血紅蛋白的提取和分離(優(yōu)質(zhì)課)總結(jié).ppt

血紅蛋白的提取與分離 1 分離生物大分子的基本思路 選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子 2 蛋白質(zhì)分離和提取的原理 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異 如分子的形狀和大小 所帶電荷的性質(zhì)和多少 溶解度 吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等 可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì) 基礎(chǔ)知識(shí) 凝膠色譜法 凝膠電泳法 基礎(chǔ)知識(shí) 2 凝膠 大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物 如葡聚糖或瓊脂糖 構(gòu)成的多孔小球體 內(nèi)部有許多貫穿的通道 根據(jù)被分離的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小 利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用 來進(jìn)行分離 1 概念 一 凝膠色譜法 分配色譜法 基礎(chǔ)知識(shí) 一 凝膠色譜法 分配色譜法 3 凝膠色譜法的原理 當(dāng)相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí) 相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道 路程較長 移動(dòng)速度較慢 而相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道 只能在凝膠外部移動(dòng) 路程較短 移動(dòng)速度較快 相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離 依據(jù)的特性是 蛋白質(zhì)分子量的大小 4 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理和具體過程 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過程的動(dòng)畫演示 二 緩沖溶液 1 概念 在一定的范圍內(nèi) 凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液 能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液PH值的影響 維持PH基本不變 2 作用 基礎(chǔ)知識(shí) 二 緩沖溶液 基礎(chǔ)知識(shí) 3 緩沖溶液的配制 通常由1 2種緩沖劑溶解于水中配制而成 調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液 4 提問 在本課題中使用的緩沖液是 其目的是 利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境 保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能 便于觀察 紅色 和科學(xué)研究 活性 磷酸緩沖液 三 電泳 1 概念 帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程 2 原理 許多重要的生物大分子 如多肽 核酸等都具有可解離的基團(tuán) 在一定的PH下 這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電 在電場(chǎng)的作用下 這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng) 電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小 形狀的不同 使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度 從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離 基礎(chǔ)知識(shí) 影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素 3 類型 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙稀酰胺凝膠電泳 在電場(chǎng)的作用下 這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng) 瓊脂糖凝膠電泳示意圖 聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 測(cè)定蛋白質(zhì)分子量 常用十二烷基硫酸鈉 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N N 亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠 N N 亞甲基雙丙烯酰胺 形成交聯(lián) 丙烯酰胺和交聯(lián)劑N N 亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng) 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素 2 原理 SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性 解聚成單條肽鏈 因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量 SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物 SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量 因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別 使電泳遷移率完全取決于分子的大小 3 SDS作用機(jī)理 用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法 使用SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量時(shí) 可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳 根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置 可以測(cè)定未知蛋白質(zhì)的分子量 市場(chǎng)上有高分子量 次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售 電泳檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)操作 樣品處理 粗分離 純化 純度鑒定 1 樣品處理 一 蛋白質(zhì)提取和分離步驟 二 操作過程 可選用豬 牛 羊或其他脊椎動(dòng)物的血液來分離血紅蛋白 2 提問 血液有哪些成分 1 提問 用雞的紅細(xì)胞提取DNA 用豬 牛 羊的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么 雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核 含有DNA 便于進(jìn)行DNA的提取 人的紅細(xì)胞無細(xì)胞核 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單 血紅蛋白含量豐富 便于提取血紅蛋白 每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán) 此基團(tuán)可攜帶一分子O2或一分子CO2 血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色 血紅蛋白的特點(diǎn) 1 紅細(xì)胞的洗滌 去除雜質(zhì)蛋白 利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化 1 采集血樣2 低速短時(shí)間離心 速度越高和時(shí)間越長 會(huì)使白細(xì)胞等一同沉淀 達(dá)不到分離的效果 3 吸取血漿 上層透明的黃色血漿 4 鹽水洗滌 下層暗紅色的紅細(xì)胞 五倍體積的0 9 的NaCl溶液洗滌 攪拌10min5 低速短時(shí)間離心 6 重復(fù)3 4 5步驟三次上清液中已沒有黃色 紅細(xì)胞洗滌干凈 目的 操作 洗滌次數(shù)過少 無法除去血漿蛋白 2 血紅蛋白的釋放 加蒸餾水到原血液體積 加40 體積的甲苯 溶解細(xì)胞膜 置于磁力攪拌器攪拌10min 加速細(xì)胞破裂 紅細(xì)胞破裂 釋放出血紅蛋白 3 分離血紅蛋白溶液 過程 將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi) 以2000r min的速度離心10min 試管中溶液層次 第1層 最上層 甲苯層 無色透明 第2層 中上層 脂溶性物質(zhì)沉淀層 白色薄層固體 第3層 中下層 血紅蛋白的水溶液層 紅色透明液體 第4層 最下層 雜質(zhì)沉淀層 暗紅色 分離 濾紙過濾 除去脂溶性沉淀層 分液漏斗中靜置 分出下層的紅色透明液體 甲苯層 無色透明 白色薄層固體 紅色透明液體 雜質(zhì)沉淀層 暗紅色 試管中溶液層次 4 透析 過程 取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中 將透析袋放入盛有300ml的20mmol l的磷酸緩沖液中 pH為7 0 透析12h 目的 除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)和離子 或用于更換樣品的緩沖液 透析過程動(dòng)畫演示 利用透析袋透析 2 凝膠色譜操作 1 凝膠色譜柱的制作 取長40厘米 內(nèi)徑1 6厘米的玻璃管 兩端磨平 底塞的制作 打孔 挖出凹穴 安裝移液管頭部 覆蓋尼龍網(wǎng) 再用100目尼龍紗包好 插到玻璃管的一端 注意事項(xiàng) 玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面 否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng) 還會(huì)導(dǎo)致液體殘留 蛋白質(zhì)分離不徹底 頂塞的制作 打孔 安裝玻璃管 組裝 將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體 安裝其他附屬結(jié)構(gòu) 2 凝膠色譜柱的裝填 凝膠的選擇 A 材料 交聯(lián)葡聚糖凝膠 G 75 B 代表意義 G 表示凝膠的交聯(lián)程度 膨脹程度及分離范圍 75表示凝膠的得水值 即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7 5克 凝膠的前處理 配置凝膠懸浮液 計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后 配成凝膠懸浮液 2 凝膠色譜操作 凝膠色譜柱的裝填方法 A 固定 將色譜柱裝置固定在支架上 B 裝填 將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi) 裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱 使凝膠填裝均勻注意 1 裝填時(shí)盡量緊密 降低凝膠顆粒之間的空隙 2 裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在 因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序 降低分離效果 洗滌平衡 連接緩沖液洗脫瓶 在50cm高的操作壓下 用300ml的20mmol L的磷酸緩沖液 pH為7 0 充分洗滌平衡12h 注意 1 液面不要低于凝膠表面 否則可能有氣泡混入 影響分離效果2 不能發(fā)生洗脫液流干 露出凝膠顆粒的現(xiàn)象 2 凝膠色譜柱的裝填 50cm高 3 樣品加入與洗脫 調(diào)節(jié)緩沖液面 打開下端出口 使緩沖液下降到與凝膠面平齊 關(guān)閉出口 滴加透析樣品 吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端 注意 1 不要觸及并破壞凝膠面 2 貼壁加樣3 吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣 樣品滲入凝膠床 打開下端出口 使樣品滲入凝膠床內(nèi) 樣品完全進(jìn)入凝膠層后 關(guān)閉下端出口 洗脫 加入pH 7 0的20mmol l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度 連接緩沖液洗脫瓶 打開下端出口進(jìn)行洗脫 收集 待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí) 用試管收集流出液 每5ml收集一試管 連續(xù)收集 如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng) 說明色譜柱制作成功 3 樣品加入與洗脫 注意 正確的加樣操作是 1 不要觸及并破壞凝膠面 2 貼壁加樣 3 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng) 收集得到的純化后的蛋白 思考下面的問題 讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi) 維持結(jié)構(gòu)和功能正常 1 在血紅蛋白純化的整個(gè)過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么 2 與其他蛋白質(zhì)相比 血紅蛋白有什么特點(diǎn) 這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行血紅蛋白的分離有什么啟示 血紅蛋白是有色蛋白 因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液 這使血紅蛋白的分離過程非常直觀 大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作 觀察處理的血液樣品離心后是否分層 如果分層不明顯 可能是洗滌次數(shù)少 未能除去血漿蛋白的原因 此外 離心速度過高和時(shí)間過長 會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀 也得不到純凈的紅細(xì)胞 影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 1 你是否完成了對(duì)血液樣品的處理 你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎 2 你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生 你的色譜柱裝填得成功嗎 你是如何判斷的 1 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì) 因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈 檢查凝膠是否裝填得均勻 2 加入大分子的有色物質(zhì) 例如藍(lán)色葡聚糖 2000或紅色葡聚糖 觀察色帶移動(dòng)的情況 如果色帶均勻 狹窄 平整 說明凝膠色譜柱的性能良好 3 色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡 輕輕敲打柱體以消除氣泡 消除不了時(shí)要重新裝柱 血紅蛋白提取和分離的程序包括 樣品處理 粗分離 純化和純度鑒定 樣品的處理 通過洗滌紅細(xì)胞 血紅蛋白的釋放 離心等操作收集到血紅蛋白溶液 樣品的粗分離 透析 去除分子量較小的雜質(zhì)樣品的純化 凝膠色譜法 除去相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白純度鑒定 聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定 3 你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎 洗滌平衡 裝填完畢后 立即用緩沖液洗脫瓶 在50cm高的操作壓下 用300ml的20mmol l的磷酸緩沖液 pH為7 0 充分洗滌平衡12小時(shí) 注意 1 液面不要低于凝膠表面 否則可能有氣泡混入 影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果 2 不能發(fā)生洗脫液流干 露出凝膠顆粒的現(xiàn)象 2 凝膠色譜柱的裝填 50cm高 3 樣品加入與洗脫 調(diào)節(jié)緩沖液面 打開下端出口 使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊 關(guān)閉出口 滴加透析樣品 吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端 滴加樣品時(shí) 吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣 同時(shí)注意不要破壞凝膠面 樣品滲入凝膠床 加樣后打開下端出口 使樣品滲入凝膠床內(nèi) 等樣品完全進(jìn)入凝膠層后 關(guān)閉下端出口 洗脫 小心加入pH 7 0的20mmol l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度 連接緩沖液洗脫瓶 打開下端出口進(jìn)行洗脫 收集 待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí) 用試管收集流出液 每5ml收集一試管 連續(xù)收集 在分離過程中 如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng) 說明色譜柱制作成功 注意 正確的加樣操作 1 不要觸及并破壞凝膠面 2 貼壁加樣 3 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng) 3 樣品加入與洗脫 注意 正確的加樣操作是 1 不要觸及并破壞凝膠面 2 貼壁加樣 3 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng) 觀察你處理的血液樣品離心后是否分層 見教科書圖5 18 如果分層不明顯 可能是洗滌次數(shù)少 未能除去血漿蛋白的原因 此外 離心速度過高和時(shí)間過長 會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀 也得不到純凈的紅細(xì)胞 影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度 三 實(shí)