第十四章 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用.ppt

1 14 3液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用分析法14 3HyphenatedTechnologyofHPLC MS 液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用 LC MS聯(lián)用 2 對(duì)于熱穩(wěn)定性差 不易汽化的樣品 GS MS聯(lián)用有一定的困難 因此 近年來又發(fā)展了液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) LC分離要使用大量的液態(tài)流動(dòng)相 如何有效地除去流動(dòng)相而不損失樣品 是LC MS聯(lián)用的難題之一 目前應(yīng)用較多的有兩種接口裝置 LC MS用傳送帶聯(lián)接裝置 3 一 高效液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀二 離子源三 質(zhì)量分析器四 串聯(lián)四級(jí)質(zhì)譜法的掃描方式和模式五 檢測器和真空泵六 LC MS分離條件的選擇和優(yōu)化七 注意事項(xiàng)見建議 4 一 液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀 1 液質(zhì)聯(lián)用儀組成流程 5 氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用 GC MS 高效液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用 HPLC MS 也可以質(zhì)譜 質(zhì)譜聯(lián)用 MS MS 基于色譜和質(zhì)譜的儀器靈敏度相當(dāng) 加之使分離效果好的色譜成為質(zhì)譜的進(jìn)樣器 而速度快 分離好 應(yīng)用廣的質(zhì)譜儀作為色譜的鑒定器 使它們成為目前最好的用于分析微量的有機(jī)混合物的儀器 一 液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀 2 液質(zhì)聯(lián)用儀類型 6 氣質(zhì)聯(lián)用儀 GC MS 是最早商品化的聯(lián)用儀器 適宜分析小分子 易揮發(fā) 熱穩(wěn)定 能氣化的化合物 用電子轟擊方式 EI 得到的譜圖 可與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對(duì)比 液質(zhì)聯(lián)用 LC MS 主要可解決如下幾方面的問題 不揮發(fā)性化合物分析測定 極性化合物的分析測定 熱不穩(wěn)定化合物的分析測定 大分子量化合物 包括蛋白 多肽 多聚物等 的分析測定 沒有商品化的譜庫可對(duì)比查詢 只能自己建庫或自己解析譜圖 液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別 7 LC MS聯(lián)用儀系統(tǒng)構(gòu)成 8 廣適性檢測系統(tǒng) 3 液質(zhì)聯(lián)用的優(yōu)勢 一 液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀 9 分析熱不穩(wěn)定化合物分析氣相色譜 質(zhì)譜無法分析的樣品分析大分子量的化合物 如生化樣品極高的靈敏度 10 進(jìn)一步增加HPLC的分離能力 11 4 LC MS聯(lián)用中的轉(zhuǎn)變過程 液相色譜的現(xiàn)實(shí)情況 從高效液相色譜流出的化合物存在于大氣壓條件下的溶液之中質(zhì)譜的現(xiàn)實(shí)情況 在高真空工作條件下的質(zhì)譜僅接受氣相的離子 因此 液質(zhì)聯(lián)用的接口必須完成 帶電狀態(tài) 中性 離子物態(tài)轉(zhuǎn)變 液態(tài) 氣態(tài)真空變化 760torr 10 510 8torr 從LC MS轉(zhuǎn)變 LC MS轉(zhuǎn)變過程 去除溶劑保留樣品電離化合物 12 接口 13 API接口 Z Spray接口 14 二 離子源 大氣壓電離 API 技術(shù)目前 LC MS采用大氣壓離子化 Atmosphericpressureionization API 技術(shù)作為液質(zhì)聯(lián)用的接口技術(shù) 也是質(zhì)譜離子化技術(shù) API主要包括 電噴霧electrosprayionization ESI大氣壓化學(xué)電離atmosphericpressurechemicalionization APCI 離子源 使樣品產(chǎn)生離子的裝置叫離子源 15 一 電噴霧離子源ESI 二 大氣壓化學(xué)電離APCI 三 ESI與APCI比較 二 離子源 16 電噴霧離子化ESI接口電噴霧離子化ESI特征電噴霧離子化ESI過程影響化合物ESI電離的因素 一 電噴霧離子化ESI 17 1 ESI接口 一 電噴霧離子源 氮?dú)庥脕碜鋈ト軇夂湾F孔氣氬氣做碰撞氣 先形成帶點(diǎn)電荷 18 低分子量化合物一般產(chǎn)生單電荷離子 失去或得到一個(gè)質(zhì)子 高分子量生物大分子和聚合物產(chǎn)生多電荷離子幾乎沒有碎片離子可能生成加合物和 或多聚體 常見的是溶劑加合物和NH4 M 18 Na M 23 和K M 39 加合物靈敏度取決于化合物本身和基質(zhì) 一 電噴霧離子源 2 ESI特征 19 1 形成帶電小液滴 2 溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂 3 最終形成氣相離子 3 電噴霧離子化ESI過程 一 電噴霧離子源 20 1 形成帶點(diǎn)離子 3 電噴霧離子化ESI過程 21 22 2 溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂 3 電噴霧離子化ESI過程 23 3 形成氣相離子 對(duì)于半徑10nm的液滴 電荷的排斥作用導(dǎo)致離子從液滴表面蒸發(fā)而不是液滴的分裂 離子從溶液中轉(zhuǎn)移至氣相 3 電噴霧離子化ESI過程 24 4 ESI MS的基本離子化原理是 溶劑由液相泵輸送到ESI毛細(xì)管 經(jīng)其內(nèi)的不銹鋼毛細(xì)管流出 在ESI高壓電極處施以負(fù)的高電壓 小液滴從毛細(xì)管高速噴出而帶有過量的負(fù)電荷 從而產(chǎn)生電化學(xué)反應(yīng) 通過溶劑組分氧化而去掉正離子或通過毛細(xì)管自身的氧化而增加負(fù)離子 在高溫和氮?dú)獾拇祾呦?溶劑逐漸揮發(fā) 變成小顆粒的液滴 由于高電場作用 極性溶質(zhì)成為帶電離子溶解在溶劑液滴上 當(dāng)溶劑顆粒逐漸減小 小到一定程度 帶電的溶質(zhì)粒子便從液滴表面蒸發(fā)出來 形成帶電離子 完成離子化 25 4 影響化合物ESI電離的因素 a 化合物的濃度 b 基質(zhì)的性質(zhì) c 化合物的表面活性 d 流速 26 離子的釋放取決于濃度 信號(hào)在10 M時(shí)達(dá)到飽和 線性動(dòng)態(tài)范圍限制在2 3個(gè)數(shù)量級(jí)信號(hào)的飽和歸因于離子在液滴表面過于密集 致使某些樣品離子不能到達(dá)液滴表面 ESI 樣品濃度對(duì)其響應(yīng)的影響 27 28 ESI 基質(zhì)對(duì)樣品響應(yīng)的影響 一般而言 樣品信號(hào)強(qiáng)度響應(yīng)隨著其它電解質(zhì)濃度的增高而降低 這一現(xiàn)象叫作 離子抑制 樣品離子和電解質(zhì)離子對(duì)電荷及占據(jù)液滴表面的競爭導(dǎo)致離子抑制 表面競爭 電荷競爭 29 基質(zhì)選擇一般原則 一般而言 對(duì)于正離子檢測模式 樣品必須比基質(zhì)更具堿性 以便形成 M H 或足夠的極性去形成穩(wěn)定的加和離子 例 M NH4 對(duì)于負(fù)離子檢測模式 樣品必須比基質(zhì)更具酸性 以便形成 M H 或足夠的極性去形成穩(wěn)定的加和離子 例如 M OAc ESI 基質(zhì)對(duì)樣品響應(yīng)的影響 30 ESI 流速對(duì)樣品響應(yīng)的影響 ESI響應(yīng)隨流速的增加而降低對(duì)ESI接口來說 最佳工作流速為100 250 L min 31 大氣壓化學(xué)電離源APCI接口大氣壓化學(xué)電離源APCI特征大氣壓化學(xué)電離源過程 二 大氣壓化學(xué)電離源APCI 32 二 大氣壓化學(xué)電離源APCI 1 APCI接口 霧化 33 2 大氣壓化學(xué)電離源APCI特征 一般而言 只生成單電荷離子幾乎沒有碎片離子可能生成加合物和 或多聚體 一般是溶劑加合物及NH4 M 18 Na M 23 和K M 39 加合物基質(zhì)影響較小 相對(duì)于ESI 質(zhì)譜圖不受緩沖鹽及其緩沖力變化的影響 34 3 大氣化學(xué)電離過程 大氣壓化學(xué)電離可分為以下兩個(gè)步驟 1 快速蒸發(fā) 2 氣相化學(xué)電離 電暈放電 35 1 快速蒸發(fā) 液流被強(qiáng)迫通過一根窄的管路以使其得到高的線速度高溫加熱器和噴霧器使液流在脫離管路時(shí)蒸發(fā)成氣體 由于溶劑蒸汽的保護(hù) 樣品分子較少受熱裂解的影響 大量的熱量用于溶劑的蒸發(fā) 但是有時(shí)也會(huì)有熱不穩(wěn)定樣品分解 36 2 氣相化學(xué)電離 37 Needle噴霧針 CoronaNeedle電暈針 reagentgas試劑氣 離子 分子反應(yīng) 2 大氣壓化學(xué)電離源APCI 38 大氣壓化學(xué)電離源APCI 離子 分子反應(yīng) 質(zhì)子轉(zhuǎn)移 電子捕獲 電荷交換 離子加和 適合于熱穩(wěn)定 易氣化的小分子低極性化合物 39 三 ESI與APCI的比較 共同點(diǎn) 都屬于大氣壓電離法 API 通常產(chǎn)生 M H 或 M H 等準(zhǔn)分子離子 都使用高電壓元件和霧化氣噴霧法產(chǎn)生氣相離子 產(chǎn)生極少的碎片 但可以控制產(chǎn)生結(jié)構(gòu)碎片 40 ESI與APCI的比較 不同點(diǎn) 生成離子方式不同 樣品兼容性不同 流速兼容性不同 ESI 液相離子化 APCI 氣相離子化 ESI 0 2 0 5ml min APCI 0 5 1ml min ESI 極性化合物和生物大分子 APCI 非極性 小分子化合物 相對(duì)于用ESI電離的化合物而言 且有一定的揮發(fā)性 41 42 樣品已經(jīng)變成氣相離子樣品仍處于大氣壓下必須把樣品送入質(zhì)譜高真空環(huán)境中 43 蒸氣通過樣品錐孔進(jìn)入一級(jí)真空區(qū) 離子源區(qū) 并且膨脹蒸氣在膨脹時(shí)會(huì)冷卻這種冷卻可能導(dǎo)致在被分析物離子上的溶劑凍結(jié)從而生成各種質(zhì)量數(shù)的簇離子 一級(jí)真空 成簇過程 簇離子會(huì)降低所要檢測的被分析物質(zhì)量處的信號(hào) 簇離子會(huì)增加背景信號(hào) 44 加熱一級(jí)真空區(qū) 離子源區(qū) 以阻止簇離子的生成 使不帶溶劑的樣品離子被檢測在通過加熱的離子源區(qū)以后 樣品離子在靜電場作用下通過萃取錐孔通過萃取錐孔后 樣品離子進(jìn)入六極桿聚焦透鏡從六極桿聚焦透鏡出來 樣品離子進(jìn)入四極桿質(zhì)量分析器 45 三 質(zhì)量分析器 雙聚焦扇形磁場 電場串聯(lián)儀器 sector 四極質(zhì)譜儀 Q 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 TOF 離子阱質(zhì)譜儀 TRAP 四極 TOF Q TOF 串列式多級(jí)質(zhì)譜儀 三重四極 QqQ MS MS TOF TOF 1 分類 46 單四極桿分析器Quadrupole 由四根棒狀電極組成 直流電壓 DC 射頻電壓 RF 形成二維四極電場 離子在場的作用下產(chǎn)生振動(dòng) 碰到四極桿而被吸收 通過四極桿的離子到達(dá)檢測器被檢測 2 四級(jí)桿分析器 47 48 通過改變RF 從而改變通過的離子質(zhì)量 離子質(zhì)量 時(shí)間 49 串聯(lián)質(zhì)量分析器 空間串聯(lián) 時(shí)間串聯(lián) 空間 時(shí)間串聯(lián) 四極桿串聯(lián)Q Q Q 離子阱FTICR Q Trap 都有碰撞活化室 50 實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的質(zhì)量分析器類型 串聯(lián)四極質(zhì)譜儀 MS MS 三重四極 QqQ 離子源 第一分析器 碰撞室 第二分析器 接收器MS1MS2Q1q2Q3 第一級(jí)質(zhì)量分析器 用于選擇一個(gè)前體離子或母離子 然后 用適當(dāng)?shù)幕罨椒ㄊ沁@一離子裂解成產(chǎn)物離子或稱子離子及中性碎片 mp mf mnmp 為前體離子 mf 為產(chǎn)物離子 mn為中性碎片 第二級(jí)質(zhì)量分析器 用于產(chǎn)物離子分析如從產(chǎn)物中再選擇一個(gè)離子 分析最后選擇的離子的碎片 則標(biāo)記MS MS MS 數(shù)級(jí)可進(jìn)一步增加至n次 實(shí)現(xiàn)MSn實(shí)驗(yàn) 51 串聯(lián)質(zhì)量分析器 三重四極桿 三個(gè)四極桿串聯(lián)Q Q Q Q1 質(zhì)量分離 Q2 碰撞活化CIDCollision InducedDissociation Q3 質(zhì)量分離 52 3 碰撞誘導(dǎo)解離CID質(zhì)譜 QqQ檢測器中的碰撞反應(yīng)在CID中進(jìn)行 選擇一定質(zhì)量的離子作為母體離子 進(jìn)入碰撞室 室內(nèi)充有靶子反應(yīng)氣體 本實(shí)驗(yàn)室選擇高純氦 發(fā)生離子 分子碰撞反應(yīng) 從而產(chǎn)生 子離子 再經(jīng)MS2的分析器及接受器得到子離子質(zhì)譜 一般稱做CID collision induceddissociation 譜 53 CID產(chǎn)生的過程 54 4 影響CID質(zhì)譜的因素 較大影響的因素有 所用碰撞氣體的種類 壓力 離子的能量 儀器的配置以及離子電荷狀態(tài)由于在不同的儀器上不可能在完全相同的條件下去分析樣品 任何一個(gè)給定的化合物將在不同的條件下給出差別或大或小的質(zhì)譜 尤其是各個(gè)離子峰的相對(duì)豐度的差別幾乎是無法避免的 因而目前尚難以建立商品化的譜庫供檢索使用 只能進(jìn)行人工解析或自己建庫 大氣壓電離技術(shù)中產(chǎn)生的離子為偶數(shù)電子離子 其主要的碎片應(yīng)由化學(xué)鍵的誘導(dǎo)斷裂和重排反應(yīng)來產(chǎn)生 所以在EI質(zhì)譜解析中總結(jié)出的偶數(shù)電子離子的開裂規(guī)則一般可適用于CID質(zhì)譜的解釋 55 四 掃描方式和掃描模式 全掃描 FullScan 子離子掃描 DaughterScan 母離子掃描 ParentScan 中性碎片丟失掃描 ConstantNeutralLossScan 選擇離子監(jiān)測 SIR 多反應(yīng)監(jiān)測 MRM 一 掃描方式 二 掃描模式 正離子模式負(fù)離子模式 56 1 全掃描 特征 質(zhì)譜掃描得到一段質(zhì)量范圍從而獲得質(zhì)譜圖 用于未知物的結(jié)構(gòu)分析 用于SIR方法的開發(fā)以及MRM方法開發(fā)尋找母離子最佳電離參數(shù) 定性尋找總分子離子峰出峰時(shí)間 57 LC MS中常見的本底離子 m z50 150 溶劑離子 H2O nH n 3 112 m z102 H 乙腈 乙酸 C4H7NO2H 102 0549m z149 管路中鄰苯二甲酸酯的酸酐 C8H4O3H 149 0233m z288 2mm離心管的產(chǎn)生的特征離子m z279 管路中鄰苯二甲酸二丁酯C16H22O4H 279 1591m z316 2mm離心管的產(chǎn)生的特征離子m z384 瓶的光穩(wěn)定劑產(chǎn)生的離子m z391 管路中鄰苯二甲酸二辛酯 C24H38O4H 391 2843m z413 鄰苯二甲酸二辛酯 鈉 C24H38O4Na 413 2668m z538 乙酸 氧 鐵 噴霧管 Fe3O O2CCH3 6 537 8793 58 scanned selectedm z CID 過程 通過Q1選擇目標(biāo)物質(zhì)的母離子 在Q2發(fā)生碰撞反應(yīng) Q3對(duì)目標(biāo)物質(zhì)豐度最大的子離子進(jìn)行掃描 2 子離子掃描 特征 監(jiān)測單個(gè)離子或一系列單個(gè)離子 目標(biāo)化合物的跟蹤 提高采集靈敏度 100 230 59 子離子質(zhì)譜圖 用MS2質(zhì)量分析器掃描指定母離子的子離子碎片 所得到的質(zhì)譜圖只能是由指定母離經(jīng)碰撞產(chǎn)生 60 子離子掃描質(zhì)譜圖 61 用MS1質(zhì)量分析器掃描能丟失指定質(zhì)譜碎片的母離子 所得到的母離子質(zhì)譜峰一定是能丟失指定質(zhì)譜碎片的母離子 母離子質(zhì)譜圖 3 母離子掃描 62 母離子掃描質(zhì)譜圖 63 4 中性碎片丟失 母離子掃描 中性丟失掃描可用來研究結(jié)構(gòu)相似性化合物 如具有相同結(jié)構(gòu)碎片 或相同結(jié)構(gòu)基團(tuán)的化合物 64 中性碎片丟失掃描質(zhì)譜圖 MS1質(zhì)量分析器掃描能丟失指定中性碎片的母離子 MS2質(zhì)量分析器掃描丟失指定中性碎片的離子 所得到的質(zhì)譜圖是由MS1掃描的母離子 母離子只能是丟失指定中性碎片的離子 65 中性碎片丟失掃描質(zhì)譜圖 66 5 選擇離子掃描 定量滿足一般要求信噪比不如MRM只監(jiān)測指定的離子 67 選擇離子記錄 SIR MS1質(zhì)量分析器是靜態(tài) 并且只監(jiān)測指定的離子 68 選擇離子記錄掃描 69 6 多反應(yīng)監(jiān)測SRM MRM 特征 監(jiān)測特定母離子產(chǎn)生特定子離子碎片的化合物 目標(biāo)化合物的跟蹤 提高采集靈敏度 是靈敏度最高的定量采集方式 定量最佳選擇干擾小信噪比高 70 子離子質(zhì)譜圖 指定的母離子產(chǎn)生一指定的子離子 兩個(gè)質(zhì)量分析器都是靜態(tài)的 71 多反應(yīng)監(jiān)測掃描 72 串聯(lián)質(zhì)量分析器 三重四極桿 73 化合物鑒別 全掃描方式 Q1掃描 全掃描數(shù)據(jù)采集可以得到化合物的準(zhǔn)分子離子 從而可判斷出化合物的分子量 用于鑒別是否有未知物 并確認(rèn)一些判斷不清的化合物 如合成化合物的質(zhì)量及結(jié)構(gòu) 子離子分析 MS MS 子離子 用于結(jié)構(gòu)判斷 得到化合物的二級(jí)譜圖即碎片離子 和選擇離子對(duì)作多種反應(yīng)監(jiān)測 MRM 子離子譜圖與錐體電壓斷裂譜圖 源內(nèi)CID 可能十分相似 所不同的是子離子質(zhì)譜圖已知只有一種質(zhì)量通過MS1 因此也已知所有碎片離子都是由我們所選定的母離子所產(chǎn)生的 所以我們更相信由MS MS產(chǎn)生的譜圖的純度 74 二 掃描模式 一般的商品儀器中 ESI和APCI接口都有正負(fù)離子測定模式可供選擇 一般不要選擇兩種模式同時(shí)進(jìn)行 正 負(fù)離子模式建議根據(jù)文獻(xiàn)選擇 75 正離子模式 適合于堿性樣品 可用乙酸或甲酸對(duì)樣品加以酸化 樣品中含有仲氨或叔氨時(shí)可優(yōu)先考慮使用正離子模式 2 負(fù)離子模式 適合于酸性樣品 可用氨水或三乙胺對(duì)樣品進(jìn)行堿化 樣品中有較多的強(qiáng)伏電性基團(tuán) 如含氯 含溴和多個(gè)羥基時(shí)可嘗試使用負(fù)離子模式 二 掃描模式 選擇的一般原則為 76 電子倍增管 光電倍增管 電子倍增管 打拿極 PC 五 檢測器和真空泵 77 高真空泵 10 6Torr 油擴(kuò)散泵 渦輪分子泵 極限真空可達(dá)10 5 10 6Torr 蒸汽噴射泵 泵液蒸汽返流 提高本底 易污染系統(tǒng) 五 檢測器和真空泵 78 高真空泵 10 6Torr 油擴(kuò)散泵 渦輪分子泵 真空可達(dá)10 5 10 6Torr 小型蒸汽渦輪機(jī) 高速旋轉(zhuǎn)葉片 貴 易損 79 真空系統(tǒng)其他附件 真空規(guī) 真空計(jì) 真空管道 真空閥門 吸附阱 抽氣方式 單泵抽氣方式 雙泵差動(dòng)抽氣方式 80 1 樣品的預(yù)處理 從保護(hù)儀器角度出發(fā) 防止固體小顆粒堵塞進(jìn)樣管道和噴嘴 防止污染儀器 降低分析背景 排除對(duì)分析結(jié)果的干擾 要求獲得最佳的分析結(jié)果 從ESI電離的過程分析 ESI電荷是在液滴的表面 樣品與雜質(zhì)在液滴表面存在競爭 不揮發(fā)物 如磷酸鹽等 防礙帶電液滴表面揮發(fā) 大量雜質(zhì)防礙帶電樣品離子進(jìn)入氣相狀態(tài) 增加電荷中和的可能 六 LC MS分離條件的選擇和優(yōu)化 分離條件選擇 81 樣品的預(yù)處理常用方法 a 超濾b 溶劑萃取 去鹽c 固相萃取d 灌注 Perfusion 凈化 去鹽e 色譜分離反相色譜分離親和技術(shù)分離f 甲醇或乙腈沉淀蛋白g 酸水解 酶解h 衍生化 82 2 電離源的選擇ESI適合于中等極性到強(qiáng)極性的化合物分子 特別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以獲得多個(gè)質(zhì)子的大分子 蛋白質(zhì) 只要有相對(duì)強(qiáng)的極性 ESI對(duì)小分子的分析常?？梢缘玫綕M意的結(jié)果 APCI不適合多電荷的大分子分析 它的優(yōu)勢在于非極性或中等極性的小分子的分析 83 電離方式ESI采用離子蒸發(fā)方式使樣品分子電離 而APCI電離是放電探針促使溶劑和其它反應(yīng)物電離 碰撞及電荷轉(zhuǎn)移等方式形成了反應(yīng)氣等離子區(qū) 樣品分子通過等離子區(qū)時(shí) 發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移 樣品流速APCI源允許的流量相對(duì)較大 0 2 2mL min 而ESI源允許流量相對(duì)較小 最大只能為1 0mL min 斷裂程度APCI源的探頭處于高溫 可使熱不穩(wěn)定的化合物分解 產(chǎn)生碎片 ESI源探頭處于常溫 常生成分子離子峰 不易產(chǎn)生碎片 靈敏度都很高 ESI有利于分析生物大分子及其他分子量大的化合物 而APCI更適合于分析極性小的化合物 多電荷APCI源不能生成一系列多電荷離子 所以不適合分析生物大分子 而ESI源特別適合于蛋白質(zhì) 多肽類的生物分子 由于它能產(chǎn)生一系列的多電荷離子 84 3 正負(fù)離子模式的選擇 正離子模式適合于堿性樣品 可用乙酸 pH 3 4 或甲酸 pH 2 3 對(duì)樣品加以酸化 負(fù)離子模式適合于酸性樣品 可用氨水或三乙胺對(duì)樣品進(jìn)行堿化 有些酸堿性并不明確的化合物 可優(yōu)先選用APCI 進(jìn)行測定 85 4 流動(dòng)相的選擇 常用的流動(dòng)相為甲醇 乙腈 水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液 如甲酸銨 乙酸銨等 還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸 乙酸和氨水等調(diào)節(jié)pH值 LC MS接口避免進(jìn)入不揮發(fā)的緩沖液 避免含磷和氯的緩沖液 含鈉和鉀的成分必須 lmmol l 鹽分太高會(huì)抑制離子源的信號(hào)和堵塞噴霧針及污染儀器 含甲酸 或乙酸 2 含三氟乙酸 0 5 含三乙胺 l 含醋酸銨 10一5mmol l 送樣前一定要摸好LC條件 能夠基本分離 緩沖體系符合MS要求 86 不適合的溶劑和緩沖液a不揮發(fā)的鹽b表面活性劑 洗滌劑c無機(jī)酸其它溶劑和調(diào)節(jié)劑a異丙醇 2 甲氧基乙醇及乙醇等b三氟醋酸 TFA 常用于LC MS分析肽和蛋白質(zhì)的化合物c三乙胺 TEA d四氫呋喃 THF 87 5 流量和色譜柱的選擇 不加熱ESI的最佳流速是1 50ul min 應(yīng)用4 6mm內(nèi)徑LC柱時(shí)要求柱后分流 目前大多采用l 2 1mm內(nèi)徑的微柱APCI的最佳流速 lml min 常規(guī)的直徑4 6mm柱最合適 為了提高分析效率 常采用 100mm的短柱 此時(shí)UV圖上并不能獲得完全分離 由于質(zhì)譜定量分析時(shí)使用MRM的功能 所以不要求各組分沒有完全分離 這對(duì)于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時(shí)間 88 6 輔助氣體流量和溫度的選擇 霧化氣對(duì)流出液形成噴霧有影響 干燥氣影響噴霧去溶劑效果 碰撞氣影響二級(jí)質(zhì)譜的產(chǎn)生 操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言 一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點(diǎn)20 左右即可 對(duì)熱不穩(wěn)定性化合物 要選用更低的溫度以避免顯著的分解 選用干燥氣溫度和流量大小時(shí)還要考慮流動(dòng)相的組成 有機(jī)溶劑比例高時(shí)可采用適當(dāng)?shù)偷臏囟群土髁啃∫稽c(diǎn)的 89 用大氣壓電離質(zhì)譜儀可以得到分子量信息 正離子方式常出現(xiàn)如下離子 Na22Da higherthanM H K38Da higherthanM H Li6Da higherthanM H NH417Da higherthanM H ACN40Da higherthanM H2M H 2M Na等負(fù)離子方式常出現(xiàn)如下離子 TFA114Da higherthenM H 113and227background Acetate60Da higherthenM H Formic46Da higherthenM H Cl36Da higherthanM H 90 影響分子量測定的因素 1 pH的影響 正離子方式pH要低些 負(fù)離子方式pH要高些 除對(duì)離子化有影響外 還影響LC的峰形 2 氣流和溫度 當(dāng)水含量高及流量大時(shí)要相應(yīng)增加 3 溶劑和緩沖液流量 流速適當(dāng)高可以提高出峰的靈敏度 4 溶劑和緩沖液的類型 通常正離子用甲醇好 負(fù)離子乙腈好些5 選擇合適的液相色譜類型 正相 反相 選擇合適的色譜柱6 合適的電壓 DP電壓高時(shí) 樣品在源內(nèi)分解或碎裂 高DP電壓時(shí)回使多電荷離子比例低 多聚體也減少7 樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì)8 雜質(zhì)的影響 溶劑的純度 水的純凈程度等 當(dāng)成分復(fù)雜 雜質(zhì)太多時(shí) 競爭使被測物離子化不好 同時(shí)使LC分離不好9 樣品濃度不夠 有時(shí)需要濃縮 91 分子量測定失敗的原因 a 流動(dòng)相不合適b 不揮發(fā)性鹽的影響c 成分復(fù)雜 雜質(zhì)太多d 樣品濃度不