轉(zhuǎn)錄因子PPT課件.ppt

轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 還有的蛋白質(zhì)因子可特異識(shí)別 結(jié)合自身基因的調(diào)節(jié)序列 調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá) 稱順式作用 由某一基因表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)因子 通過(guò)與另一基因的特異的順式作用元件相互作用 調(diào)節(jié)其表達(dá) 這種調(diào)節(jié)作用稱為反式作用 反式調(diào)節(jié) 順式調(diào)節(jié) 圖13 3反式與順式作用蛋白 指真核生物基因組中含有可以調(diào)控自身基因表達(dá)活性的特異DNA序列 順式作用元件能夠被特異轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別和結(jié)合 從而影響基因表達(dá)活性 順式作用元件的作用是參與基因表達(dá)的調(diào)控 本身不編碼任何蛋白質(zhì) 僅僅提供一個(gè)作用位點(diǎn) 要與反式作用因子相互作用而起作用 1順式作用元件 cis actingelement 真核生物 順式作用元件 按功能特征 真核基因順式作用元件分為 啟動(dòng)子 promoter 增強(qiáng)子 enhancer 沉默子 silencer 1 1啟動(dòng)子 真核基因啟動(dòng)子是RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)周圍的一組轉(zhuǎn)錄控制組件 至少包括一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)以及一個(gè)以上的功能組件 位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)附近 是促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄的DNA序列 又稱分子內(nèi)作用元件 是DNA分子上可與RNA聚合酶結(jié)合并使之轉(zhuǎn)錄的部位 但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄 生物中有許多啟動(dòng)子 如E coli約有2000個(gè)啟動(dòng)子 各啟動(dòng)子的效率可不相同 E coli的強(qiáng)啟動(dòng)子每2秒鐘啟動(dòng)一次轉(zhuǎn)錄 而弱啟動(dòng)子每10分鐘才啟動(dòng)一次 從百多個(gè)大腸桿菌啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的分析 得知兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子的同源序列的中心在轉(zhuǎn)錄起始部位 基因編碼鏈上第一個(gè)核苷酸 5 側(cè)約10和35個(gè)核苷酸處 弱啟動(dòng)子序列中往往有多處核苷酸被置換 根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類 組成型啟動(dòng)子 組織或器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 由兩部分組成 核心啟動(dòng)子 CPE 指保證RNApol 轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的 最少的DNA序列 包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游 25 30bp的TATA盒 它單獨(dú)起作用時(shí) 只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄 上游啟動(dòng)子元件 UPE 包括通常位于 70bp附近的CAAT盒 GC盒等 能通過(guò)TF D復(fù)合物調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率 提高轉(zhuǎn)錄效率 并非任何細(xì)胞型特異的蛋白在任何情況下都起作用 而是取決于核心啟動(dòng)子提供一個(gè)合適的環(huán)境來(lái)決定基因是被激活還是被抑制 構(gòu)建多個(gè)啟動(dòng)子連接多個(gè)基因的表達(dá)載體 雖然可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)轉(zhuǎn)入多個(gè)基因的愿望 但這種載體一方面構(gòu)建困難 另一方面如果引入的啟動(dòng)子之間僅僅有90bp的同源性順序 導(dǎo)入生物體內(nèi) 就會(huì)引起所謂的基因表達(dá) 共抑制 現(xiàn)象 而使基因沉默 因此 將極性啟動(dòng)子人工改造為高效雙向表達(dá)的啟動(dòng)子 對(duì)于促進(jìn)基因工程的進(jìn)展具有重要意義 有研究表明 將單向極性植物表達(dá)啟動(dòng)子改造為能夠雙向表達(dá)的啟動(dòng)子對(duì)于植物基因工程研究和應(yīng)用具有不可估量的作用 其應(yīng)用前景十分廣闊 Promoterelementsaredefinedbymutationsandfootprinting 用突變法和印跡試驗(yàn)法確定啟動(dòng)子元件 在合適的體外或體內(nèi)檢驗(yàn)系統(tǒng)中 啟動(dòng)子是根據(jù)其附著序列產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄的能力來(lái)進(jìn)行定義的 通過(guò)從一側(cè)逐段缺失來(lái)確定啟動(dòng)子的邊界 當(dāng)一段缺失不會(huì)阻礙RNA合成 而下一段缺失使轉(zhuǎn)錄不再發(fā)生時(shí) 那么我們可以確定啟動(dòng)子的邊界必然存在于兩者之間 啟動(dòng)子克隆的幾種方法 啟動(dòng)子的克隆對(duì)于構(gòu)建基因工程載體 表達(dá)目的蛋白有著重要的意義 啟動(dòng)子克隆的方法很多 從常用的利用啟動(dòng)子探針型載體篩選啟動(dòng)子到PCR方法的應(yīng)用 此后相繼問(wèn)世的一些基于PCR法的克隆啟動(dòng)子技術(shù) 像I PCR P PCR SSP PCR YADE TAIL PCR等 為克隆啟動(dòng)子提供了更可靠 更合理的方法 利用啟動(dòng)子探針載體篩選啟動(dòng)子利用啟動(dòng)子探針載體篩選啟動(dòng)子的過(guò)程為 先選用1種適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶消化切割染色體DNA 然后將切割產(chǎn)生的DNA限制片段群體與無(wú)啟動(dòng)子的探針質(zhì)粒載體重組 并按照設(shè)計(jì)的要求使克隆的片段恰好插在緊鄰報(bào)告基因的上游位置 隨后再把重組混合物轉(zhuǎn)化給寄主細(xì)胞 構(gòu)建質(zhì)粒載體基因文庫(kù) 并檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)活性 利用PCR技術(shù)克隆啟動(dòng)子即根據(jù)發(fā)表的基因序列 設(shè)計(jì)引物 克隆基因的啟動(dòng)子 由于PCR法簡(jiǎn)便快捷 近年來(lái)人們較多采用此方法克隆基因啟動(dòng)子 蘇寧等根據(jù)已報(bào)道的水稻葉綠體16SrRNA啟動(dòng)子基因序列設(shè)計(jì)5 啟動(dòng)子序列的引物 以水稻葉綠體DNA為模板 PCR擴(kuò)增出16SrRNA基因5 啟動(dòng)子區(qū)的片段 酶切克隆到pSK的SacI和SphI位點(diǎn) 構(gòu)建測(cè)序載體質(zhì)粒pZ16S 進(jìn)行序列測(cè)定 結(jié)果表明所克隆的片段長(zhǎng)為144bp 含有SD序列 同源比較結(jié)果表明 所克隆的片段與水稻葉綠體16SrRNA啟動(dòng)子序列具有100 的同源性 環(huán)狀PCR環(huán)狀PCR包括I PCR Inverse PCR 和P PCR Panhandle PCR 這2種PCR都是根據(jù)一端已知序列設(shè)計(jì)的嵌套式引物進(jìn)行PCR I PCR的實(shí)驗(yàn)程序包括 基因組DNA經(jīng)酶切后用T4DNA連接酶進(jìn)行自連接 產(chǎn)生環(huán)狀DNA片段 以環(huán)化產(chǎn)物為底物 用根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 從而得到含有未知片段的擴(kuò)增產(chǎn)物P PCR是由Jones等提出的利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成環(huán)狀單鏈模板 有效增強(qiáng)了引物與模板結(jié)合的特異性 反應(yīng)需要3個(gè)根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的引物 3個(gè)引物在已知序列內(nèi)呈線性排列 其中第3個(gè)引物可作為接頭使用 可與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成鍋柄狀單鏈模板 其過(guò)程為 首先酶切基因組DNA 產(chǎn)生5 或3 粘末端 然后連接上合適的接頭 primer3 連接好后最好用核酸外切酶I除去多余的接頭 由于連接上的接頭與已知序列是反向重復(fù)序列 變性后的DNA單鏈可退火形成鍋柄狀單鏈模板 之后分別用3個(gè)單引物進(jìn)行3次PCR擴(kuò)增 能有效地?cái)U(kuò)增2 9kbp的大片段未知序列 利用載體或接頭的染色體步行技術(shù)克隆基因啟動(dòng)子這類方法的第一步都是酶切基因組DNA 連接載體或接頭 既可以用pUCl8等質(zhì)粒載體 也可以使用 DNA等噬菌體載體 只要選用的載體帶有合適的酶切位點(diǎn) 同樣根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要 接頭既可以是雙鏈也可以是單鏈 然后根據(jù)基因組DNA序列設(shè)計(jì)的特異引物和載體的通用引物或接頭序列進(jìn)行擴(kuò)增 TAlL PCR很早就有用隨機(jī)引物的PCR 但由于無(wú)法有效地控制由隨機(jī)引物引發(fā)的非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生 所以一直未能廣泛應(yīng)用 近年來(lái)由IJiu等設(shè)計(jì)的TAIL PCR TermalAsymmetricInterlacedPCR 又叫熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR 則解決了這個(gè)問(wèn)題 后來(lái)有研究表明 經(jīng)改良過(guò)的TAIL PCR成功地從突變體中克隆到外源插入基因的旁側(cè)序列 從而為啟動(dòng)子的克隆提供了有效的新方法 TAIL PCR的基本原理是利用目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物 specialprimer 簡(jiǎn)稱sp1 sp2 sp3 約20bp 用它們分別和1個(gè)具有低Tm值的短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物 Arbitrarydegenerateprime AD 約14bp 相組合 以基因組DNA為模板 根據(jù)引物的長(zhǎng)短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對(duì)稱的溫度循環(huán) 通過(guò)分級(jí)反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增特異引物 與啟動(dòng)子功能變異有關(guān)的疾病 以下是從人類孟德?tīng)栠z傳學(xué) OMIM 證實(shí)與啟動(dòng)子故障有關(guān) 不論是因啟動(dòng)子序列直接突變或是轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄共激發(fā)因子的突變 哮喘 地中海貧血 魯賓斯坦泰比綜合癥等 啟動(dòng)子的優(yōu)化關(guān)于啟動(dòng)子的優(yōu)化 可將所有的影響因素和其水平列一個(gè)表 選擇合適的正交表去做 另外關(guān)鍵的幾個(gè)區(qū)域如TATABox等是不能動(dòng)的 然后看增強(qiáng)子等順式元件及阻遏 誘導(dǎo)蛋白接合區(qū)域的情況 進(jìn)行缺失突變和置換突變 等等 特點(diǎn) 1 它能通過(guò)啟動(dòng)子大幅度地增加同一條DNA鏈上靶基因轉(zhuǎn)錄的頻率 一般能增加10 200倍 有的甚至可達(dá)千倍 2 增強(qiáng)子的作用對(duì)同源或異源的基因同樣有效 如把SV40的增強(qiáng)子連接到兔 珠蛋白的基因上 可使轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度增大100倍 3 增強(qiáng)子的位置可在基因5 上游 基因內(nèi)或其3 下游的序列中 增強(qiáng)效益與其位置和取向無(wú)關(guān) 4 增強(qiáng)子所含核苷酸序列大多為重復(fù)序列 其內(nèi)部含有的核心序列 對(duì)于它進(jìn)入到另一宿主之后重新產(chǎn)生增強(qiáng)子效應(yīng)至關(guān)重要 5 增強(qiáng)子一般都具有組織和細(xì)胞特異性 6 增強(qiáng)子在DNA雙鏈中沒(méi)有5 與3 固定的方向性 7 增強(qiáng)子可遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) 通常在1 4kb 個(gè)別情況可達(dá)30kb 外起作用 8 增強(qiáng)子的活性與其在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的空間方向性有關(guān) 另外 許多增強(qiáng)子還受到外部信號(hào)的調(diào)控 如金屬硫蛋白基因的增強(qiáng)子就可對(duì)環(huán)境中的鋅 鎘濃度作出反應(yīng) 從機(jī)能上講 沒(méi)有增強(qiáng)子存在 啟動(dòng)子通常不能表現(xiàn)活性 沒(méi)有啟動(dòng)子時(shí) 增強(qiáng)子也無(wú)法發(fā)揮作用 有時(shí) 對(duì)結(jié)構(gòu)密切聯(lián)系而無(wú)法區(qū)分的啟動(dòng)子 增強(qiáng)子樣結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱啟動(dòng)子 通常描述的 具有獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄活性和決定基因時(shí)間 空間特異性表達(dá)能力的啟動(dòng)子就是這類定義的啟動(dòng)子 2反式作用因子 trans actingfactor 指能直接或間接識(shí)別和結(jié)合在順式作用元件上 調(diào)控靶基因表達(dá)的蛋白質(zhì)因子 也稱為轉(zhuǎn)錄因子 transcriptionalfactor TF 所有細(xì)胞中的DNA都是一樣的 但基因調(diào)控保證了每種細(xì)胞的特異性蛋白質(zhì)會(huì)在正確的時(shí)間出現(xiàn)在正確的地點(diǎn) 控制這個(gè)過(guò)程的蛋白質(zhì)就是轉(zhuǎn)錄因子 蛋白質(zhì) DNA 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)相互作用 interaction 是其發(fā)揮功能的基礎(chǔ) 基本轉(zhuǎn)錄因子 非特異轉(zhuǎn)錄因子 參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)錄激活因子 DNA 蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)錄抑制因子共調(diào)節(jié)因子 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì) 特點(diǎn) 至少含3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域 DNA結(jié)合功能域 轉(zhuǎn)錄活性功能域 其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合功能域 能識(shí)別并結(jié)合上游調(diào)控區(qū)中的順式作用元件 對(duì)基因表達(dá)有正性或負(fù)性調(diào)控作用 即激活或阻遏基因表達(dá) 目前研究較廣泛的有 識(shí)別TATA區(qū)的TF D 識(shí)別CAAT區(qū)的CTF 識(shí)別GGGCGG的SP1 識(shí)別熱激蛋白啟動(dòng)區(qū)的HSF 2 1按功能特性分為 2 1 1基本轉(zhuǎn)錄因子 generaltranscriptionfactors 是RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子所必需的一組蛋白因子 決定三種RNA mRNA tRNA及rRNA 轉(zhuǎn)錄的類別 包括TF A TF B TF D TF E TF F TF H TF I等7種因子 真核RNA聚合酶 在轉(zhuǎn)錄因子幫助下 形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物 2 1 2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 specialtranscriptionfactors 與增強(qiáng)子或各類應(yīng)答元件等順式元件結(jié)合 具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性的一類功能蛋白 種類繁多 功能復(fù)雜 是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的靶分子 為個(gè)別基因轉(zhuǎn)錄所必需 決定該基因的時(shí)間 空間特異性表達(dá) 如調(diào)控免疫球蛋白表達(dá)的核內(nèi)蛋白質(zhì)因子 NF 轉(zhuǎn)錄激活因子 起轉(zhuǎn)錄激活作用 通常是一些增強(qiáng)子結(jié)合蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)錄抑制因子 起轉(zhuǎn)錄抑制作用 多數(shù)是沉默子結(jié)合蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)構(gòu) 具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子 如核受體家族 具有堿性DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子超家族 如堿性亮氨酸拉鏈 bZIP 轉(zhuǎn)錄因子 AP 1 ATF CREB等 具有螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋 HTH 結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子 其他 如NF B家族 STAT家族 P53家族等 許多轉(zhuǎn)錄因子以同二聚體和異二聚體的形式發(fā)揮作用 所以它們據(jù)此可進(jìn)一步細(xì)分成亞家族 正是由于許多轉(zhuǎn)錄因子能異二聚體化 從而極大地增加了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的多樣性和特異性 2 2按DNA結(jié)合域的結(jié)構(gòu)分為 2 2 1鋅指 zincfinger 鋅指結(jié)構(gòu) DNA結(jié)合域中含較多的半胱氨酸和組氨酸的區(qū)域借肽鏈彎曲使2個(gè)組氨酸與2或4個(gè)半胱氨酸與1個(gè)鋅絡(luò)合成的指狀結(jié)構(gòu) 具有鋅指結(jié)構(gòu)的反式因子都含有幾個(gè)相同的指結(jié)構(gòu) 其指尖部插入DNA雙螺旋深 淺溝中 調(diào)控相應(yīng)基因 羧端無(wú)指 功能是與RNApol 或其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 常結(jié)合GC盒C CysH His C2H2型鋅指 Zincfinger Zn Cys His 2 2 2亮氨酸拉鏈 leucinezipper bZIP 亮氨酸拉鏈 是DNA結(jié)合域中約30個(gè)氨基酸組成的核心序列 N段富含堿性氨基酸 形成DNA結(jié)合面 另一側(cè)每隔6個(gè)氨基酸殘基出現(xiàn)1個(gè)亮氨酸殘基 稱亮氨酸拉鏈區(qū) 兩個(gè)具有亮氨酸拉鏈區(qū)的反式作用以疏水作用形成亮氨酸拉鏈 亮氨酸拉鏈的空間構(gòu)象使反式因子堿性區(qū)域處于能與DNA結(jié)合的空間位置 是蛋白質(zhì)二聚體化 蛋白質(zhì)相互作用的一種方式 的一種結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)通過(guò)亮氨酸拉鏈形成二聚體 大大增加對(duì)DNA的結(jié)合能力 調(diào)控基因表達(dá) 2 2 3螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋 helix turn helix 有至少兩個(gè) 螺旋區(qū) 中間有短側(cè)鏈氨基酸殘基形成轉(zhuǎn)折 同源域蛋白通過(guò)其第三個(gè)螺旋與雙鏈DNA的大溝相結(jié)合 其N端的多余臂部分則與DNA小溝結(jié)合 提高了穩(wěn)定性 2 2 4螺旋 環(huán) 螺旋 helix loop helix HLH 結(jié)構(gòu) 是含100 200個(gè)氨基酸殘基的肽段 有2個(gè) 螺旋區(qū) 附近有1段富含堿性氨基酸區(qū)組成 螺旋區(qū)是形成二聚體必須的 堿性氨基酸區(qū)是結(jié)合DNA必需的 HLH類蛋白只有形成同源 異源二聚體時(shí) 才具有足夠的DNA結(jié)合能力 2 3共調(diào)節(jié)因子 co regulators 或輔因子位于細(xì)胞核內(nèi) 通常不直接與DNA結(jié)合 但能與轉(zhuǎn)錄因子作用 可在通用轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子間起架橋作用 并可改變局部染色質(zhì)的構(gòu)象 促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄 根據(jù)共調(diào)節(jié)因子對(duì)轉(zhuǎn)錄激活作用的影響 可分為共激活因子和共抑制因子兩大類 共激活因子 co activators CoA 具有組蛋白乙?；?histoneacetyltransferase HAT 的活性或能與HAT結(jié)合 HAT能使組蛋白乙?；?導(dǎo)致纏繞核小體的DNA解旋 DNA模板裸露 使TF容易與DNA結(jié)合 從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄 共抑制因子 co repressors 能與組蛋白脫乙?；?histonedeacetylase HDCA 結(jié)合 通過(guò)后者使組蛋白去乙?；?從而抑制基因轉(zhuǎn)錄 2 4轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用方式 通過(guò)二聚化 多聚化 磷酸化激活與順式元件結(jié)合與基本轉(zhuǎn)錄因子相互作用與DNA結(jié)合后 轉(zhuǎn)錄因子須進(jìn)一步與基本轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用才能表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性輔助因子的參與 線粒體轉(zhuǎn)錄因子A的研究進(jìn)展 線粒體轉(zhuǎn)錄因子A mitochondrialtranscriptionfactorA TFAM 是參與線粒體DNA轉(zhuǎn)錄激活和調(diào)節(jié)線粒體DNA拷貝數(shù)的重要因子 TFAM由核基因編碼 并被轉(zhuǎn)入線粒體內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用 除了轉(zhuǎn)錄激活作用外 TFAM還參與維持線粒體DNA mitochondrialDNA mtDNA 的拷貝數(shù) 改善線粒體功能以及調(diào)控肌漿網(wǎng)鈣ATP酶表達(dá)等 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用機(jī)制 3 常見(jiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子及其功能 cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白CREB激活蛋白 1 activatorprotein 1 AP 1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子STAT核因子 B NF B 3 1CREB家族 家族成員有CREB ATF1 CREM二聚化形成亮氨酸拉鏈與DNA結(jié)合 調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)是cAMP和鈣調(diào)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的最終靶分子 結(jié)合的順式元件序列一般為5 TGACGTCA 3 稱為cAMP應(yīng)答元件 CRE 主要存在于基因的啟動(dòng)子與增強(qiáng)子上 cAMP激活PKA后 可解離出2分子催化亞單位 使CREB第133位的絲氨酸殘基磷酸化 胞外Ca2 內(nèi)流或從細(xì)胞內(nèi)貯存庫(kù)釋放Ca2 時(shí) 也引起CREB第133位的絲氨酸殘基磷酸化磷酸化的CREB與CRE回文序列結(jié)合 調(diào)控基因的表達(dá) CREB 3 2AP 1 Fos Jun AP 1是即早基因家族c fos和c jun的蛋白產(chǎn)物Fos和Jun結(jié)合成的異源二聚體 或Jun的同源二聚體 前者活性高于后者AP 1順式元件序列為TGACTCA 以亮氨酸拉鏈與DNA結(jié)合 引起細(xì)胞增生 分化等效應(yīng)AP 1繼cAMP和Ca2 后 起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中介作用 因此也被稱為第三信使AP 1二聚體也是親電子應(yīng)答元件EPRE的識(shí)別因子 O2 H2O2的形成可同時(shí)激活NF B和AP 1 誘導(dǎo)膠原酶和金屬硫蛋白的表達(dá) 3 3STAT家族Signaltransducersandactivatorsoftranscription STAT家族包括STAT1 6 氨基酸數(shù)目為734 851 主要差別在C末端 STAT分子含有幾個(gè)高度保守的功能區(qū)STAT二聚體形成亮氨酸拉鏈與DNA結(jié)合STAT對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)起重要作用可被IFN 生長(zhǎng)因子 血管緊張素 IL 6 IL 10等活化可被IFN IFN 活化誘導(dǎo)各種急性相的應(yīng)答基因表達(dá)被IL 2活化 促進(jìn)Th1細(xì)胞分化被IL 4活化 介導(dǎo)MHC 抗原 各類Ig類受體及其他細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的向上調(diào)節(jié) IL是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類細(xì)胞因子 由于最初是由白細(xì)胞產(chǎn)生又在白細(xì)胞間發(fā)揮作用 所以由此得名 STAT家族的活化 細(xì)胞因子及催乳素與其受體結(jié)合 激活受體偶聯(lián)型酪氨酸蛋白激酶JAK家族成員 后者使STAT分子中的Tyr殘基磷酸化 進(jìn)而形成活化的二聚體 穿過(guò)核膜結(jié)合到特定DNA序列上調(diào)節(jié)基因表達(dá) 稱為JAK STAT途徑生長(zhǎng)因子的跨膜受體具有酪氨酸蛋白激酶活性 與相應(yīng)生長(zhǎng)因子結(jié)合后 可直接使STAT磷酸化血管緊張素 受體與G蛋白偶聯(lián) 可能通過(guò)G蛋白使STAT磷酸化 JAK STAT途徑 JAK即JanusKinase 兩面神激酶 是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶 PTK 該族成員有7個(gè)同源區(qū) JH1 7 其中JH1區(qū)為激酶區(qū) JH2區(qū)為偽激酶區(qū) 與其它PTK不同 JAK內(nèi)無(wú)Src同源區(qū)2 SH2 結(jié)構(gòu) 因其既能催化與之相連的細(xì)胞因子受體發(fā)生酪氨酸磷酸化 又能磷酸化多種含特定SH2區(qū)的信號(hào)分子從而使其激活 故稱之為Janus 羅馬神話中前后各有一張臉的門神 STAT即Signaltransducersandactivatorsoftranscription 信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子 含有SH2和SH3結(jié)構(gòu)域 可與特定的含磷酸化酪氨酸的肽段結(jié)合 當(dāng)STAT被磷酸化后 發(fā)生聚合成為活化的轉(zhuǎn)錄激活因子形式 進(jìn)入胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合 促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄 該途徑的基本作用模式 配體誘發(fā)相應(yīng)受體形成二聚體或寡聚體 引起與受體結(jié)合的JAK相互作用 發(fā)生自身酪氨酸磷酸化而激活 同時(shí)催化受體發(fā)生酪氨酸磷酸化 繼而以這些磷酸化的酪氨酸為 錨點(diǎn) 招引多種含特定SH2區(qū)的信號(hào)分子 并將其活化 通過(guò)這些分子的作用使胞外信號(hào)傳入胞核內(nèi) MAPK與JAK STAT途徑 MAPK即絲裂原激活的蛋白激酶 Mitogenactivatedproteinkinase 是Ras途徑中的下游信號(hào)分子 具有絲氨酸 蘇氨酸蛋白激酶活性 可激活C Fos C Jun等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 形成AP 1作用于核內(nèi) 激活特定的基因從而傳遞信號(hào) MAPK的激活需要其分子中特定的Tyr殘基和Ser殘基同時(shí)被磷酸化 以前認(rèn)為 Ras途徑與JAK途徑雖共存于細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)中 但互相獨(dú)立 最近發(fā)現(xiàn) MAPK可能處于調(diào)節(jié)這兩條途徑的關(guān)鍵位置 JAK的激活伴有MAPK的活化 但僅有JAK激活不足以使STAT最大程度地發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活活性 Stat3在傳導(dǎo)信號(hào)時(shí)不僅發(fā)生了Tyr殘基磷酸化 同時(shí)還有Ser殘基磷酸化 且磷酸化的Ser殘基為與DNA上的調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合所必需 STAT蛋白上存在可被MAPK識(shí)別且磷酸化的特異性序列 與Stat3類似 Stat1也必需有Ser殘基磷酸化才能完全活化 非受體型酪氨酸蛋白激酶 PTK SH PTP1的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用 SH PTP1即含SH2區(qū)的酪氨酸磷酸酶 PTPase1 PTPase分為跨膜型與非跨膜型兩種 SH PTP1和2都屬于后者 SH PTP2參與受體型PTK介導(dǎo)的信號(hào)傳遞 可看作是一種正的信號(hào)傳遞分子 SH PTP1則主要對(duì)PTK介導(dǎo)的信號(hào)傳遞起抑制作用 已知IL 3和EPO都主要通過(guò)JAK2傳導(dǎo)信號(hào) EPOR上第429位酪氨酸在EPO作用后被JAK磷酸化 從而具備了結(jié)合SH PTP1并使之活化的能力 這一作用的特異性取決于該殘基周圍特定的氨基酸序列 即PY Leu Tyr Leu Val Val 含有這段序列的11肽即足以結(jié)合并活化SH PTP1 EPOR上此種酪氨酸的缺失可使細(xì)胞對(duì)EPO的敏感性升高5到10倍 IFN 作用后 IFN 受體可與SH PTP1可逆性結(jié)合 同樣 接受這種刺激的Moptheaten小鼠巨噬細(xì)胞中 JAK1和Stat1酪氨酸磷酸化水平明顯高于正常 而對(duì) 型IFN信號(hào)傳導(dǎo)同樣重要的TYK2 Stat2活化水平則無(wú)明顯變化 JAK和STAT的功能 STATs調(diào)節(jié)的基因范圍很廣IFN調(diào)控基因的表達(dá)需要Stat1和2 IL 6誘導(dǎo)的急性期反應(yīng)基因的表達(dá)需要Stat3 Stat5介導(dǎo)催乳素誘導(dǎo)的多種基因表達(dá) Stat6為IL 4誘導(dǎo)的免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換和MHC 類抗原與免疫球蛋白受體等的上調(diào)所必需 JAK能直接或間接磷酸化Vav PLC 1等其它信號(hào)分子 從而激活其它信號(hào)傳導(dǎo)通路 IL 4誘導(dǎo)的胰島素受體底物 IRS 1 2的磷酸化也需JAK的活化 JAK和STAT除了共同構(gòu)成JAK STAT途徑傳導(dǎo)信號(hào)外 各有其相對(duì)獨(dú)立的作用 NF B為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族 包括5個(gè)亞單位 Rel cRel p65 RelA NF B3 RelB和p50 NF B1 p52 NF B2 p65 cRel和RelB含有N端Rel同源區(qū) Relhomologydomain RHD 和C端的反式激活結(jié)構(gòu)域 transactivationdomain TD 在RHD的C末端有一個(gè)核定位區(qū)域 nuclear localizationsequence NLS 負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合 二聚體化和和核易位 而TD則與轉(zhuǎn)錄活化相關(guān) p50和p52只有RHD而缺乏TD 因此 p50和p52同源二聚體并不能激活基因轉(zhuǎn)錄 而是作為一種抑制分子存在 它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)通常各自以其前體p105和p100的形式存在 兩個(gè)亞基形成的同源和 或異源二聚體與靶基因上特定的序列 B位點(diǎn) 結(jié)合調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄 不同的NF B二聚體在選擇結(jié)合序列時(shí)可能略有差異 這是NF B通過(guò)不同的二聚體的形式對(duì)不同基因的表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)的一種方式 3 4NF B家族 最常見(jiàn)的NF B二聚體是p65與p50組成的異二聚體 NF B的抑制單位I B通過(guò)其C末端特定的錨蛋白重復(fù)序列 ankyrinrepeatmotif 與NF B結(jié)合 并覆蓋NLS阻止NF B向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移 在靜息的細(xì)胞中 NF B和I B形成復(fù)合體 以無(wú)活性形式存在于胞漿中 當(dāng)細(xì)胞受細(xì)胞外信號(hào)刺激后 I B激酶復(fù)合體 I Bkinase IKK 活化將I B磷酸化 使NF B暴露核定位位點(diǎn) 游離的NF B迅速移位到細(xì)胞核 與特異性 B序列結(jié)合 誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄 I B解離機(jī)制的幾種假說(shuō) 蛋白磷酸化 要活化NF B I B必須發(fā)生蛋白酶解 故需要蛋白激酶和蛋白磷酸酶參與活性氧的作用 特別是過(guò)氧化物在NF B活化中起一定作用 其機(jī)制可能是通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 間接作用于胞質(zhì)的NF B I B復(fù)合體遍在蛋白的作用 I B和p105磷酸化后被遍在蛋白綴合酶識(shí)別 使I B和p105遍在蛋白化 經(jīng)蛋白酶小體降解加工 I B降解 釋放出p105 p65蛋白復(fù)合體 經(jīng)加工后生成有活性的NF B NF B已存在于細(xì)胞質(zhì) 不需要新合成與I B簡(jiǎn)單的解離反應(yīng)就可觸發(fā)激活NF B主動(dòng)參與胞質(zhì) 胞核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)