間接免疫熒光.doc

間接免疫熒光法檢測(cè)Ad-LMP2表達(dá)EBV-LMP2蛋白的活性1 材料和儀器293細(xì)胞大鼠抗LMP2單克隆抗體FITC標(biāo)記山羊抗大鼠IgG抗體熒光顯微鏡2 檢測(cè)方法2.1 293細(xì)胞接種到24孔板中, 1.52.0105個(gè)細(xì)胞/孔，37，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞生長(zhǎng)成片。2.2 每個(gè)細(xì)胞孔感染2.0106VP供試品重組腺病毒，同時(shí)設(shè)置293細(xì)胞陰性對(duì)照孔。37，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)兩天，細(xì)胞完全病變。2.3 收集 293細(xì)胞。用PBS洗滌兩次，重懸到100lPBS緩沖液中，每孔10l涂于細(xì)胞片上，室溫自然晾干。2.4 將細(xì)胞片置于4丙酮中固定15分鐘，PBS洗兩次，室溫晾干。2.5 PBS浸泡10min，用PBS（含0.05%Triton-X100）浸泡通透25min。2.6 用10%胎牛血清室溫封閉40min。2.6 細(xì)胞孔使用1：20 PBS稀釋抗體，置于濕盒中，37孵育1小時(shí)。PBS洗89遍，保持濕潤(rùn)。2.7 覆蓋1：40稀釋的FITC標(biāo)記（PBS稀釋?zhuān)┑难蚩勾笫驣gG，置于濕盒中，37孵育30分鐘。PBS洗89遍，室溫晾干。(如用PBS有顆粒沉淀)2.8 伊文氏藍(lán)負(fù)染5分鐘。超純H2O洗3遍，室溫晾干。2.9 50%甘油封片。2.10 顯微鏡下觀察照相。3 結(jié)果判定顯微鏡下觀察陰性對(duì)照孔細(xì)胞呈紅色，供試品孔細(xì)胞可以看到明顯的綠色熒光，即判定為陽(yáng)性。檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。注：1、每一步均需晾干，細(xì)胞濃度可以比較高。2、水洗效果要好，無(wú)鹽粒子顆粒。3、丙酮固定過(guò)夜效果較好。PBS稀釋。當(dāng)然最好用封閉液直接稀釋?zhuān)偌右稽c(diǎn)TritonX100效果好。培養(yǎng)液成分太多了。而且固定之后細(xì)胞都死了，用培養(yǎng)液沒(méi)什么意義，只要保證其pH等條件適合就好了?？贵w說(shuō)明書(shū)上都會(huì)有推薦的稀釋倍數(shù)。上網(wǎng)查一下，有很多protocol。一般一比幾百到一萬(wàn)都有，依抗體而定。可以4度過(guò)夜，這樣染色效果好。二抗一般較便宜，一般1：50到1：200多。J1. 直接免疫熒光法測(cè)抗原（1）基本原理將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。（2）試劑與儀器l 磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4l 熒光標(biāo)記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋l 緩沖甘油：分析純無(wú)熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制l 搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）l 有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|）l 熒光顯微鏡l 玻片架l 濾紙l 37溫箱等。（3）實(shí)驗(yàn)步驟 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。 滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其完全覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一定時(shí)間（參考：30min）。 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過(guò)0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時(shí)振蕩。 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，一般可用“+”表示：（-）無(wú)熒光；（）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見(jiàn)；（+）熒光明亮；（+ +）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“+”以上，而各種對(duì)照顯示為（）或（-），即可判定為陽(yáng)性。（4）注意事項(xiàng)1)對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋?zhuān)ＷC抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過(guò)1：20，抗體濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過(guò)弱，影響結(jié)果的觀察。2)染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時(shí)間可以從10 min到數(shù)小時(shí)，一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25左右），高于37可加強(qiáng)染色效果，但對(duì)不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2的低溫，延長(zhǎng)染色時(shí)間。低溫染色過(guò)夜較3730 min效果好的多。3)為了保證熒光染色的正確性，首次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。 標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。 特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。 陽(yáng)性對(duì)照：已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光，陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽(yáng)性染色。4)一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò)3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。2.間接免疫熒光法測(cè)抗體（1）基本原理染色程序分為兩步，第一步，用未知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原標(biāo)本上，在濕盒中37保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。第二步，加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG抗體。如果第一步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會(huì)和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體。（2）試劑與儀器l 磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4l 緩沖甘油：分析純無(wú)熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。l 熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋 。l 搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）l 有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|）l 熒光顯微鏡l 玻片架l 濾紙l 37溫箱等。（3）實(shí)驗(yàn)步驟1)滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去，使標(biāo)本片保持一定濕度。2)滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本，覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37保溫30min。3)取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過(guò)0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時(shí)振蕩 。4)取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。5)將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37保溫30min。6)重復(fù)操作3。7)取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。8)熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法。（4）注意事項(xiàng)1)熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4保存4h，時(shí)間過(guò)長(zhǎng) ，會(huì)使熒光減弱。2)每次試驗(yàn)時(shí) ，需設(shè)置以下三種對(duì)照： 陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物 陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物 熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物3. 已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤(rùn)，避免干燥。4. 所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。For immunof luorescence analysis, cells wer