real time PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作.doc

熒光定量PCR之絕對定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Time：2010-05-17 PM 21:15Author:bioerHits:1. 絕對定量定義 絕對定量是用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知樣品的量。 將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同濃度，作為模板進行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測得的CT值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對未知樣品進行定量時，根據(jù)未知樣品的CT值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。*Log(起始濃度)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得到該擴增反應(yīng)存在的線性關(guān)系*由樣品CT值，就可以計算出樣品中所含的模板量2. 絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品的一些標(biāo)準(zhǔn)*必須用與擴增目的基因相同的引物進行擴增，并且擴增效率相同*標(biāo)準(zhǔn)品必須是經(jīng)過準(zhǔn)確定量的（我們通常用的是ASP-3700紫外光/可見光微量分光光度計）* 標(biāo)準(zhǔn)品必須是標(biāo)準(zhǔn)化的（例如，同一化的細(xì)胞數(shù)）* 在每組實驗時，必須用相同的閾值設(shè)定來確定CT值標(biāo)準(zhǔn)品可以是含有目的基因的線性化的質(zhì)粒DNA，也可以是比擴增片段長的純化后的PCR產(chǎn)物，當(dāng)然也可以是基因組DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作為標(biāo)準(zhǔn)品的核酸都必須保證穩(wěn)定。3. 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 一般一條標(biāo)準(zhǔn)曲線取四到五個點，濃度范圍要能覆蓋樣品的濃度區(qū)間，以保證定量的準(zhǔn)確性。一般一個點重復(fù)三至五次，對于常期穩(wěn)定使用的標(biāo)準(zhǔn)品可以適當(dāng)減少重復(fù)的次數(shù)。 倍比梯度稀釋方法：1v原液（標(biāo)準(zhǔn)品i）+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v依次倍比稀釋拷貝數(shù)的計算：詳見核酸拷貝數(shù)的計算4. 實例標(biāo)準(zhǔn)品的制作：將標(biāo)準(zhǔn)品依次進行10倍稀釋，ASP-3700 測得其拷貝數(shù)1.55108copy /ul 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1cycle=1min）設(shè)置對照：濃度為1.55107、1.55106、1.55105、1.55104、1.55103、1.55102、1.55101的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個，設(shè)空白對照PCR反應(yīng)：以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品作為模板 標(biāo)準(zhǔn)品的擴增曲線 標(biāo)準(zhǔn)品的溶解曲線標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 XLog7654 321 YCT值12.01 14.8917.92 21.1824.5627.89 31.25擴增效率（E）計算E=10-1/斜率=10-1/-3.23=2.04，E%=(2.04-1)100%=104% 若未知樣本的CT值為19.11，將CT值代入線性方程：即19.11=34.29-3.23X，所以X=(1