谷胱甘肽的分離與制備.doc

谷胱甘肽的分離與制備摘要：谷胱甘肽（GSH）是一種活性功能性成分，具有良好的保健作用。本文介紹了GSH的生產(chǎn)現(xiàn)狀，綜述了GSH的分離制備方法。關(guān)鍵詞：谷胱甘肽（GSH）、分離、粗提、精制、高純度制備TheSeparation and Preparation of GlutathioneAbstract：Glutathione (GSH) is a function of active ingredient, which has a good health care. This article describes the production status of GSH, and overview the methods of separation and preparation of GSH.Keyword：Glutathione (GSH); separation; preparation; crude extraction; refined；preparation of high purity 谷胱甘肽是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的含巰基的生物活性三肽化合物, 以還原態(tài)(GSH)和氧化態(tài)(GSSG)兩種形態(tài)存在。GSH有多種生理功能, 對(duì)維持生物體內(nèi)適宜的氧化還原環(huán)境尤為重要, 臨床用于中毒性和感染性肝炎的治療、有機(jī)物及重金屬的解毒、癌癥輻射和化療的保護(hù)，而GSSG沒(méi)有生理功效，因此在分離時(shí)需要注意防止其氧化。目前GSH 的主要生產(chǎn)廠家有J. T. Baker、 BDH、 Fluka、 E. Merck、 Riedel- deHaen、 Sigma 及日本和光純藥等國(guó)外公司1 。實(shí)現(xiàn)GSH的國(guó)產(chǎn)化, 不僅可改變我國(guó)谷胱甘肽原料藥依賴進(jìn)口的局面, 而且對(duì)我國(guó)醫(yī)藥工業(yè)、臨床醫(yī)學(xué)和食品工業(yè)均具有重大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。值得注意的是2011年由江南大學(xué)生物發(fā)酵與分離實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立研制成功了高純度還原型、氧化型GSH生產(chǎn)工藝，項(xiàng)目在優(yōu)良菌種的選育、培養(yǎng)基組成的優(yōu)化、高密度發(fā)酵及GSH親和層析分離等方面取得了重大突破。生產(chǎn)出高純度還原型、氧化型谷胱甘肽，產(chǎn)品達(dá)到國(guó)外同類產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。項(xiàng)目已經(jīng)完成了中試，具備了產(chǎn)業(yè)化的條件。該項(xiàng)目的實(shí)施，打破GSH長(zhǎng)期被國(guó)外大公司壟斷生產(chǎn)的行業(yè)格局，實(shí)現(xiàn)國(guó)內(nèi)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)GSH零的突破。1. 谷胱甘肽的生產(chǎn)制備現(xiàn)狀2谷胱甘肽的生產(chǎn)方法很多，有化學(xué)合成法、萃取法、酶法和發(fā)酵法等。工業(yè)上則采取化學(xué)合成法來(lái)生產(chǎn)谷胱甘肽，即谷氨酸、半脫氨酸、甘氨酸縮合成谷胱甘肽。但是化學(xué)合成的谷胱甘肽是消旋體，分離十分困難，造成產(chǎn)品純度不同，其生物效價(jià)很難保持一致。目前谷膚甘膚的化學(xué)合成生產(chǎn)工藝已較成熟，但存在成本高、反應(yīng)步驟多、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、需光學(xué)拆分且存在環(huán)境污染等問(wèn)題。萃取法主要是從高含量谷胱甘肽的動(dòng)植物組織中提取所采用的一種方法，它是發(fā)酵法生產(chǎn)流程中的下游過(guò)程基礎(chǔ)。可以從鼠血，鼠肝和雞血，酵母，麥芽中提取GSH，但以酵母作原料居多。萃取法生產(chǎn)GSH所使用的溶劑可以是水、有機(jī)酸溶液和稀醇等。用以上方法制取GSH，純度和收率不高。其基本工藝如下：酶法合成由于酶促反應(yīng)具有催化專一性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)，因此國(guó)際上多采用此法生產(chǎn)。酶法生產(chǎn)就是利用生物體內(nèi)的天然谷胱甘肽合成酶，以谷胱甘肽的前體L-谷氨酸、L-半膚氨酸及甘氨酸為底物，并添加少量三磷酸腺普通過(guò)逆反應(yīng)合成谷胱甘肽。生物體酶法生產(chǎn)谷胱甘肽的研究?jī)?nèi)容主要包括選育高表達(dá)的生產(chǎn)菌株，固定化材料的選擇，怎樣構(gòu)建一個(gè)高效的ATP再生系統(tǒng)，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，改進(jìn)分離純化技術(shù)等。用固定化細(xì)胞(酶)作為GSH生物合成系統(tǒng)具有生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)化、生產(chǎn)效率提高等優(yōu)點(diǎn)。此外對(duì)于基因工程菌而言，固定化培養(yǎng)與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式相比也具有一定優(yōu)勢(shì)，如工程菌的穩(wěn)定性問(wèn)題有可能得到較好解決、在稀溶液體系中具有較高的細(xì)胞濃度、克隆可長(zhǎng)期生產(chǎn)、細(xì)胞可得到介質(zhì)的保護(hù)、有時(shí)無(wú)需進(jìn)行產(chǎn)物分離、反應(yīng)器中可積累高濃度產(chǎn)物、較好的傳質(zhì)特性、便于自動(dòng)控制等。其工藝流程如下：日本很早就對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽進(jìn)行了研究。發(fā)酵法生產(chǎn)GSH就是選育(或構(gòu)建)GSH合成能力強(qiáng)和胞內(nèi)含量高的微生物、篩選和優(yōu)化培養(yǎng)基配方、建立和優(yōu)化發(fā)酵控制策略、改進(jìn)和提高下游過(guò)程技術(shù)等，最終提高GSH的產(chǎn)率和質(zhì)量。但是發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的問(wèn)題是轉(zhuǎn)化效率低，是由于正常情況下微生物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平低，因此選育具有高谷膚甘膚合成能力的菌株是提高谷胱甘肽合成效率的關(guān)鍵。發(fā)酵法使用的一般是酵母，從酵母中提取谷膚甘膚的工藝流程如下：2. 谷胱甘肽的分離提取2.1 粗提粗提的方法有很多，主要有滲透法（如熱水抽提、甲酸抽提、乙酸抽提、硫酸抽提等）和對(duì)羥基苯甲酸丙酯法。邱雁臨等3比較了用滲透法（熱水）抽提和對(duì)羥基苯甲酸丙酯法提取谷胱甘肽，實(shí)驗(yàn)證明了滲透法抽提GSH 比對(duì)羥基苯甲酸丙酯法更優(yōu)越。而周楠迪等4比較了熱水抽提、甲酸抽提、乙酸抽提、硫酸抽提等抽提方法，得出結(jié)論：熱水抽提法從酵母中提取GSH的效率最高 ，耗時(shí)最少，經(jīng)濟(jì)、無(wú)污染，是從酵母中提取GSH的首選方案。王曉菊等5在熱水抽提實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)L9(43)正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)從巴斯德畢赤酵母提取還原型谷胱甘肽(GSH)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，得到了最佳提取條件：15 的物水質(zhì)量體積比，沸騰15 min，加入1%的高氯酸后靜置1.5 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在熱水沸騰15 min 后，溶液中GSH 含量為67 mg/100 mL；加入1%高氯酸后，GSH 平均濃度提高到152 mg/100 mL。加入的高氯酸主要是為了將細(xì)胞完全破碎，使胞內(nèi)的GSH 基本上全部釋放到水溶液中。但是需要注意的一點(diǎn)是，由于細(xì)胞內(nèi)的全部氨基酸、蛋白質(zhì)等溶于熱水中，提高了分離得到高純度GHS的難度。2.2 谷胱甘肽的精制：吳祥庭等6采用雙水相分配結(jié)合溫度誘導(dǎo)法分離谷胱甘肽, 收率可達(dá)80%, 但是GSH 與蛋白質(zhì)、氨基酸的分離效果不理想。由于電滲析具有分離條件比較溫和，適于工業(yè)化生產(chǎn)等，電滲析也成為分離GSH的方法之一。Takeshi Gotoh7等通過(guò)電滲析法分離GSH和谷氨酸取得了很好的效果，但是產(chǎn)率較低。為此他測(cè)定日本Selemion公司AMV型陰離子交換膜對(duì)GSH和谷氨酸的吸附情況發(fā)現(xiàn)，用DDT洗脫后，兩者的收率大大增加，說(shuō)明膜受到了GSH的污染，原因可能為GSH巰基與膜氧化后結(jié)合。這一缺點(diǎn)限制了電滲析法在GSH中的使用。之后Takeshi Gotoh8考慮要納濾分離谷胱甘肽。在酶法生產(chǎn)GSH時(shí)，由于酶催化存在平衡，這就需要將GSH及時(shí)從基液中分離出去。為此他考慮用NTR-7450納濾膜（磺化聚醚砜選擇性層，帶負(fù)電）對(duì)GSH以及相應(yīng)的L-谷氨酸，L-半胱氨酸，甘氨酸，L-谷氨酰胺等氨基酸進(jìn)行分離，從而使酶催化反應(yīng)得以持續(xù)進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)中，其研究了PH、二價(jià)金屬離子濃度、氨基酸濃度對(duì)納濾效果的影響。在單組分實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：NTR-7450膜對(duì)電解質(zhì)的排斥力與電解液中陰離子比率相關(guān)，并且隨著PH的變化而變化。在PH=7.4左右，GSH與這些氨基酸對(duì)膜的排斥力差異最大，對(duì)GSH的截留率達(dá)到100%，而對(duì)L -半胱氨酸，甘氨酸，L -谷氨酰胺的截留率低于30%。在二價(jià)金屬鹽存在的條件下，膜的截留率隨著鹽濃度的提高而下降，這可能是因?yàn)閹ж?fù)電的電解質(zhì)通過(guò)與金屬離子形成中復(fù)雜化合物而部分中和。在多組分系統(tǒng)中，在分別存在1.0, 2.0, 5.0mM 的L -谷氨酰胺，甘氨酸，L -半胱氨酸的條件下，不同濃度（0.1 到5.0mM）的GSH被膜完全阻隔，同時(shí)膜對(duì)氨基酸的排斥力隨著氨基酸濃度的升高而降低。這說(shuō)明納濾也許可以用于從酶作用底物、L -半胱氨酸，甘氨酸，L -谷氨酰胺中分離GSH。由于離子交換樹脂具有分離效果高、選擇性高、操作簡(jiǎn)單、成本低等特點(diǎn)，受到研究者的青睞，目前研究用離子交換樹脂分離GSH是最多的。胡曉梅9等研究0017 陽(yáng)離子交換樹脂分離純化谷胱甘肽的工藝條件，考察了0017 陽(yáng)離子交換樹脂對(duì)GSH 的靜態(tài)吸附量，以及洗脫時(shí)洗脫液種類、洗脫濃度、洗脫流速等對(duì)分離純化產(chǎn)品GSH 的影響。確定其工藝流程；最適上柱pH 為2.5，洗脫液NaC1 溶液最適洗脫濃度為1.2%，洗脫流速為2.0ml/min；收集洗脫液，用紫外分光光度法檢測(cè)其GSH 的濃度，回收率為75，純度相對(duì)提高60。 由于酵母提取液中含有大量的蛋白質(zhì)、肽類、氨基酸、核苷酸等多種雜質(zhì)，特別是一些寡肽和氨基酸，由于其結(jié)構(gòu)特征和性質(zhì)與GSH接近，往往會(huì)影響離子交換效果。王焱10等通過(guò)超濾除去一些大分子肽后再比較其在D001陽(yáng)離子交換樹脂上吸附效率后發(fā)現(xiàn)，吸附效率從原來(lái)的40%左右提高到70%以上。對(duì)于一般的離子交換樹脂而言，其選擇性并不高。而趙睿等11用大孔苯乙烯樹脂改性合成了含硫樹脂，通過(guò)其對(duì)GSH 的分離，純度可以達(dá)到90% , 且操作步驟簡(jiǎn)單。研究結(jié)果表明采用pH3.0 的緩沖液進(jìn)行吸附, 自制的含硫樹脂最大吸附容量可達(dá)22mg/ g濕樹脂, 選擇質(zhì)量濃度為0.5%的NaOH 溶液洗脫GSH, 解吸率可達(dá)70%以上。采用真實(shí)發(fā)酵液進(jìn)行分離純化, 收率為35%, 純度可達(dá)90% 以上。在這個(gè)基礎(chǔ)上，趙睿等12又考慮用金屬螯合親和色譜對(duì)GSH進(jìn)行分離。親和色譜的色譜柱為結(jié)合有Zn2+的硫脲柱，通過(guò)Zn2+與GSH特異性基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合，達(dá)到分離的目的，之后用硫脲洗脫得到產(chǎn)品。通過(guò)參數(shù)優(yōu)化后，收率為91.22%，純度為60.03%，并且用2mol/L的NaCl清洗流動(dòng)相可以清除雜質(zhì)對(duì)柱的非特異性結(jié)合，提高GSH的純度。2.3 高純度谷胱甘肽的制備傳統(tǒng)的高純度谷胱甘肽制備方法為銅鹽沉淀結(jié)晶法，卓肇文13等用碾碎的732離子交換樹脂，篩選60-80目組分用于吸附酵母熱抽提液中的GSH，之后用1mol/L的硫酸進(jìn)行洗脫，用新鮮的Cu2O沉淀CuGS。然后通入H2S，將銅離子去除，生成GSH。最后將含有GSH的溶液通N2減壓濃縮得到GSH結(jié)晶，總回收率為40%，含量為99%。但殘留的銅等重金屬離子會(huì)對(duì)GSH 造成污染, 不宜應(yīng)用在食品醫(yī)藥領(lǐng)域。隨著科技的進(jìn)步，色譜應(yīng)用的越來(lái)越廣泛。對(duì)于高效液相色譜（HPLC）和超壓薄薄層色譜，其具有分離程度高、檢測(cè)靈敏度高、選擇性好等特點(diǎn)，在很多的GSH分離方法中都將其作為含量測(cè)定基準(zhǔn)方法，用于評(píng)價(jià)其他方法分離效果14。但是由于它們的分離成本比較高，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，故在實(shí)際工業(yè)應(yīng)用上較少使用。而模擬移動(dòng)床色譜(Simulated Moving Bed Chromatography，簡(jiǎn)稱SMB)卻具有分離能力強(qiáng)、設(shè)備體積小、投資成本低、環(huán)境污染少、便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制等優(yōu)點(diǎn)，特別有利于分離熱敏性物質(zhì)及難分離的物系。該技術(shù)最早應(yīng)用于石化領(lǐng)域，近年來(lái)，越來(lái)越受到工業(yè)界和研究者的關(guān)注，在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究不斷深入15。日本早在上世紀(jì)80年代就開始研究應(yīng)用模擬移動(dòng)床色譜分離GSH和谷氨酸。HARUHIKO MAKI16等首先研究了其分離的數(shù)學(xué)模型和色譜條件，然后通過(guò)計(jì)算機(jī)控制獨(dú)特設(shè)計(jì)的多端口旋轉(zhuǎn)閥來(lái)定時(shí)切換有機(jī)溶劑流動(dòng)相的循環(huán)流動(dòng)方向，從而周期性改變物料的進(jìn)出口位置，以此來(lái)模擬固定相與流動(dòng)相之間的逆流移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)組分之間的連續(xù)分離。所用的色譜柱為陽(yáng)離子交換柱，用HCl洗脫，得到的純度和產(chǎn)率系數(shù)都可以達(dá)到99%，得到的GSH濃度和產(chǎn)率分別為單獨(dú)使用時(shí)的10倍和18倍，因此可以用于工業(yè)化分離高純度的GSH。3. 啟發(fā) 隨著人們生活水平的提高，谷胱甘肽(GSH)作為一種具有天然保健功能的功能性因子必將受到廣泛的關(guān)注。根據(jù)現(xiàn)有的研究報(bào)道，盡管已對(duì)谷胱甘肽生產(chǎn)菌的選育與改良、發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化控制等進(jìn)行了廣泛的研究，但是真正能夠?qū)嶋H生產(chǎn)應(yīng)用的比較少。為了提高發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的競(jìng)爭(zhēng)力,今后的研究工作應(yīng)集中于:(1)選育或通過(guò)基因重組的方法獲得GSH的高產(chǎn)酵母菌株,提高它的合成酶系的表達(dá)水平,并使之在胞內(nèi)大量積累; (2)發(fā)酵條件的對(duì)產(chǎn)率的影響，包括培養(yǎng)基的選擇、溫度、PH、氧氣等等; (3)GSH的分離方法的創(chuàng)新性改進(jìn);（4）加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)投入，將已有的研究成果盡快應(yīng)用于實(shí)踐，在實(shí)踐中不斷發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、解決問(wèn)題，摸索出一條經(jīng)濟(jì)效益高、污染小、能耗低的工藝路線，擺脫對(duì)國(guó)外公司的依賴。參考文獻(xiàn)：1潘飛, 邱雁臨. 離子交換樹脂純化還原型谷胱甘肽(GSH) 的研究J. 生物技術(shù), 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