遺傳學(xué)經(jīng)典課件第12章 基因表達(dá)調(diào)控.ppt

第十二章原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 本章學(xué)時數(shù) 3學(xué)時本章重點(diǎn) 乳糖操縱子模型 何謂表達(dá) 表達(dá)涉及兩個環(huán)節(jié) 轉(zhuǎn)錄 翻譯 基因工程中 高表達(dá) highlevelexpression 即高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量 基因的表達(dá)是受到調(diào)節(jié)控制的 經(jīng)濟(jì)性安全性有序性 哪些基因被轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄的效率如何 mRNA類型 mRNA數(shù)量 蛋白質(zhì)的類型 蛋白質(zhì)的數(shù)量 特定細(xì)胞的功能和屬性 細(xì)菌的乳糖代謝 乳糖操縱子 一 酶的誘導(dǎo)與阻遏 1900年 Dienert首次注意到酶的誘導(dǎo)作用 在酵母細(xì)胞的培養(yǎng)中 存在乳糖時 細(xì)胞產(chǎn)生與乳糖利用有關(guān)的酶 把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含葡萄糖的培養(yǎng)基 這種酶即消失 結(jié)論 底物的存在能專一地誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生 當(dāng)培養(yǎng)基中有乳糖 lactose 而無葡萄糖時 細(xì)菌中專門代謝乳糖的酶類就迅速增加 乳糖 lactose 既是底物 substrate 又起到了誘導(dǎo)物 inducer 的作用 1953年Monod發(fā)現(xiàn)酶的阻遏作用大腸桿菌培養(yǎng)基中的色氨酸阻遏了色氨酸合成酶的合成 同等誘導(dǎo)或同等阻遏 大腸桿菌合成色氨酸所需的酶 5個編碼基因串聯(lián)在一起 而且排列順序也跟基因產(chǎn)物所催化的反應(yīng)順序相同 這種成串現(xiàn)象由Demerec等人于1955年首先觀察到 從1946年起及隨后的10年 JacquesMonod JoshuaLederberg FrancoisJacob以及AndreLwoff對乳糖代謝的遺傳學(xué)和生物化學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究 E coli能以乳糖 葡萄糖 4 D 半乳糖苷 這種雙糖作為唯一碳源 乳糖進(jìn)入細(xì)胞后被分解為半乳糖和葡萄糖 與乳糖代謝有關(guān)的三種酶 半乳糖苷酶 水解乳糖為半乳糖和葡萄糖 半乳糖苷透性酶 一種膜蛋白 協(xié)助乳糖穿膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi) 巰基半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶 將一個乙?；鶑囊阴］o酶A轉(zhuǎn)移到 半乳糖苷上 三種酶的編碼基因分別命名為lacZ lacY和lacA 統(tǒng)稱為結(jié)構(gòu)基因 在染色體上相連在一起 lacZ 編碼 半乳糖苷酶 galactosidase 四聚體 分解乳糖 乳糖 半乳糖 葡萄糖 半乳糖苷酶 lacY 編碼 半乳糖苷透性酶 permeasae 膜蛋白 將乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中 lacA 編碼 半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶 transacetylase 二聚體 把乙酰輔酶A上的乙?；D(zhuǎn)移到 半乳糖苷上 培養(yǎng)中C源不是乳糖時 三種酶在細(xì)胞內(nèi)的含量很低 只有幾個分子或不到 如果用乳糖代替葡萄糖 則在幾分鐘內(nèi) 每個cell轉(zhuǎn)錄出30 50個mRNA模板 產(chǎn)生3000多個 半乳糖苷酶分子 另兩種酶的量也迅速增加 一旦乳糖耗盡 三種酶的合成同時停止 這里 乳糖被當(dāng)作誘導(dǎo)物 并被 半乳糖苷酶催化分解 一些不能被該酶分解的半乳糖苷也可作為誘導(dǎo)物 如IPTG 異丙基 D 硫代半乳糖苷 IPTG有誘導(dǎo)效應(yīng)而本身不被分解 稱為安慰誘導(dǎo)物 gratuitousinducer constitutive不需誘導(dǎo) 持續(xù)地合成 誘導(dǎo)型的合成 如 半乳糖苷酶也可能產(chǎn)生組成型突變體mutant 乳糖操縱子模型有關(guān)的試驗(yàn)中 利用了 組成型突變體 部分二倍體技術(shù) 性導(dǎo) F 因子 組成型合成 JoshuaLederberg為了研究乳糖代謝的三個酶的基因 分離了大量的突變體 lac 并經(jīng)過遺傳作圖發(fā)現(xiàn)它們是緊密連鎖的 Z Y A 乳糖操縱子模型 同時發(fā)現(xiàn)它們是被同時誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的 雅科Jacob和莫諾Monod根據(jù)試驗(yàn)事實(shí)提出了操縱子模型operonmodel 認(rèn)為這三個酶的基因轉(zhuǎn)錄受一個開關(guān)單位的控制 操縱子模型 OperonModel 1960年 Jacob和Monod提出了操縱子模型 說明乳糖誘導(dǎo)代謝是一個負(fù)控制 negativecontrol 獲1965年Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎 操縱子模型對乳糖誘導(dǎo)效應(yīng)的解釋 LacI編碼了一個阻遏物 repressor 與結(jié)構(gòu)基因附近的一個 假想 位置 命名為operatorsite 結(jié)合 從而抑制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄 該阻遏物能變構(gòu) allosteric 即它還能與乳糖結(jié)合 改變構(gòu)像而喪失了與operatorDNA結(jié)合的能力 結(jié)構(gòu)基因才能夠轉(zhuǎn)錄表達(dá) 調(diào)節(jié)基因編碼的產(chǎn)物是一種蛋白質(zhì)分子 稱為阻遏物 當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)沒有乳糖時 阻遏物結(jié)合到操縱基因上 阻止了RNA聚合酶的通過 所以結(jié)構(gòu)基因得不到轉(zhuǎn)錄 培養(yǎng)基加入乳糖后 乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合 使阻遏物的構(gòu)象改變 阻遏物的構(gòu)象改變后 失去了與操縱基因結(jié)合的能力 阻遏物從操縱基因上解離下來 于是轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行 Jacob和Monod未提出啟動基因區(qū) RNA聚合物識別并結(jié)合的區(qū)域 P Promotor 又叫啟動子 后來由伊彭提出 啟動子 由兩個盒組成 以轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為 1 35的TTGACA盒是RNA聚合酶的識別位點(diǎn) 10的TATAAT盒 Pribnow盒 是RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn) 這樣 操縱子的概念 最初的操縱子 操縱基因 結(jié)構(gòu)基因 進(jìn)一步成為操縱子包括 啟動基因 操縱基因 結(jié)構(gòu)基因 操縱子 operon 功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因在染色體上成簇 cluster 排列 由一個共同的控制區(qū)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄 是原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基本單位 由結(jié)構(gòu)基因 structuralgenes 和上游相鄰的控制區(qū) regulatoryregion 組成 一個操縱子轉(zhuǎn)錄后形成一個多順反子mRNA polycistronic 對模型的遺傳學(xué)驗(yàn)證 組成型突變 constitutivemutants 沒有乳糖 代謝酶照樣合成 不需要誘導(dǎo) 遺傳作圖發(fā)現(xiàn) 這種突變 lacOc 的基因緊密連鎖在結(jié)構(gòu)基因的上游 operatorregion 另一個組成型突變 lacI 作圖的結(jié)果是在離結(jié)構(gòu)基因不遠(yuǎn)處 野生型 組成型突變 lacOc lacI 根據(jù)操縱子模型的原理 可以預(yù)測 模型預(yù)測 1 lacI基因產(chǎn)物是個可擴(kuò)散的 diffusible 蛋白 2 O區(qū) operatorregion 在調(diào)節(jié)過程中起作用 但不編碼產(chǎn)物 3 O區(qū)必須緊靠結(jié)構(gòu)基因 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 Pardee Jacob Monod設(shè)計了歷史性的實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)他們的模型的預(yù)測是否正確 1 實(shí)驗(yàn)原理 2 實(shí)驗(yàn)過程 通過F因子 給lacI 或lacOc的突變菌輸入野生型lacI或lacO基因 觀察其對 半乳糖苷酶活性的影響 實(shí)驗(yàn)1 組成型突變lacI lacZ F菌株F lacI lacZ 乳糖誘導(dǎo)型菌 說明F菌株的lacI 能彌補(bǔ)原菌株的lacI 缺陷 即 lacI對lacZ是反式作用 trans acting 組成型突變lacI lacOclacZ F菌株F lacI lacO lacZ 組成型表達(dá) 實(shí)驗(yàn)2 說明F菌株的lacO 不能彌補(bǔ)原菌株的lacOc缺陷 即 lacO對lacZ是順式作用 cis acting 實(shí)驗(yàn)3 lacI超突變 lacIs 編碼的阻遏物不能與乳糖結(jié)合 所以總是結(jié)合在O區(qū)的DNA上 使lacZ不能表達(dá) 野生型lacI lacZ F菌株超突變F lacIslacZ 組成型不表達(dá) 說明超突變lacIs編碼的阻遏物能作用于野生型菌操縱子的O區(qū) 利用超突變 操縱子模型的意義 Jacob和Monod1961年發(fā)表的操縱子理論是遺傳學(xué)的的一個里程碑 landmark 用遺傳分析結(jié)果推論出分子生物學(xué)模型并驗(yàn)證 暗示了蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的概念 描述了 阻遏物 的調(diào)節(jié)因子概念 盡管當(dāng)時并不知道它是蛋白質(zhì)還是RNA 當(dāng)時人們剛知道m(xù)RNA 對轉(zhuǎn)錄的細(xì)節(jié)一無所知 附 阻遏物的分離和鑒定 阻遏物的含量極少 每細(xì)胞不超過10份 直到1966年 WalterGilbert和BennoMuller Hill從lacI的超量突變菌株中 利用透析 dialysis 的方法 通過IPTG與阻遏物的結(jié)合作用 分離到了這個蛋白質(zhì) Gilbert及其同事又用放射自顯影證明它能與lacODNA結(jié)合 分離 鑒定 放射性標(biāo)記的阻遏物能與野生型O區(qū)結(jié)合 放射性標(biāo)記的阻遏物不能與突變型O區(qū)結(jié)合 Lac阻遏物的空間結(jié)構(gòu) 兩個bindingdomian 四聚體聚合區(qū) C N 一個四聚體聚合區(qū) 阻遏物與DNA的結(jié)合 i 電鏡觀察 Lacrepressor ii X ray分析 兩個單體結(jié)合在一個完整的lacO區(qū) 四聚體可以結(jié)合兩個lacO iii DNA測序分析 阻遏物所結(jié)合的DNA有26bp 5 21 位于RNA多聚酶結(jié)合部位的下游內(nèi)部 GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTT ATG mRNA protein RNApolbindingsite repressorbindingsite 對稱軸 乳糖操縱子的正調(diào)控 positivecontrol Jacob Monod模型沒能回答一個關(guān)鍵性的問題 為什么E coli在既含有葡萄糖 glucose 又含有乳糖的 lactose 的培養(yǎng)基 medium 中不啟動lac操縱子的轉(zhuǎn)錄 Answerstothisquestionemergedfrommolecularstudiescarriedoutlongafterpublicationoftheoperontheory 1 正調(diào)控因子 positiveregulator 在有些啟動子上 RNApol結(jié)合后并不能啟動轉(zhuǎn)錄 必須一個激活因子 正調(diào)節(jié)因子 的幫助才能打開DNA雙鏈 CAP是lacoperon的正調(diào)節(jié)因子 2 CAP的作用原理 cAMP CAP cAMP CAP復(fù)合體 cAMP CAP與lac操縱子啟動基因上的一個位置結(jié)合后 RNA聚合酶才能與啟動子結(jié)合 cAMP是由ATP經(jīng)過腺苷酸環(huán)化酶 Adenylcyclase 的作用形成 ATP cAMP Adenylcyclase 葡萄糖抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性 從而間接地抑制了Lac操縱子的轉(zhuǎn)錄 CAP cAMP系統(tǒng)在半乳糖和阿拉伯糖操縱子中也起作用 葡萄糖濃度 cAMP 葡萄糖濃度 cAMP 3 CAP與DNA的結(jié)合 lac操縱子中 CAP結(jié)合位點(diǎn)位于RNApol結(jié)合位點(diǎn)的上游 22bp 結(jié)合部位位置 不同的操縱子中 CAP的結(jié)合位置不同 operator CAP promotor 結(jié)構(gòu)基因 半乳糖 乳糖 阿拉伯糖 結(jié)構(gòu)基因 operator promotor CAP operator CAP promotor 結(jié)構(gòu)基因 以二聚體形式與DNA結(jié)合 使DNA彎曲90度 結(jié)合形式 TGTGAGTTAGCTCACACACTCAATCGAGTG 結(jié)合處DNA的保守序列 回文順序 每一部分結(jié)合一個