幾種MIC的測定方法.doc

幾種測定抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）的方法1濁度法1.1常量肉湯稀釋法（試管）1.1.1.抗菌藥物貯存液制備將抗菌肽稀釋到無菌水中，制成1024g/ml的原液，（也可以用0.22um濾膜進(jìn)行過濾，但要去掉前面5 ml的過濾抗菌肽溶液）。抗菌藥物貯存液濃度按照不同梯度稀釋。1.1.2.藥敏試驗(yàn)用抗菌藥物濃度范圍根據(jù)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，藥物濃度范圍應(yīng)包含耐藥、中介和敏感分界點(diǎn)值，特殊情況例外。1.1.3.培養(yǎng)基推薦使用LB肉湯培養(yǎng)基，pH7.07.4。指示菌為大腸桿菌或沙門氏菌。1.1.4.接種物的制備有2種方法配制接種物，一是細(xì)菌生長方法，用接種環(huán)挑取形態(tài)相似待檢菌落3-5個(gè)，接種于4-5ml的LB肉湯中，35孵育2-6 h。增菌后的對數(shù)生長期菌液用生理鹽水或LB肉湯培養(yǎng)基校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含12108CFU/ml。二是直接菌落懸液配制法，推薦直接取培養(yǎng)1824 h的菌落調(diào)配成0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液。用LB肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1100稀釋后備用。注意應(yīng)在15分鐘內(nèi)接種完配制好的接種物，并取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養(yǎng)，以檢查接種物純度。 1.1.5.稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種取無菌試管（13100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6ml LB肉湯外，其余每管加入LB肉湯1ml，在第1管加入抗菌藥物原液（如1024g/ml）0.4ml混勻，然后吸取1ml至第2管，混勻后再吸取1ml至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1ml棄去，第12管為不含藥物的生長對照。此時(shí)各管藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25g/ml。然后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1ml，使每管最終菌液濃度約為5105CFU/ml。第1管至第11管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125g/ml。（注：在稀釋的過程中，每次吸取1ml到下一管中后，要換掉槍頭，后面的方法相同）1.1.6.孵育將接種好的稀釋管塞好塞子，置37搖床培養(yǎng)1620h。1.1.7.結(jié)果判斷與解釋在讀取和報(bào)告所測試菌株的MIC前，應(yīng)檢查生長對照管的細(xì)菌生長情況是否良好，同時(shí)還應(yīng)檢查接種物的傳代培養(yǎng)情況以確定其是否污染，質(zhì)控菌株的MIC值是否處于質(zhì)控范圍。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細(xì)菌生長者，即為受試菌的MIC?；蛘哂梅止夤舛扔?jì)測定OD600，與未接菌的比對，判斷耐藥（resistant,R）、敏感(susceptible,S)或中介（intermediate,I）。1.2.微量肉湯稀釋法（酶標(biāo)板）1.2.1.抗菌藥物和培養(yǎng)基制備同常量肉湯稀釋法。1.2.2.MIC板制備無菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加藥液，每孔10l，藥物濃度分別為1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25g/ml。第12孔不加藥作為生長對照，如果當(dāng)時(shí)不使用，則冰凍干燥后密封，-20以下保存?zhèn)溆谩?.2.3.接種物制備將用生長法或直接菌懸液法制備的濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，經(jīng)LB肉湯11000稀釋后，向每孔中加90l，密封后置37搖床孵育1620h判斷結(jié)果。此時(shí)，第1孔至第11孔藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125g/ml。1.2.4.結(jié)果判斷以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC（用酶標(biāo)儀測得OD600）。當(dāng)陽性對照孔（即不含抗菌肽）內(nèi)細(xì)菌明顯生長試驗(yàn)才有意義。當(dāng)在微量肉湯稀釋法出現(xiàn)單一的跳孔時(shí)，應(yīng)記錄抑制細(xì)菌生長的最高藥物濃度。如出現(xiàn)多處跳孔，則不應(yīng)報(bào)告結(jié)果，需重復(fù)試驗(yàn)。通常對革蘭陰性桿菌而言，微量肉湯稀釋法測得的MIC與常量肉湯稀釋法測得的結(jié)果相同或低一個(gè)稀釋度（1孔或2倍）。2. 瓊脂稀釋法2.1 瓊脂稀釋法：瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌肽藥物，加入融化并冷至50左右的定量MH或LB瓊脂中，制成含不同遞減濃度抗菌藥物的平板，接種受試菌，孵育后觀察細(xì)菌生長情況，以抑制細(xì)菌生長的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。本法優(yōu)點(diǎn)是可在一個(gè)平板上同時(shí)作多株菌MIC測定，結(jié)果可靠，易發(fā)現(xiàn)污染菌；缺點(diǎn)是制備含藥瓊脂平板費(fèi)時(shí)費(fèi)力。2.1.1培養(yǎng)基和抗菌肽原液制備使用LB瓊脂，pH7.27.4。按照倍比稀釋法，分別配制12800、6400、3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5ug/mL的抗菌肽原液（如采用90%的抗菌肽，可以從3200ug/mL進(jìn)行稀釋）。2.1.2含抗菌肽瓊脂平板制備將配制好的LB液體培養(yǎng)基放入12個(gè)50mL三角瓶中，每個(gè)小三角瓶20ml液體培養(yǎng)基，每個(gè)三角瓶加入0.2g瓊脂粉，紗布封口后高壓滅菌。滅菌后，冷卻至并在5055（或至于該溫度水浴中），每個(gè)三角瓶培養(yǎng)基中加入200uL的抗菌肽原液，并設(shè)置一個(gè)對照（不加入抗菌肽原液），則三角瓶中的培養(yǎng)基抗菌肽濃度為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0ug/mL。充分混勻傾倒滅菌平皿，瓊脂厚度34mm。2.1.3.接種物制備與接種制備濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管的菌懸液，再110稀釋，以微量取液器將制備好菌液（約12l）接種于瓊脂平板表面，每點(diǎn)菌數(shù)約為104CFU/mL，形成直徑為58mm的菌斑。接種好后置37孵育1620h，觀察結(jié)果。2.1.4.結(jié)果判斷 將平板置于暗色、無反光物體表面上判斷試驗(yàn)終點(diǎn)，以抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC。 如果出現(xiàn)有2個(gè)以上菌落生長于含藥濃度高于終點(diǎn)水平的瓊脂平板上，或低濃度藥物瓊脂平板上不長而高濃度藥物瓊脂平板上生長現(xiàn)象，則應(yīng)檢查培養(yǎng)物純度或重復(fù)試驗(yàn)。2.2 瓊脂打孔法：2.2.1 如前面所示，配制256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25g/ml的抗菌肽溶液。2.2.2按照抑菌圈的操作方法制作抑菌圈（1） 菌種活化 將甘油菌平板劃線后，用牙簽挑取單菌落放入裝有5 mL LB 液體培養(yǎng)基的管試中，并于搖床內(nèi)37、200 rpm振蕩培養(yǎng)12h，后存放于4冰箱，備用。 （2） 于超凈工作臺內(nèi)，向每個(gè)滅菌培養(yǎng)皿中傾注10 mL-15 mL 的高壓滅菌過的素瓊脂（1.5%瓊脂）進(jìn)行鋪底，每個(gè)培養(yǎng)皿厚度均一，待素瓊脂冷卻凝固后，備用。（3） 吸取20 L-30 L指示菌菌液加入到100 mL 恒溫至505的LB固體培養(yǎng)基中，輕輕搖勻（避免起泡）。（4） 將上述加過菌液的固體培養(yǎng)基倒入鋪過素瓊脂的培養(yǎng)皿中，每個(gè)平皿倒5-7mL，該層一定要均勻鋪平，待其冷卻凝固。 （5） 用鑷子夾取牛津杯放在制好的抑菌圈培養(yǎng)皿內(nèi)，并在培養(yǎng)皿外延做好標(biāo)記。吸取150 L的待檢樣樣品注入到相應(yīng)的牛津杯內(nèi)，同時(shí)設(shè)立滅菌水為空白對照。（6） 將培養(yǎng)皿移入37 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在接下來的6-12 h 內(nèi)觀察菌體的生長情況及抑菌效果，一般8-12小時(shí)即可觀察到抑菌圈，但是不同指示菌及每次鋪制平板操作的不同，會有差別，要及時(shí)觀察。 2.2.3.結(jié)果判斷 觀察平板中的抑菌圈直徑，同時(shí)用無菌水作為對照，判斷最小抑菌濃度。例如：無菌水的直徑為9mm，稀釋0.25g/ml濃度時(shí)抑菌圈直徑為9mm，而0.5g/ml濃度時(shí)抑菌圈直徑為11mm，則可判斷其最小抑菌濃度為0.5g/ml。3. E試驗(yàn)（E-test） E試驗(yàn)是指濃度梯度瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，其原理基本同擴(kuò)散法，即濃度呈連續(xù)梯度的抗菌藥物從塑料試條中向瓊脂中擴(kuò)散，在試條周圍抑菌濃度范圍內(nèi)受試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。E試驗(yàn)綜合了稀釋法和擴(kuò)散法的原理和特點(diǎn)，同時(shí)還彌補(bǔ)了二者的一些不足，可以像稀釋法一樣直接定量測出抗菌藥物對受試菌的MIC。 3.1.培養(yǎng)基、菌液制備和接種 同紙片擴(kuò)散法。 3.2.貼E試驗(yàn)條 同紙片擴(kuò)散法，E