定性、定量方法修改.doc

IHSS定性提取方法稱取過(guò)2mm篩風(fēng)干土樣100g加入玻璃瓶(2.5L玻璃瓶)中, 按土水比1:1加入1mol/L的HCl(如仍冒泡則按1:2), 放置1h, 用0.1mol/L的HCl調(diào)至最終土水比1:10. 室溫?fù)u動(dòng)玻璃瓶1h(10min/次), 將混合液倒入大離心管中, 低速離心, 上清液(FA1)倒入FA瓶(2.5L塑料瓶)中備用. (1D)堿提步驟：用0.1mol/L的NaOH將沉淀沖到玻璃瓶中, 并調(diào)至最終土水比1:10，用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH=1314, 立即充氮?dú)?1min)并蓋嚴(yán). 保持氮?dú)鈼l件下(蓋嚴(yán))搖動(dòng)玻璃瓶, 1h或0.5h一次, 持續(xù)12h后靜置過(guò)夜. 次日低速離心, 上清液倒入HE(HA+FA2)瓶(2.5L玻璃瓶)中, 用6mol/L的HCl將HE瓶中液體酸化(pH=1.0). 堿提步驟(下劃線)重復(fù)3次. 重復(fù)3次后將沉淀水洗至適當(dāng)容器中, 50烘干, 以提取Hu備用(Hu提取完畢). 絮凝步驟：第三次酸化后的HE放置1216h, 用虹吸法將上清液(FA2)吸入FA瓶, 之后低速離心, 上清液為FA2(虹吸殘留), 將上清液倒入FA瓶中(FA提取完畢), 沉淀為HA. 氮?dú)鈼l件下在大離心管中用最少量(記錄所用體積)0.1mol/L的KOH溶解HA, 之后用適量1mol/L的KOH調(diào)節(jié)pH=1314. 加入計(jì)算好的固體KCl (KCl用量見附表1), 使K+濃度為0.3mol/L(如無(wú)絮凝則需微量添加), 靜置1h后, 將溶液移至高速離心管, 高速離心, 保留上清液, 棄掉懸浮物. 酸洗步驟：攪拌條件下用6mol/L的HCl調(diào)節(jié)上清液pH=1.0, 放置1216h, 高速離心后棄掉上清液. 在高速離心管中用30ml的HCl(0.1mol/L)+HF(0.3mol/L)【8.3mL HCl+24.87mLHF1000mL】浸泡HA, 室溫下振蕩過(guò)夜后高速離心, 棄掉上清液. 酸洗步驟(斜體)重復(fù)3次. 必要的話，洗至灰分含量小于1%.用水將沉淀攪拌成泥狀, 之后電滲析直到蒸餾水中無(wú)Cl-(AgNO3檢測(cè)), 凍干備用(HA提取純化完畢). 注解注1: 和為玻璃瓶組號(hào)注2: 室溫條件為25注3: 低速離心為4000r/min, 15min, 離心管為大離心管, 250ml注4: 高速離心為11000g, 15min, 離心管為高速離心管, 30ml所需藥品1、鹽酸HCl : 0.1mol/L（8.3mL1000mL）, 1mol/L, 6mol/L（500ml1000mL） 2、氫氧化鈉NaOH: 0.1mol/L, 1mol/L3、固體KCl 4、氫氧化鉀KOH : 0.1mol/L （5.6g1000mL）5、氫氟酸HF : 0.3mol/L （24.87 mL1000mL） HCl(0.1mol/L)+HF(0.3mol/L)【8.3mL HCl+24.87mLHF1000mL】附表10.1M KOH=0.4L0.1M KOH=0.5L0.1M KOH=0.6L0.1M KOH=0.7L1M KOH(L)KCl(g)1M KOH(L)KCl(g)1M KOH(L)KCl(g)1M KOH(L)KCl(g)0.010 4.088 0.010 5.208 0.010 6.328 0.010 7.448 0.020 3.696 0.020 4.816 0.020 5.936 0.020 7.056 0.030 3.304 0.030 4.424 0.030 5.544 0.030 6.664 0.040 2.912 0.040 4.032 0.040 5.152 0.040 6.272 0.050 2.520 0.050 3.640 0.050 4.760 0.050 5.880 0.060 2.128 0.060 3.248 0.060 4.368 0.060 5.488 0.070 1.736 0.070 2.856 0.070 3.976 0.070 5.096 0.080 1.344 0.080 2.464 0.080 3.584 0.080 4.704 0.090 0.952 0.090 2.072 0.090 3.192 0.090 4.312 0.100 0.560 0.100 1.680 0.100 2.800 0.100 3.920 0.110 0.168 0.110 1.288 0.110 2.408 0.110 3.528 0.120 0.896 0.120 2.016 0.120 3.136 0.130 0.504 0.130 1.624 0.130 2.744 0.140 0.112 0.140 1.232 0.140 2.352 0.150 0.840 0.150 1.960 0.160 0.448 0.160 1.568 0.170 0.056 0.170 1.176 0.180 0.784 0.190 0.392 0.200 0.000 （1）將粗HM烘半干、稱重，均勻分成4份，置于離心管（100mL）中，加入0.5%(v/v)的HF-HCI混合液約50ml,用玻璃棒攪勻,在恒溫（水?。┱袷帣C(jī)上振蕩12小時(shí)(25,145-175rpm/min)，次日取出離心15分鐘(3500r/min),然后將離心后的上清液棄去,繼續(xù)重復(fù)上述處理6次，即依次用0.5%(v/v)的HF-HCI混合液連續(xù)處理7次。（2）用2.5%(v/v)的HF-HCI混合液連續(xù)處理7次；振蕩、離心同上。（3）用5%(v/v)的HF-HCI混合液連續(xù)處理11次; 振蕩、離心同上。（4）用10%(v/v)的HF-HCI混合液連續(xù)處理6次，振蕩、離心同上。（5）用20%(v/v)的HF-HCI混合液連續(xù)處理4-8次; 振蕩、離心同上。（6）用30%(v/v)的HF-HCI混合液連續(xù)處理2次; 振蕩、離心同上。（7）用40%(v/v)的HF-HCI混合液處理1次，振蕩、離心同上?？偣灿貌煌瑵舛鹊腍F-HCI混合液處理33-37次，前8次分別向每個(gè)離心管加入4gNa2SO410H2O，將經(jīng)HF-HCI混合液處理后的HM用蒸餾水(25-50ml/管)洗至無(wú)氯離子反應(yīng)(共洗3-6次，用AgNO3檢查),然后用冷凍干燥機(jī)凍干備用。定量：腐殖質(zhì)組成修改法（包括胡敏素提?。?天）提?。?、稱取風(fēng)干土（60目）5.00g于100ml離心管（事先標(biāo)號(hào)稱重），土用百分之一天平稱。2、按照土比水1/6加入蒸餾水（即30ml,用注射器，20+10ml ）。3、攪拌均勻后，用恒溫水浴振蕩器（702度、145轉(zhuǎn)/分）震蕩提取1h。4、取下后以3500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，將上清液用中速定量濾紙過(guò)濾到50ml容量瓶中。5、再用蒸餾水洗殘?jiān)?次（10+10）ml 將離心液過(guò)濾到50ml容量瓶中，用蒸餾水定容，此部分為水溶性物質(zhì)WSS.（WSS測(cè)吸光值400、465、600、665nm用723可見光分光光度計(jì)，做TOC. ） 分離：一、HE（HS）與HM的分離1、離心管中殘?jiān)尤耄?0+10）ml 0.1N NaOH與0.1mol/L Na4P2O7 10H2O(pH=13)混合液，玻璃棒攪拌均勻。2、在恒溫水浴振蕩器上702度145轉(zhuǎn)/分震蕩，提取1h。3、取下后，以3500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，將上清液用中速定量濾紙過(guò)濾到50ml容量瓶中。4、再用混合液洗殘?jiān)?次，（10+10）ml，將離心液過(guò)濾到50ml容量瓶中，蒸餾水定容，此為可提取腐殖物質(zhì)HE5、離心管中的殘?jiān)茫?0+10）ml蒸餾水洗2-3次并3500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄去液體，此時(shí)離心管中為胡敏素HM（Hu）（粗）.二、HA與FA的分離1、 吸取上述堿提取液(HE)30ml于50ml小三角瓶中，加入1N H2SO4,調(diào)節(jié)pH為1.0-1.5。(加4管左右酸，溶液顏色會(huì)變化) 【HE取出30ml后剩余約10ml先不倒掉，以備TOC儀器故障時(shí)，取5ml，電熱板定碳（先中和、蒸干、定碳）。FA=HE-HA】 2、 將此溶液于60-70度（67）下水浴鍋中保溫1-2h,然后靜置過(guò)夜。（2天）3、 次日，將溶液用中速定量濾紙過(guò)濾，分離出沉淀為HA,溶液為FA用水定溶（FA測(cè)吸光值，上TOC）。吸FA 10ml于50ml容量瓶中，調(diào)ph為7，定容，可測(cè)TOC,TOC小瓶裝滿排號(hào)）4、 用0.05N H2SO4洗滌沉淀（HA）3次于50ml錐形瓶中，每次用5-8ml（7.5ml）（注射器），棄去洗液。5、 將HA沉淀用溫?zé)岬?60度，最好在水浴鍋旁恒溫加熱沖洗)0.05N NaOH溶解于另一組50ml容量瓶中（3次，20+10+10ml），用0.05N NaOH定容HA(HA測(cè)吸光值，稀釋5-10倍.上TOC). 如TOC儀器故障時(shí)，取5-10ml，電熱板定碳（先中和、蒸干、定碳）。FA=HE-HA】 三、HMi與HMc的分離1、 粗HM用(15+10)ml 1N H2SO4攪拌25C振蕩2h,以4000r/min離心15min,棄去液體。2、 用水洗殘?jiān)?次，每次用蒸餾水50ml,以4000r/min離心15min,棄去液體。3、 HMi:加入0.2mol NaOH 50ml，25C振蕩1h,室溫靜止24h。4、 以4000r/min離心15min,過(guò)濾到50ml容量瓶中用蒸餾水定容HMi.（HMi測(cè)吸光值，HMi稀釋5倍。定碳）5、 向殘?jiān)屑尤?mol/L HF+HCl 溶液處理2次，每次用50ml25C振蕩2h,以4000r/min離心15min,棄去液體.6、 加入50ml 1mol/L HF 攪拌均勻在25C恒溫水浴上振蕩2h,之后以4000r/min離心15min,棄去液體。7、 用蒸餾水洗殘?jiān)?次，每次用50ml,攪拌均勻后以4000r/min離心15min,棄去液體。8、 HMc:加入0.2ml/L NaOH 50ml,25度振蕩1h,室溫靜止24h.9、 以