飼料中霉菌毒素的檢測方法研究.doc

飼料中霉菌毒素的檢測方法研究l84廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)2009年第6期飼料中霉菌毒素的檢測方法研究趙東豪,陳培基,黃珂,黎智廣f中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,廣東廣州510300)摘要:飼料被霉菌毒素污染會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)價(jià)值降低,引起動(dòng)物疾病,并直接或間接地危害人類健康,應(yīng)當(dāng)建立相應(yīng)的體系對(duì)其監(jiān)控.飼料中霉菌毒素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),熒光檢測法(FLD),近紅外光譜法(NIR),薄層色譜法(TLC),氣相色譜及氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法(GC,GCMS)和高效液相色譜及高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC,HPLCMS/MS)等.綜述了霉菌毒素常見檢測方法的研究進(jìn)展和應(yīng)月.關(guān)鍵詞:霉菌毒素:飼料;檢測方法中圖分類號(hào):TS207.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1004874X(2009)060l8403ThedeterminationmethodsofmycotoxininfeedstuffZHAODong-hao,CHENPei-ji,HUANGKe,LIZhi-guang(SouthChinaSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyof飚kSc&nces,Guangzhou510300,China)Abstract:Thenutritionvaluewouldbedeclinedandleadtoanimalsdisease,eventhepeopleShealthweredamagedwhilethefeedstuffwerecontaminatedbymycotoxin,therelevantmonitorsystemshouldbeestablished.Theanalyticmethodsaboutthemycotoxinincludeenzymelinkedimmunosorbentassay,nearinfraredspectroscopy,thinlayerchromatography,gaschromatography,gaschromatography-massspectrometry,highperformanceliquidchromatography,highperformanceliquidchromatography-massspectrometry,etc.Thispaperintroducestheresearchprogressandapplicationofthecurrentlyavailableanalyticalmethodsaboutmycotoxin.Keywords:mycotoxin;feedstuff;analyticalmethods霉菌毒素(mycotoxin)又叫真菌毒素,是飼料或谷物中霉菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物.迄今為止,已經(jīng)知道的霉菌毒素大約有300400種.其中影響及毒害作用比較大的有黃曲霉毒素(aflatoxin,AFT),赭曲霉毒素(ochratoxin,OT),玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN),脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),煙曲霉毒素(flxmitremorgin,VF)和T一2毒素(T一2toxin)等.據(jù)報(bào)道,在從全國收集的玉米,糠麩,小麥,草粉及餅粕類等飼料的抽樣檢查中,374個(gè)樣品中完全沒有檢測到霉菌毒素的樣品僅有5個(gè),超過80%的樣品含有兩種或更多種霉菌毒素lj1.不同霉菌的適宜生長環(huán)境差異很大.我國南方高溫高濕的氣候條件比較適宜黃曲霉菌,煙曲霉菌等的生長,而禾谷鐮刀菌,青霉菌等在北方寒冷干燥的天氣里仍能很好地生存.飼料在加工和貯存的過程中如不慎被霉菌污染.往往會(huì)造成比較嚴(yán)重的損失.飼料被霉菌毒素污染會(huì)降低營養(yǎng)價(jià)值,動(dòng)物長期或過量采食這些飼料能引起慢性或急性中毒,而殘留收稿日期:20090219作者簡介:趙東豪(1981一),男,碩士,Email:dhao138126.corn于動(dòng)物產(chǎn)品中的霉菌毒素又損害人類的健康.為了保障食品安全.歐盟和FDA都制定了霉菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn),我國也有相關(guān)技術(shù)檢測黃曲霉毒素,赭曲霉毒素,玉米赤霉烯酮及T一2毒素等霉菌毒素.本文對(duì)霉菌毒素的毒害機(jī)理及常見檢測方法進(jìn)行了綜述.1霉菌毒素的毒害機(jī)理不同種類的霉菌毒素對(duì)動(dòng)物的毒害機(jī)理會(huì)有很大的不同.黃曲霉毒素是重要的致癌物還具有致畸,致突變和免疫活性抑制等作用.赭曲霉毒素通過影響腎臟糖的代謝,引起腎小管變性.腎臟機(jī)能損傷而導(dǎo)致嚴(yán)重的腎毒性.玉米赤霉烯酮類似雌激素作用,主要危害生殖系統(tǒng),造成母豬不孕或流產(chǎn),繁殖機(jī)能紊亂.嘔吐毒素以嘔吐綜合征為主要特征,表現(xiàn)為拒食,嘔吐,腸炎性腹瀉及產(chǎn)蛋量下降等.T一2毒素能引起消化道出血及壞死,抑制骨髓造血,損害免疫功能并導(dǎo)致生殖器官病變.煙曲霉毒素誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,破壞神經(jīng)組織.使動(dòng)物出現(xiàn)肺水腫,腹瀉,呼吸困難以至死亡.青霉菌肝臟毒性比較強(qiáng).如果飼料中含有多種霉菌毒素.還能產(chǎn)生聯(lián)合毒性,造成更大的危害.2霉菌毒素的檢測方法目前檢測霉菌毒素的方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法,光譜法,色譜法及色譜一質(zhì)譜聯(lián)用等方法.它們?cè)诿咕舅氐臋z測和控制上發(fā)揮了很大的作用.每種方法都有自己的優(yōu)勢.又有相對(duì)的不足之處.2.1酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)ELISA法是利用抗原抗體反應(yīng)原理,將已知抗原吸附在酶標(biāo)板上,加入酶標(biāo)記抗體和樣品提取液并混合均勻,充分反應(yīng)后用去離子水洗去多余抗體,再加入酶的底物.產(chǎn)生有色物質(zhì).最后加入終止液使反應(yīng)終止,用酶標(biāo)儀測定酶底物的降解量,參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣中的抗原量.柳其芳121采用ELISA法在120g/kg范圍內(nèi)測定黃曲霉毒素Bl,標(biāo)準(zhǔn)曲線r值為一0.993一0.998,CV為0.4%2.6%,回收率為92%105%.Paepens等31檢測玉米中的煙曲霉毒素含量.檢測限為1mg/kg.ELISA法一般對(duì)樣品作凈化處理,操作簡單,檢測速度快,成本低,適用于大批量樣品的快速篩選.2.2熒光檢測法(FLD)FLD常結(jié)合免疫親和柱使用,是美國AOAC的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法.我國國標(biāo)(GB/T189792003)也用此法檢測黃曲霉毒素的含量.樣品經(jīng)甲醇/水提取后,過濾,稀釋,用含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和柱層析凈化.超純水洗去雜質(zhì),甲醇洗脫,加入溴溶液漸生后用熒光光度計(jì)測定.此法也常用來檢測玉米赤霉烯酮等.熒光光度計(jì)法方便,快捷,花費(fèi)少.不需使用霉菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品,減少對(duì)人的傷害,也常作為快速篩選方法使用.2.3近紅外光譜法(NIR)NIR法是近年來發(fā)展得比較快的光譜分析技術(shù),在農(nóng)業(yè),食品,化工等多個(gè)行業(yè)都有成功的應(yīng)用,創(chuàng)造了良好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益.Hans等41使用NIR檢測小麥中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,將被禾谷鐮刀菌污染的小麥進(jìn)行系列濃度稀釋,做校正試驗(yàn).通過主成分分析和偏最/J,-乘法回歸計(jì)算,在670l100nm的波長范圍內(nèi)獲得最佳回歸模型,斜率為0.949,相關(guān)系數(shù)為0.984,標(biāo)準(zhǔn)誤差為381g/kg,NIR可以用來檢測小麥中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等霉菌毒素.使用NIR分析.樣品不需預(yù)處理,多種組分可以同時(shí)測定,分析速度快,重現(xiàn)性好,但是此方法必須先建立準(zhǔn)確的校正模型.適用于經(jīng)常性質(zhì)量控制分析.2.4薄層色譜法(TLC)TLC法是將樣品提取液在薄層板上點(diǎn)樣,展開后,用吸收法或熒光法對(duì)被測樣品與標(biāo)準(zhǔn)品掃描測定.Marijana等Sl采用薄層色譜法檢測谷物和飼料中的單185端孢霉烯族毒素.T一2毒素,蛇形毒素及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢出率分別為16.8%,27.6%和41.2%.含量在0.053.4mg/kg之間.TLC法簡單,快速且成本低,但是由于其靈敏度和回收率比較低,更適合用作定性分析.2.5氣相色譜和氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法(GC和GCMS)GC從20世紀(jì)70年代開始用于霉菌毒素的檢測.T一2毒素等單端孢霉烯族毒素.由于其羥基珩生化處理之后有良好的揮發(fā)性,常采用氣相色譜法檢測.Zsuzsanna等嗍報(bào)道了用GCFID或GCMS檢測玉米等飼料中的單端孢霉烯族毒素.樣品經(jīng)乙N/水(84/16,v,v)提取后,在錐形瓶中攪拌30min.過濾后在重力的作用下通過用乙腈,乙N/水活化的凈化柱(自制),然后用84%的乙腈洗脫,硅烷化氨基甲酸鹽珩生之后注入火焰離子化檢測器或質(zhì)譜檢測器.GCFID的回收率為66%109%.LOD為0.30.7mg/kg.GCMS的回收率為87%100%,LOD為O.050.35mg/kg.Toshitsugu等71采用GCMS檢測谷物中的玉米赤霉烯酮和單端孢霉烯族毒素,樣品用乙N/水(3/1,v/v)提取后,依次用正己烷脫脂,氯化鈉層析后,45C下減壓蒸干.三甲基硅烷沂生化后使用選擇性離子監(jiān)測(SIM)模式檢測.在50ng/g添加水平時(shí),8種霉菌毒素的平均回收率大于81%,脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇(NW)的檢測限為10ng/g,其他霉菌毒素的檢測限是5.g/g.氣質(zhì)聯(lián)用法能對(duì)霉菌毒素做準(zhǔn)確的定性分析.并且靈敏度也有比較大的提高,檢測限更低.2.6高效液相色譜法(HPLC)HPLC法較早用于霉菌毒素的檢測,常用的檢測器有熒光,紫外,二極管陣列,蒸發(fā)光散射等檢測器,是目前使用最廣泛的檢測霉菌毒素的方法.Gerda等18報(bào)道了用HPLCFLD檢測谷物中的串珠鐮刀菌毒素,樣品經(jīng)乙腈/水(90/10,v/v)提取,離心后取上清液,置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干.再用1mL甲醇溶解殘?jiān)?正己烷脫脂后,用陰離子交換柱進(jìn)行固相萃取,最后再用1,2一二氨基一4,5一二甲基苯(DDB)沂生化處理.熒光檢測器激發(fā)波長為330nm,發(fā)射波長為440nm.在20250Ixg/kg添加水平上回收率為70%.LOD為20Ixg/kg.Wang等91采用HPLCELSD檢測玉米中的炯曲霉毒素,樣品用乙腈/水(1/1,v/v)提取后,在搖床上振蕩過夜,過濾后離心,上清液通過預(yù)先用甲醇和去離子水活化的XAD一4固相萃取柱,最后用甲醇洗脫.蒸發(fā)光散射檢測器,氮?dú)饬魉贋?.0L/rain,漂移管溫度為45,進(jìn)樣量2OL.回收率為77-3%一102.6%.HPLCl86法靈敏度高,檢測限低,易于規(guī)范化操作,適用性廣泛,逐漸成為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的分析方法.2_7高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLCMS/MS)隨著液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,精確的定性和定量分析功能使其在食品安全,環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域有著越來越廣泛的應(yīng)用.Aleksandrs等【-01采用HPLCESIMS/MS檢測谷物中的雜色曲霉毒素,樣品經(jīng)乙腈/水(84/16,v/v)提取,通過預(yù)先用甲醇,水活化的Stratax固相萃取柱,40%的甲醇洗滌小柱后,最后用4mL乙腈洗脫.在正離子檢測方式下,離子源溫度120(2.錐孔電壓30V,毛細(xì)管電壓3.5kV,m/zfM+H+為325,選擇兩個(gè)離子(分別為3l0和288)組成兩對(duì)監(jiān)測離子對(duì),回收率為94.5%105.3%,LOD為0.15g/kg,LOQ為0.30g/kg.Franz等報(bào)道用HPLCAPCIMS/MS測定玉米中的T一2毒素,玉米赤霉烯酮,單端孢霉烯族毒素等霉菌毒素,根據(jù)多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)進(jìn)行定性和定量分析,離子源溫度為450,氣簾氣壓力為35psi,霧化氣壓力為6Opsi,輔助氣壓力為l5psi,碰撞室壓力為6psi,電暈電流為一2A.除了雪腐鐮刀菌烯醇,單端孢霉烯族毒素回收率在73%89%.用內(nèi)標(biāo)法.玉米赤霉烯酮回收率也能達(dá)到99%,各種霉菌毒素的LOD為0.33.8txg/kg.RazzaziFazeli等J也采用APCI電離.以負(fù)離子模式檢測小麥中的雪腐鐮刀菌烯醇.樣品經(jīng)乙腈水提取后.用Mycosep柱凈化后上機(jī)檢測.回收率為70%一86%,LOQ為40g/kg.液質(zhì)聯(lián)用法具有靈敏度高,特異性強(qiáng),精確度和選擇性好等特點(diǎn),能夠?qū)γ咕舅剡M(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析.常常作為確證方法使用,但是儀器設(shè)備比較昂貴,檢測成本高,操作步驟復(fù)雜,因此目前國內(nèi)的普及率還不太高.3結(jié)語根據(jù)不同的需要,可以將上述方法分為篩選方法和確證方法.ELISA和FLD法檢測速度快,簡便易用,適于大批量樣品的快速篩選.但是在準(zhǔn)確定性,實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證和實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)化分析時(shí),需要用確證方法.相對(duì)于快速篩選方法,TLC,GC,HPLC及GCMS等有更高的準(zhǔn)確性,數(shù)據(jù)經(jīng)得起檢驗(yàn),容易被其他實(shí)驗(yàn)室和權(quán)威部門接受.在實(shí)際應(yīng)用中,應(yīng)當(dāng)根據(jù)分析的目的,樣品的性質(zhì)及環(huán)境條件等選擇適宜的方法隨著人們對(duì)霉菌毒素造成的危害越來越重視.在畜牧業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中,應(yīng)該建立起相應(yīng)的監(jiān)控體系.不僅要對(duì)飼料中霉菌毒素的情況實(shí)時(shí)監(jiān)控.盡可能減少飼料在加工,存貯過程中的損失及對(duì)動(dòng)物的危害作用.還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品的監(jiān)測,確保食品安全和人類健康.參考文獻(xiàn):【1】張丞,劉穎莉.2006年飼料和原料中霉菌毒素調(diào)查總結(jié)報(bào)告J.飼料廣角,2007(9):2326.【2】柳其芳.酶聯(lián)免疫吸附法和薄層色譜法聯(lián)合分析黃曲霉毒素B1的研究J.中國熱帶醫(yī)學(xué),2006,6(2):246248.3】PaepensC,SaegerSD,SibandaL,eta1.Aflow-throughenzymeimmunoassayforthescreeningoffumonisinsinmaizeJ.AnalyticaChimicaAeta,2004,523:229-235.4】HansP,LenaA.NearinfraredspectroscopyfordeterminationofmycotoxinsincerealsIJ.FoodControl,2003,14:229232.5】MarijanaS,BorkaS.SurveyoftfichothecenemycotoxinsingrainsandanimalfeedinCroatiabythinlayerchromatographyJ.FoodControl,2006,17:733-740.6】ZsuzsannaE,AnikoK,KornelT.SimultaneousdetectionofAandBtfichotheeenesbygaschromatographywithflameionizationormassselectivedetectionfJ】.MicrochemicalJournal,2004,78:211216.【7】ToshitsuguT,AtsushiY,ShigetoI,eta1.Simuhaneousdeterminationoftfichothecenemycotoxinsandzearalenoneincerealsbygaschromatographymassspectrometry【J】.JournalofChromatographyA,2000,882:23-28.8GerdaF,WolfgangL.DeterminationofthemycotoxinmoniliforminincerealsbyhighperformanceliquidchromatographyandfluorescencedetectionJ】.JournalofChromatographyA,1996,732:291-298.9】WangJS,ZhouY,WangQM.AnalysisofmycotoxinfumonisinsinCOrnproductsbyhigh-performanceliquidchromatographycoupledwithevaporativelight