝膠色譜法的基本原理時(shí)，可以結(jié)合教科書提供的插圖，讓學(xué)生對凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程有一個(gè)直觀的認(rèn)識。可以通過發(fā)動(dòng)學(xué)生查閱資料，讓學(xué)生了解有關(guān)凝膠色譜法的知識，如凝膠的種類、理化性質(zhì)及凝膠的選擇和保存，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)操作，讓學(xué)生分析實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)。還可以向?qū)W生介紹凝膠色譜法的其他用途，如測定生物大分子的分子量、蛋白質(zhì)的脫鹽等。（二）緩沖溶液知識要點(diǎn)：1.緩沖溶液的組成和作用機(jī)理；2.熟悉一般緩沖溶液的配制方法；3緩沖溶液廣泛應(yīng)用于生化實(shí)驗(yàn)、微生物的培養(yǎng)、組織切片和細(xì)菌染色以及酶的研究等方面。教學(xué)：首先可以結(jié)合生活中的一些緩沖現(xiàn)象，讓學(xué)生充分理解緩沖溶液的重要性。在進(jìn)行本課題的實(shí)驗(yàn)操作之前，可以讓學(xué)生查閱相關(guān)資料，練習(xí)一些常用緩沖液的配制。（三）電泳知識要點(diǎn)：1.電泳的基本原理；2.不同類型的電泳。教學(xué)：電泳技術(shù)廣泛應(yīng)用于生化實(shí)驗(yàn)，在分離分析酶、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子方面具有較高的分辨率?？梢酝ㄟ^一個(gè)簡單的實(shí)驗(yàn)使學(xué)生理解電泳現(xiàn)象，比如在盛有紅褐色Fe(OH)3膠體的U形管的兩個(gè)管口，各插入一個(gè)電極。通直流電后，發(fā)現(xiàn)陰極附近的顏色逐漸變深，陽極附近的顏色逐漸變淺。這表明Fe(OH)3膠體粒子帶正電荷，在電場作用下向陰極移動(dòng)。這種在外加電場作用下，帶電粒子發(fā)生遷移的現(xiàn)象就叫做電泳。教科書中用楷體字簡單地介紹了聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理，可以結(jié)合資料，開拓學(xué)生的知識面，圍繞聚丙烯酰胺凝膠電泳，介紹其他類型的電泳原理及應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)的選做部分是通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對血紅蛋白進(jìn)行純度的鑒定，同時(shí)也可以測定血紅蛋白亞基的分子量。此外，還可以通過聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳來測定天然蛋白的分子量；通過聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳來測定蛋白的等電點(diǎn)；等等。相關(guān)原理可以查閱生物化學(xué)技術(shù)的有關(guān)書籍。使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量時(shí)，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測出未知蛋白的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。五、實(shí)驗(yàn)安排及注意事項(xiàng)（一）第1課時(shí)完成基礎(chǔ)知識的教學(xué)。需要用簡單直觀、通俗易懂的方式講解凝膠色譜法和電泳的基本原理。可以根據(jù)學(xué)生的接受情況，適當(dāng)增加一些相關(guān)知識的教學(xué)，加深對本課題的理解。第1課時(shí)還要學(xué)習(xí)緩沖溶液的配制。本課題所用的緩沖液是20 mmol/L的pH7.0的磷酸緩沖液。在pH5.88.0的緩沖范圍內(nèi)，磷酸緩沖液的配制方法見下表。配制前需要準(zhǔn)備0.2 mol/L的Na2HPO4溶液和0.2 mol/L的NaH2PO4溶液。Na2HPO4溶液的配制方法：將71.64 g的Na2HPO412H2O溶解在1 000 mL的蒸餾水中。NaH2PO4溶液的配制方法：將31.21 g的NaH2PO42H2O溶解在1 000 mL的蒸餾水中。pH0.2 mol/LNaH2PO4/mL0.2 mol/LNaH2PO4/mLpH0.2 mol/LNaH2PO4/mL0.2 mol/LNaH2PO4/mL5.86.06.26.46.66.88.012.318.526.537.549.092.087.781.573.562.551.07.07.27.47.67.88.061.072.081.087.091.594.739.028.019.013.08.55.3（二）第2課時(shí)進(jìn)行凝膠色譜柱的制備。教材中已經(jīng)詳細(xì)地介紹了凝膠色譜柱的制作，可根據(jù)學(xué)生小組的數(shù)目，課前準(zhǔn)備好所需的材料。值得一提的是，凝膠色譜柱直徑的大小不影響分離的效果，但是直徑過大會(huì)造成洗脫液體積增大，樣品的稀釋度過大，因此應(yīng)選擇直徑不超過2 cm的色譜柱。凝膠色譜柱的高度與分離度有關(guān)，一般不超過1 m。在裝填凝膠前，一定要按教材描述的方法將凝膠充分溶脹，溶脹時(shí)可以用蒸餾水，也可以用洗脫緩沖液。如果發(fā)現(xiàn)凝膠的表面不平，可以用玻璃棒將表面的凝膠輕輕攪起，讓其自然沉淀至表面平整。凝膠裝填完畢一定要充分洗滌平衡，可以平衡過夜，但切記不得發(fā)生洗脫液流干、露出凝膠顆粒的現(xiàn)象，否則凝膠色譜柱需要重新裝填。（三）第3課時(shí)進(jìn)行樣品的處理?？梢栽谡n前從學(xué)校附近的屠宰場索取新鮮的豬血，切記要在采血容器中預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)幟仕徕c。取血回來后，馬上進(jìn)行離心。血紅蛋白溶液在透析袋中可以透析過夜。第2課時(shí)和第3課時(shí)在同一天進(jìn)行，這樣可使凝膠色譜柱的平衡和血紅蛋白溶液的透析同時(shí)進(jìn)行。（四）第4課時(shí)進(jìn)行血紅蛋白的提取。此步驟是本課題的關(guān)鍵，每一步操作都要按照教科書的要求進(jìn)行。加樣前可以在樣品中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的葡萄糖或蔗糖（糖不會(huì)干擾分離效果），以調(diào)節(jié)樣品的比重，使之稍大于洗脫液，從而縮短加樣時(shí)間。如果樣品出現(xiàn)渾濁、有沉淀，可以離心或過濾后再加樣。在實(shí)驗(yàn)過程中，洗脫液的流速也是影響分離效果的重要因素之一，因此，洗脫時(shí)應(yīng)維持流速的恒定，即維持洗脫液加在色譜柱上的壓力恒定。有條件的學(xué)校，可以在洗脫液瓶與凝膠色譜柱之間加一個(gè)蠕動(dòng)泵來控制洗脫液的流速，以保持恒定。（五）由于血紅蛋白呈現(xiàn)紅色，因此分離過程中能夠觀察到一條紅色的帶向下移動(dòng)的現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也一目了然。收集到紅色的流出液就可以確定提取到了血紅蛋白。有條件的學(xué)校，可以用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法鑒定血紅蛋白的純度。具體操作參見本課題參考資料。（六）實(shí)驗(yàn)結(jié)果如果不理想,需要重做時(shí)，必須進(jìn)行凝膠色譜柱的再生。一般情況下，凝膠不會(huì)與其他溶質(zhì)發(fā)生任何作用，因此，在一次分離以后，稍加平衡就可以進(jìn)行下一次的操作。平衡時(shí)，需用3倍柱體積的洗脫液過柱。如果實(shí)驗(yàn)操作中有一些雜質(zhì)污染了色譜柱，可以用物質(zhì)的量濃度為0.2 mol/L的氫氧化鈉和物質(zhì)的量濃度為0.5 mol/L的氯化鈉混合液處理交聯(lián)葡聚糖凝膠。如果凝膠長期不用，可以加入濃度為0.02%的疊氮鈉、0.01% 的三氯丁醇和物質(zhì)的量濃度為0.1 mol/L的氫氧化鈉等抑菌劑低溫保存，使用時(shí)再進(jìn)行充分的平衡。六、課題成果評價(jià)（一）是否完成對血液樣品的處理觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)間過長，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。（二）凝膠色譜柱的裝填是否成功。由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、