微絲染色及形態(tài)觀察.ppt

目的要求 1 掌握微絲的染色方法 2 了解光鏡下微絲的基本形態(tài)結(jié)構(gòu) 3 了解細胞松弛素B對微絲的作用及原理 微絲染色及形態(tài)觀察 實驗原理 真核細胞質(zhì)中縱橫交錯的纖維網(wǎng)稱為細胞骨架 在維持細胞形狀和運動方面具有重要作用 根據(jù)組成成分和組裝結(jié)構(gòu)的不同 可將細胞骨架分為微管 微絲和中間纖維 微絲普遍存在于多種細胞 對細胞的形狀和運動有一定作用 微絲由蛋白單體聚合形成 細胞松馳素B可與微絲的亞單位肌動蛋白結(jié)合 從而破壞微絲 改變細胞的形狀 細胞松弛素B對微絲的作用具有可逆性 當細胞用TritonX 100溶液處理 能夠溶解質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中及細胞內(nèi)許多蛋白質(zhì) 而細胞骨架中的蛋白質(zhì)卻不被破壞 經(jīng)固定和考馬斯亮藍 非特異性蛋白質(zhì)染料 染色后 胞質(zhì)背景著色弱 微管等蛋白結(jié)構(gòu)在光鏡下無法分辨 在光鏡下觀察到主要是由微絲組成的應力纖維 應力纖維由平行排列的微絲組成 體外培養(yǎng)的貼壁細胞應力纖維尤為發(fā)達 形態(tài)長而直 常與細胞長軸平行并貫穿細胞全長 微絲在細胞內(nèi)的分布特征 實驗用品 器具 CO2恒溫培養(yǎng)箱 倒置顯微鏡 超凈工作臺 低速離心機 普通光學顯微鏡 移液器 恒溫箱 鑷子 培養(yǎng)皿 載玻片 蓋玻片 吸水紙 材料 蓋玻片培養(yǎng)的成纖維細胞試劑 6mmol LPBS pH6 5 1 TritonX 100溶液 M 緩沖液 3 戊二醛固定液 0 2 考馬斯亮藍染液 100 g ml的細胞松弛素B DMEM培養(yǎng)液 實驗步驟 1 培養(yǎng)在成纖維細胞進行傳代培養(yǎng)時 將已消毒的蓋玻片涂上多聚賴氨酸 放入培養(yǎng)皿中 于37 5 CO2的溫箱中生長24h 48h 設正常生長組和細胞松弛素B處理組 2 染色處理 1 取材取出鋪有細胞的蓋玻片 放入小培養(yǎng)皿中 正面向上 用PBS洗3次 從蓋玻片一角輕輕滴加3 4滴 洗去表面的培養(yǎng)液 2 抽提吸棄PBS 加入1 TritonX 100液4 5滴 剛好覆蓋蓋玻片表面 室溫處理25 30min 或置37 18min 3 穩(wěn)定吸棄TritonX 100 立即用M 緩沖液輕輕地洗滌3次 每次3min 4 固定略晾干 在3 戊二醛液中固定10min 再以PBS液洗3次 洗去固定液 5 染色滴加3 5滴0 2 考馬斯亮蘭染液染色20 30min 然后小心的用自來水漂洗 6 觀察留取少量水分封片于載玻片 吸水紙吸去多余的水 光鏡下觀察臨時裝片 實驗結(jié)果 光鏡觀察 微絲聚集成的應力纖維束被染成藍色 在沒用藥的標本上 成纖維細胞多數(shù)有突起 微絲沿突起規(guī)則排列 用細胞松弛素B處理的標本 由于微絲被破壞 突起縮回 多數(shù)細胞形狀變圓 用藥處理后又洗去藥的標本 由于解除了藥的作用 肌動蛋白重新聚合成微絲 細胞形狀恢復正常 1 光鏡下觀察被染成藍色的微絲聚集成的應力纖維束 注意成纖維細胞中微絲分布的特點 2 注意觀察正常對照片與用藥處理后的標本成纖維細胞形狀的區(qū)別 3 觀察用藥處理后又洗去藥的標本中細胞形態(tài)是否恢復正常 光學顯微鏡下微絲分布圖 注意事項 1 洗片時要輕柔 以免把細胞從載玻片上洗去 2 恢復時間要足夠 否則細胞不會恢復到未處理前的狀態(tài) 3 操作中應注意區(qū)分細胞蓋玻片的正反面 4 染色后應沖洗蓋玻片背面 避免損傷細胞 5 TritonX 100抽提蛋白時 注意避免抽提時間過長而導致細胞結(jié)構(gòu)的破壞 作業(yè)與思考題 1 比較三種不