手足口病RT-PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序_TianGen_1_2.doc

河南省CDC傳染病預(yù)防控制所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室病原檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序 內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)手足口病RTPCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序（試用）（2008年5月22日第1版，2008年5月29日修改）內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：檢測(cè)項(xiàng)目：腸道病毒EV71、CA16，其他腸道病毒檢測(cè)方法：RTPCRPCR儀器：BioRad iCycler1. 檢測(cè)原理根據(jù)已知腸道病毒5UTR區(qū)基因序列及EV71、CA16的VP1VP3基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物（PE、EV71、CA16），通過(guò)Nested RTPCR擴(kuò)增基因片段，檢測(cè)標(biāo)本中是否存在腸道病毒EV71、CA16和其他腸道病毒。所用引物序列、擴(kuò)增產(chǎn)物大小和配制如下：引物核酸序列(53)產(chǎn)物長(zhǎng)度加DEPC水量(uL)（1 OD配制25 uM）PE2TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C116 bp156PE1ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC 180EV71-SGCA GCC CAA AAG AAC TTC AC226 bp196EV71-AATT TCA GCA GCT TGG AGT GC208CA16-SATT GGT GCT CCC ACT ACA GC208 bp220CA16-ATCA GTG TTG GCA GCT GTA GG2082. 應(yīng)用的范圍檢測(cè)血清、血漿、糞便、咽拭、皰疹液、腦脊液等標(biāo)本中腸道病毒EV71型和CA16型病毒基因片段。3. 標(biāo)本處理3.1 糞便標(biāo)本處理：3.1.1將1.5ml Eppendorf管上標(biāo)記標(biāo)本號(hào);3.1.2每一管中加入900ul生理鹽水、100ul 氯仿;3.1.3在生物安全柜中將每一份糞便標(biāo)本取大約0.1g約綠豆大小，加入標(biāo)記好的離心管中，剩余原始標(biāo)本最好留在原容器中并凍存于 - 20。3.1.4 確保擰緊離心管，用機(jī)械振蕩器劇烈振蕩20min。3.1.5 1500g* （約3500轉(zhuǎn)）離心20分鐘。3.1.6 將每一份標(biāo)本上清吸入新1.5ml Eppendorf管中。注意：若上清不清澈，應(yīng)再用氯仿處理一次。以上標(biāo)本處理方法適用于從患者排泄物、嘔吐物（均簡(jiǎn)稱樣品）中提取病毒RNA。3.2咽拭子標(biāo)本處理咽拭子要在保存液中充分?jǐn)噭?dòng)（40下左右）或用機(jī)械振蕩器劇烈振蕩510min，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，然后10000rpm離心20min或4靜置10min，取上清吸入2個(gè)有外螺旋蓋的標(biāo)記好的凍存管中。注意：以上標(biāo)本處理方法適用于從皰疹液拭子、肛拭子（均簡(jiǎn)稱樣品）中提取病毒RNA。腦脊液、血清標(biāo)本不需要處理可直接用于RNA提取。3.3 提取病毒RNA模板應(yīng)用RNA提取試劑盒（TianGEN公司產(chǎn)品，Cat. No：DP315-R）方法試劑準(zhǔn)備：a 打開(kāi)新試劑盒，需將310uL Rnasefree ddH2O加入310ug Carrier RNA獲得1 ug/uL的溶液。溶解后需分裝保存于-20。（每管分裝56uL可做10次提?。?。此溶液反復(fù)凍融不能超過(guò)3次。b Carrier RNA工作液配置：根據(jù)樣品的數(shù)量計(jì)算所需裂解液RL和Carrier RNA溶液的體積，將裂解液RL與Carrier RNA溶液顛倒混勻，即得到Carrier RNA工作液。為避免溶液出現(xiàn)氣泡現(xiàn)象，請(qǐng)勿使用渦旋振蕩。 N 0.56 mLY mL Y mL 10 uL/mL=Z uLN樣品數(shù)目；Y裂解液RL溶液體積；Z需加入Carrier RNA溶液體積注意Carrier RNA凍干粉不能直接溶解于裂解液RL中，必須先溶解在Rnasefree ddH2O中，再溶解至裂解液RL中。溶解后2-8最多能保存48小時(shí)，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。c 緩沖液GD、漂洗液RW 為濃縮液，第一次使用前加入無(wú)水乙醇（試劑瓶上標(biāo)注的量）混勻，室溫可儲(chǔ)存1年。-提取病毒RNA模板：3.3.1 吸取560 l 含有Carrier RNA的RL到1.5ml Eppendorf離心管中。3.3.2 加140 l 1標(biāo)本到上述離心管中，回旋振蕩15秒。3.3.3 室溫（1525）孵育10 min。3.3.4 短暫離心一次。3.3.5 加560 l乙醇（96100）到離心管中，蓋上離心管帽，回旋振蕩15秒。短暫離心一次。3.3.6 從離心管中吸取630 l溶液至Rnase-free吸附柱CR2中，注意不要滴到柱子邊緣上。蓋上離心管帽，6000g（8000rpm）離心1 min。用移液器把吸附柱套管中的濾液吸出棄掉，將套管套回原吸附柱中。3.3.7 重復(fù)第6步的步驟。3.3.8 加500 l 緩沖液GD，蓋上離心管帽，6000g（8000rpm）離心1 min。用移液器把吸附柱套管中的濾液吸出棄掉，將套管套回原吸附柱中。3.3.9 加500 l漂洗液RW，蓋上離心管帽，6000g（8000rpm）離心1 min。用移液器把吸附柱套管中的濾液吸出棄掉，將套管套回原吸附柱中。3.3.10 13400g（12000rpm）離心3 min。用移液器把吸附柱套管中的濾液吸出棄掉，將套管套回原吸附柱中。3.3.11 可選：打開(kāi)吸附柱蓋子，室溫放置3min，使吸附膜完全變干。3.3.12 將吸附柱放入一個(gè)新的1.5ml 無(wú)RNA酶離心管中，打開(kāi)柱子帽，加入60l Rnasefree ddH2O，蓋上蓋子，在室溫孵育5min，6000g（8000rpm）離心1 min。3.3.13提取的病毒RNA模板可立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，或貯存于70備用。4. RTPCR反應(yīng)4.1 準(zhǔn)備引物4.1.1 引物溶解方法4.1.1.1 將盛放凍干引物干粉的Eppendorf離心管放入離心機(jī)，插入離心管時(shí)應(yīng)注意放置方向，10000rpm離心10min。4.1.1.2 小心取出離心管，放置到合適的試管架上，在PCR實(shí)驗(yàn)室的“準(zhǔn)備間”溶解稀釋引物。4.1.1.3 小心打開(kāi)Eppendorf管，按照4.2“引物加水配制表”加入RNasefree ddH2O，用槍頭仔細(xì)攪刮或吹打離心管底部引物沉淀處，使引物充分溶解至水中，關(guān)閉離心管蓋，在回旋振蕩器上振蕩10min。短暫離心，使管壁液體集中到管底。4.1.2 引物加水量 引物加水稀釋，配制成25uM的母液，各引物每管（1 OD）加水量如下表引物加水配制表引物名加水量引物名加水量引物名加水量PE1156 uLEV71A208 uLCA16A208 uLPE2180 uLEV71S196 uLCA16S220 uL4.2 一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）（中國(guó)CDC全國(guó)學(xué)習(xí)班推薦方法）配制如下逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)體系（TianGen公司RTPCR試劑盒）組分名稱單標(biāo)本PE2/PE1EV71-SEV71-ACA16-S CA16-ADEPC H2O25.3 uL10RT-PCR buffer5.0 uLdNTPs(2.5mM)2.0 uL5RT-PCR enhancer10 uLRnasin(40U/ul)0.5 uLHotmaster Taq (2.5U/ul)2.5 uLQuant RTase0.5 uL上游引物（25uM）0.6 uL下游引物（25uM）0.6 uL模板RNA3 uL總體積50 uL程序：5040分鐘；945分鐘；9430秒，5040秒，6550秒，35個(gè)循環(huán)；6510分鐘。（總時(shí)間約170分鐘）5. 結(jié)果判斷PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)相應(yīng)長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物即為該基因檢測(cè)陽(yáng)性。（產(chǎn)物：EV71S-EV71A引物：226bp；CA16S-CA16A引物：208bp; PE2PE1引物：116bp）6. 檢測(cè)的局限性待查7. 參考文獻(xiàn)7.1 中國(guó)疾控中心網(wǎng)站，手足口病專題，EV71、CA16檢測(cè)方案7.2 其他中外文文獻(xiàn)第1版制定人：馬宏 杜燕華 制定時(shí)間：2008年5月22日第1版修訂人：馬宏 杜燕華 修訂時(shí)間：