瓊脂糖凝膠的制備.doc

瓊脂糖凝膠的制備一、瓊脂糖凝膠的特點(diǎn)天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳，其優(yōu)點(diǎn)如下。1. 瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。2. 瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大（約占9899），近似自由電泳，樣品擴(kuò)散較自由電流，對(duì)樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。3. 瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測(cè)及定量測(cè)定。4. 電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測(cè)定。制成干膜可長(zhǎng)期保存。目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質(zhì)和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結(jié)合，發(fā)展成免疫電泳技術(shù)，能鑒別其他方法不能鑒別的復(fù)雜體系，由于建立了超微量技術(shù)，0.1ug蛋白質(zhì)就可檢出。瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內(nèi)切核酸酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設(shè)備簡(jiǎn)單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一。二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳對(duì)核酸的分離作用主要是依據(jù)它們的相對(duì)分子量質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時(shí)與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。1、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系 DNA分子的大小 在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與堿基對(duì)的對(duì)數(shù)成反比，因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離時(shí)行比較，便可測(cè)出未知片段的大小。但是當(dāng)DNA分子大小超過20kb時(shí)，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時(shí)電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時(shí)，分子大小不宜超過此值。 瓊脂脂糖的濃度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。表 瓊脂糖濃度與DNA分離范圍瓊脂糖濃度/0.30.60.70.91.21.52.0線狀DNA大小/kb605201100.870.560.440.230.12、核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗﹥r(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed circular，cccDNA）直線DNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí)，環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進(jìn)入膠中，相對(duì)遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長(zhǎng)軸方向前進(jìn)（Rm0），由此可見，這三種構(gòu)型的相對(duì)遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時(shí)，也受到電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度等的影響。3、電泳方法 凝膠類型用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型（平板型）。水平型電泳時(shí)，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因?yàn)樗颇z和加樣比較方便，電泳槽簡(jiǎn)單，易于制作，又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而較受歡迎。 緩沖液系統(tǒng)缺少離子時(shí)，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強(qiáng)度的緩沖液由于電流太大會(huì)大量產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)，會(huì)造成膠熔化和DNA的變性。常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TEA），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約為50mmol/L(pH7.57.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時(shí)稀釋到所需倍數(shù)。TAE緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。TBE濃溶液長(zhǎng)期貯存會(huì)出現(xiàn)沉淀，為避免此缺點(diǎn)，室溫下貯存5溶液，用時(shí)稀釋10倍0.5工作溶液即能提供足夠緩沖能力。 凝膠的制備以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。 樣品配制與加樣DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有0.25溴酚藍(lán)或其他指示染料，含有10-15蔗糖或510甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結(jié)果產(chǎn)生U形條帶，可改用2.5Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。 電泳瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實(shí)驗(yàn)條件的研究結(jié)果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場(chǎng)強(qiáng)度增加時(shí)，較大的DNA片段遷移率的增加相對(duì)較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不宜高于5V/cm。電泳系統(tǒng)的溫度對(duì)于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進(jìn)