包涵體的純化和復性總結(jié)--最全的前人經(jīng)驗.doc

包涵體的純化和復性總結(jié)二、包涵體的洗滌 1、包涵體的洗滌問題 通常的洗滌方法一般是洗不干凈的，我以前是這么做的，先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過濾除去未溶解的物質(zhì)，注意留樣跑電泳，然后用水稀釋到4M,離心把沉淀和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，你可以找到一個合適去除雜質(zhì)的辦法，其實這就是梯度沉淀的方法，我覺得比通常的直接洗脫效果好。 包涵體一般難溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑電泳對比，因為有時候難溶解的就是你的目標蛋白，所以每次處理都要把上清和沉淀跑電泳對比，免得把目標蛋白弄丟了。 此外剛處理完的包涵體好溶解。冷凍后難溶解，溶解也需要長點時間，也需要大量的溶劑。如果說是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。 2、如何得到比較純的包涵體 對于包涵體的純化，包涵體的前處理是很重要的。 包涵體中主要含有重組蛋白,但也含有一些細菌成分,如一些外膜蛋白、質(zhì)粒和其它雜質(zhì)。洗滌常用1%以下的中性去垢劑，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和還原劑2-巰基蘇糖醇（DTT）、-巰基乙醇等反復多次進行，因去垢劑洗滌能力隨溶液離子強度升高而加強，在洗滌包涵體時可加50mMNaCL。這樣提取的包涵體純度至少可達50%以上，而且可保持元結(jié)構。也可用低濃度的鹽酸胍或尿素/中性去垢劑/EDTA/還原劑等洗去包涵體表面吸附的大部分不溶性雜蛋白。洗滌液pH以與工程菌生理條件相近為宜，使用的還原劑為0.1-5mM。EDTA為0.1-0.3mM。去垢劑如TritonX-100、脫氧膽酸鹽和低濃度的變性劑如尿素充分洗滌去除雜質(zhì),這一步很重要,因為大腸桿菌外膜蛋白OmpT(37KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵體的溶解和復性過程中可導致重組蛋白質(zhì)的降解。 對于尿素和鹽酸胍的選擇： 尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑，易經(jīng)透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質(zhì)的氨基進行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復性后除去不會造成大量蛋白質(zhì)沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點，故目前已被廣泛采用。 鹽酸胍溶解能力達95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質(zhì)的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀、復性后除去可能造成大量蛋白質(zhì)沉淀和對蛋白質(zhì)離子交換色譜有干擾等缺點。 包涵體最后的純化，一般是離子交換，疏水，或者是親和層析，親和層析尤其是金屬螯合層析用得比較廣泛，而純化的效果也不錯，通常是一步就能達到純度為95%以上的包涵體。 8M高濃度尿素溶解后離心獲得的包涵體溶解液，放在4度冰箱過夜后出現(xiàn)沉淀，這種現(xiàn)象我也在實驗中遇到過;開始感覺很奇怪，后來發(fā)現(xiàn)是我們的冰箱的溫控出了問題實驗三、關于包涵體的溶解： 1、請教GST包涵體溶解 2、包涵體的溶解 十二烷基肌氨酸鈉與十二烷基肌氨酸在溶解包涵體時，可不可以互相代替？可以替換，調(diào)pH不久沒什么區(qū)別了嗎；兩者的功能團相同，pH不同，前者鈉鹽便于保存罷了 3、有關包涵體的溶解問題 強的變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnHCl6M），是通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學鍵，使多肽伸展，一般來講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，因為鹽酸胍是較尿素強的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導致多肽鏈的自由氨基甲?；?，特別是在堿性pH值下長期保溫時。SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等是去垢劑，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。另外，對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。對于目標蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。 4、8M尿素溶解的包涵體溶液應如何保存? 我在4度放了半個月，目前沒出什么問題 5、8M尿素溶解的包涵體溶液在室溫下可以放多久而不出現(xiàn)問題? BI溶液在室溫放置48小時，可能會對目的蛋白有影響，因為尿素在堿性條件下可使一些氨基酸?；蚨缧┨幚鞡I溶液比較好。具體有什么影響我也不是很清楚。 做完裂解之后加TritonX100輕搖min，蛋白溶解的會多些四、包涵體的復性 1、包涵體如何復性 包涵體的復性主要有兩種方式： 1，稀釋溶液，但是操作的液體量大，蛋白稀釋 2，透析，超濾或電滲透析去除變性劑 其中透析很適合實驗室應用，但是時間長。另外，如果蛋白質(zhì)右兩個以上的2硫鍵，很可能錯誤形成配對，應用還原劑。還有，復性的具體方法還要根據(jù)前期試驗及篩選來確包涵體的復性還要注意以下幾點： 1.首先要獲得較高純度的包涵體。 2.包涵體溶解要徹底，一般應使溶解液體量較大，不要怕蛋白被稀釋，要有助溶措施。 3.透析前后均要離心 4.透析不能太快. 5.純化的最佳條件要摸索。 小技巧： 1）包含體要徹底洗滌干凈，洗滌液中加入適量Triton-X100. 2)包含體溶解后裝入透析袋在復性液中復性 3）復性液的組成很有講究，本人使用OxidisedGlutathione/ReducedGlutathione還加入一定的L-Arginine-Hydrochloride12-24h 4)復性完畢在低濃度的緩沖液中連續(xù)緩慢透析12-24h 5)復性率的測定據(jù)變性蛋白和非變性蛋白的光學性質(zhì)不同測定（望有經(jīng)驗的戰(zhàn)友能更詳細地講解） 6）TritionX100、SDS這一類去垢劑最后不易去除，在制藥行業(yè)中一般不允許采用。好像SDS最后殘留量不能大于0.5%吧，忘了。我用Triton洗滌有些包涵體效果不是很好。包涵體洗滌是純化極為重要的一步，改變培養(yǎng)條件，再洗滌包涵體，有時可以在上柱前已經(jīng)只剩下3-4條雜帶，這樣后續(xù)的純化就很方便了。因為色譜柱的純化條件比較難optimize。 這段文字可以參考： 用Novagen公司pETSystemManual提供的方法，分別進行細菌滲透休克，超聲波裂解，研究融合蛋白在細胞周質(zhì)，細胞質(zhì)和包涵體中的分布。 滲透休克用1.2.3方法誘導細菌（10ml體積），測菌液OD600，10000r/min離心0.5min去上清，加入滲透休克溶液1（V1=OD600V2/5，V1為滲透休克溶液1，V2為培養(yǎng)新鮮菌液），冰浴10min，10000r/min離心0.5min，去上清。加V1體積滲透休克溶液2重懸，搖動冰浴10min，10000r/min離心0.5min，保存上清、細菌沉淀。作如下處理：上清用三氯乙酸(TCATrichloroaceticacid)沉淀，加1/10體積100%TCA(w/v)，渦漩15sec.，冰浴10min，13000r/min離心5min，100ul丙酮洗滌沉淀，干燥1h，加V1/2體積1PBS（pH10）溶解，-20保存，取10ul加入等體積2SB，進行12%SDS-PAGE電泳分析，UNIUERSALHooD-S.N.75s成像系統(tǒng)照相。 超聲波裂解細菌滲透休克細菌沉淀加1/10培養(yǎng)體積20mMTris-HCl（pH7.5，0）重懸，冰浴，超聲波裂解，20%工作選擇，脈沖粉碎1min，然后13000r/min離心5min，-20保存上清、細菌沉淀。上清進行TCA沉淀，處理同上。沉淀用ProteinExtractionReagent（Ni-NTAHiBindPurificationKitBugBuster.提供）按Novagen公司pETSystemManual提供方法反復處理，洗滌包涵體。包涵體按培養(yǎng)菌100OD600/3ul體積加1%SDS溶解，加等體積2SB，進行12%SDS-PAGE電泳分析，進行蛋白條帶灰度掃描，計算融合蛋白Trx-PrPC27-30占細菌總蛋白的相對含量。 1.2.7重組融合蛋白的純化PrP-pET-32a（+）轉(zhuǎn)化表達菌E.coliBL21（DE3），TB培養(yǎng)基中，25，AMP200ug/ml，搖床（250rmin）培養(yǎng)至OD600約為1.5，更換等體積新鮮TB培養(yǎng)基，加入IPTG至終濃度1mM，AMP200ug/ml，25，4h，4000g離心收集菌體。按Ni-NTAHiBindPurificationKit使用說明溶解包涵體，純化融合蛋白。 或使用筆者改進方法，將Ni-NTAHiBindPurificationKit使用說明中BufferD改成Wash-Buffer，Buffer-E改成Elute-Buffer，最后用Buffer-E重生Ni-NTAHiBindRasin，Binding-Buffer平衡以后加50%酒精保存，以免長菌。 洗脫所得蛋白用TCA沉淀，處理同上，得融合蛋白Trx-PrPC27-30，凍干保存。然后12%SDS-PAGE凝膠電泳分析。 3、包涵體復性2 精氨酸可助溶，但精氨酸是代謝產(chǎn)物高濃度對人可能不好。 另外甘氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以試一試。 對于疏水蛋白的可溶表達，可以降低誘導溫度（可以試試4度誘導過夜）和IPTG的量，降低蛋白的表達速度，從而減少包涵體形成的速度，增加正確折疊蛋白的量。或者換成GST融合表達載體，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表達。我的蛋白包涵體在經(jīng)變性純化后透析復性過程中，在透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果。我想對于你的情況，由于含有二硫鍵，還要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成正確的二硫鍵。復性是一個很難捉摸的過程，不同蛋白的復性條件也各不相同。 5、包涵體復性問題 包含體復性三大原則：1。低濃度 2。平緩梯度 3。低溫 有蛋白析出最大的可能型是：蛋白濃度太高，建議你稀釋以后再作透析。 此外，透析的鹽濃度（比如ura）要平緩降低：8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。 6、包涵體復性形成聚集物 關鍵是蛋白在復性過程中凝聚了以后，調(diào)節(jié)PH可以使其溶解，但是這樣復性好的蛋白有沒有活性還是問題，雖然樣品溶解了，但活性不高或沒有也不行呀！ 7、復性中蛋白析出！ 出現(xiàn)蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈了。復性應該采取復性液濃度和PH值逐漸變化的方法，例如根據(jù)你包含體的溶液成分，每隔1個PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。但是復性的比率應該很低。 若加變性劑尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M； 另外可將甘油濃度增加，范圍可在30%，且在復性樣品中也可加適量甘油；一些拙見。 8、包涵體復性液配方 對于包涵體復性，一般在尿素濃度4M左右時復性過程開始，到2M左右時結(jié)束。對于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M時復性過程已經(jīng)結(jié)束。TRIS系統(tǒng)和PBS系統(tǒng)都沒有明確的規(guī)定，這些需要你在實驗過程中不斷試驗，確定合適的緩沖系統(tǒng)；不過復性過程主要是注意以下幾個問題： 1）最適pH值范圍為8.0-9.0之間； 2)溫度適宜選擇4； 3）復性過程蛋白濃度不宜過大，一般為0.1-0.2mg/mL； 4)復性時間一般為24-36小時； 5)低分子化合物如L-Arg有助于增加復性中間產(chǎn)物的溶解度；脲、鹽酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進劑，都可阻止蛋白聚集；EDTA可以防止蛋白降解； 6)氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等.。 還有就是你的蛋白質(zhì)的特性 9、什么叫復性成功 復性效果的檢測： 根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對蛋白質(zhì)的復性效率進行檢測。 1，凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復性后二硫鍵的配對情況。 2，光譜學方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學特征進行復性情況的檢測，但一般只用于復性研究中的過程檢測。 3，色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同， 4，生物學活性及比活測定：一般用細胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了復性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。 5，黏度和濁度測定：復性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。 6，免疫學方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結(jié)構決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。 在正常的生理條件下，組成蛋白質(zhì)的多肽鏈都能以獨特的方式進行折疊，形成自己特有的空間結(jié)構，以執(zhí)行某一些生命活動。當外界環(huán)境改變時，可能造成基因突變和蛋白質(zhì)序列改變，錯誤剪接和運輸，錯誤折疊和異常聚積，形成對機體有害的反應，引起構象病的發(fā)生和無生物活性、不可溶的包涵體形成。目前對包涵體形成和復性過程中發(fā)生聚集的機制尚不清楚，許多已建立的高效復性方法是在反復實驗和優(yōu)化的基礎上建立的，且沒有普遍性，但從這許許多多的個例中發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律：如聚集的發(fā)生是由鏈間的疏水相互作用介導、聚集具有相對特異性、折疊中間體可能具有不同的作用等等，并利用這些知識建立了一些重組蛋白質(zhì)高效復興性的方法。相信隨著結(jié)構生物學、生物信息學、蛋白質(zhì)工程學及相關新技術和新設備的發(fā)展和完善，在不久的將來，預測和設計最佳復性方案將成為可能。 另外，還向這位戰(zhàn)友薦一文章，有關包涵體蛋白復性的文章！9.0溶解牛生長激素和牛凝乳蛋白酶包涵體。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這些方法只適合于少部分蛋白的增溶。 變性劑的使用濃度和作用時間：一般在偏堿性性的環(huán)境中如pH8.0-9.0，尿素在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，一般不要超過pH1.0。有些蛋白只能用鹽酸胍如IL-4。增溶時一般室溫過夜，但鹽酸胍在37度1小時便可以使多數(shù)蛋白完全變性溶解。 還原劑： 由于蛋白間二硫鍵的存在，在增溶時一般使用還原劑。還原劑的使用濃度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文獻使用5mM濃度。在較粗放的條件下，可以使用5ml/l的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無關，而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無影響，如牛生長激素包涵體的增溶。對于目標蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。 復性： 通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態(tài)恢復到正常的折疊結(jié)構，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時復性過程開始，到2M左右時結(jié)束。對于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M時復性過程已經(jīng)結(jié)束。 復性中常采用的方法有： 稀釋復性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。 透析復性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，有人稱易形成沉淀，且不適合大規(guī)模操作，無法應用到生產(chǎn)規(guī)模。 超濾復性：在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，易于對透析速度進行控制，缺點是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。 柱上復性：是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中應用的一種復性方法，如華北制藥的G-CSF復性據(jù)說是通過柱上復性進行的。常用于復性的層析方法有SEC、HIC等。 還原劑的去除： 還原劑一般和變性劑的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫鍵慢慢形成。但是由于二硫鍵的形成并不是蛋白質(zhì)正確折疊所必須的，可以考慮在變性劑完全去除之后，在去除還原劑使已經(jīng)按照正確的結(jié)構相互接近的巰基間形成正確的二硫鍵。 常用的氧化方法有： 空氣氧化法：在堿性條件下通空氣，或者加入二價銅離子，能夠取得更好的效果，缺點是不易控制氧化還原電勢。 氧化還原電對（redox）：常采用GSSG/GSH，通過調(diào)整兩者的比例來控制較精確的氧化還原電勢，也可以在添加了還原劑如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mMDTT=GSH/GSSG(1.33/1)。 復性的效率： 復性是一個非常復雜的過程，除與蛋白質(zhì)復性的過程控制相關外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關，有些蛋白非常容易復性，如牛胰RNA酶有12對二硫鍵，在較寬松的條件下復性效率可以達到95%以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M行復性的方法如IL-11，很多蛋白的復性效率只有百分之零點幾。一般說來，蛋白質(zhì)的復性效率在20%左右。影響復性效率的因素有蛋白質(zhì)的復性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。 復性過程的添加劑： 1、共溶劑：如PEG6000-20000，據(jù)說可以可逆的修飾折疊中間體的疏水集團，此外由于阻止了蛋白質(zhì)分子間的相互接觸的機會，也可能對復性效率的提高起作用。一般的使用濃度在0.1%左右，具體條件可根據(jù)實驗條件確定。 2、二硫鍵異構酶（PDI）和脯氨酸異構酶（PPI）：PDI可以使錯配的二硫鍵打開并重新組合，從而有利于恢復到正常的結(jié)構，此外在復性過程中蛋白質(zhì)的脯氨酸兩種構象間的轉(zhuǎn)變需要較高能量，常常是復性過程中的限速步驟，而PPI的作用是促進兩種構象間的轉(zhuǎn)變，從而促進復性的進行。 3、分子伴侶，即熱休克蛋白（HSP），是一種沒有蛋白質(zhì)特異性的促進折疊的蛋白因子，研究發(fā)現(xiàn)很多蛋白在缺乏分子伴侶時無法自己正確的折疊。有人構建了與伴侶分子共同表達的菌株，據(jù)說效果不錯。不過在生產(chǎn)中還沒有看到2和3的應用的例子。 4、0.4-0.6ML-Arg：成功的應用于很多蛋白如t-PA的復性中，可以抑制二聚體的形成。 5、甘油等：增加黏度，減少分子碰撞機會，一般使用濃度在%5-30%。 6、一定的鹽濃度，可能是為了降低某些帶電集團間的斥力，有利于蛋白質(zhì)的折疊。 7、輔助因子：添加蛋白質(zhì)活性狀態(tài)必須的輔助因子如輔酶輔基等或蛋白配體等很多時候?qū)Φ鞍踪|(zhì)正確的折疊是有利的。 8、色譜法：通過將目標蛋白結(jié)合到層析柱上，減少蛋白分子間的相互影響，該方法得到越來越多的應用，常用的色譜有SEC、HIC、IEC、IMAC等。 當然，雖然有很多所謂的理性的復性方案設計，目前的復性工作更多的是一個經(jīng)驗的過程，沒有一種通用的方法可以套用。 復性時的蛋白濃度： 一般使用濃度為0.1-1mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉淀，太低的濃度不經(jīng)濟，而且很多蛋白在低濃度時不穩(wěn)定，很容易變性。 復性效果的檢測： 根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對蛋白質(zhì)的復性效率進行檢測。 1、凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復性后二硫鍵的配對情況。 2、光譜學方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學特征進行復性情況的檢測，但一般只用于復性研究中的過程檢測。 3、色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同。 4、生物學活性及比活測定：一般用細胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了復性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。 5、黏度和濁度測定：復性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。 6、免疫學方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結(jié)構決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。 幾個復性的實例： 1、MHCIIJBC269（47）：1994 增溶：16-40mgProtein,8MGdnHCl,16-32mMDTT,1mMEDTA,50mMTrispH8.037度1hr. 復性：8-16folddilutionto1-5mg/mlProtein. 2、增溶：10mMDTT,0.1%SDS,25mMTris,200mMGlucinepH8.5. 復性：10倍稀釋到10mMDTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTrispH8.0.對起始緩沖液密閉透析16hr，開口透析8hr，對150mMNaCl,10mMTrispH8.0透析48hr。 3、BovinePrethrombin-2,JBC270(1):1990四對二硫鍵。 增溶：7MGdnHCl,10mMTrispH8.0,1mMEDTA4mg/ml. 復性：稀釋到100mMNa2HPO4,2mMEDTA,0.1%PEG,0-4MGdnHCl,0.1mMGSSG,0.2mMGSH,pH7.4,0.025mg/mlProtein.RT24hr.對4L25mMsodiumphosphate,2mMEDTA,0.1%PEG,pH7.4透析3次，溫度4度。 純化： 一般說來，復性液的體積較大，為了減少處理體積，在進行柱純化以前可以先進行硫酸銨沉淀，沉淀在低速離心收集后復溶的鹽濃度較高，可以直接進行HIC純化，目標峰經(jīng)適當稀釋后（cond5mS/cm）進行IEX純化，然后通過SEC脫鹽，更換緩沖液，除菌過濾后，在質(zhì)量合格的情況下便可以進入制劑階段。 當然在復性濃度較高的情況下，也可以直接將復性液進行IEX純化，優(yōu)點是在純化的同時進行體積的濃縮，為以后的精制創(chuàng)造條件。 從生產(chǎn)的角度看，由于每增加一步純化工序便降低很多收率，所以可過兩到三次柱純化，工藝越簡單越有利于收率的提高。當然這只是一個一般的原則，對于純度要求較高的產(chǎn)品如重組人白蛋白，不得不進行多次純化。包涵體的純化和復性總結(jié)關于包涵體的純化是一個令人頭疼的問題，包涵體的復性已經(jīng)成為生物制藥的瓶頸，關于包涵體的處理一般包括這么幾步：菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、復性以及純化，內(nèi)容比較龐雜 一、菌體的裂解 1、怎樣裂解細菌？ 細胞的破碎方法 .超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應采取相應降溫措施，時間以及超聲間歇時間、超聲時間可以自己調(diào)整，超聲完全了菌液應該變清亮，如果不放心可以在顯微鏡下觀察。對超聲波及熱敏感的蛋白和核酸應慎用。 無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且應該在破碎的同時多加幾次；另外，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。 這是標準配方: 裂解液：50mMTris-HCl(pH8.59.0),2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在這個pH范圍內(nèi)比較好發(fā)揮作用) 但我個人的經(jīng)驗是:如果你裂解細菌是為了提取蛋白的話,而且蛋白的分子量又小于20kd的話,盡量減少溶菌酶的用量,會引入溶菌酶這種雜蛋白.一般配60ml裂解液用藥匙匙柄盛一點就夠.判斷裂解好壞的標準是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml緩沖液(菌體洗滌液,裂解液等)/1g濕菌體. 如果只做一個鑒定,我覺得100-200ml菌就夠了. 但凡超聲,我都用60ml裂解液,因為我們的超聲儀(現(xiàn)代分子生物學實驗技術錄象里的那種)很適合用100ml小燒杯,裝60ml裂解液,這樣能讓超聲頭離液面不高不低,不會冒泡泡,也不會灑出來.菌多我就延長超聲時間. 沉淀,也就是包涵體沉淀,如果要上柱純化,一定要先用4M尿素洗滌一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑電泳,可以直接用8M尿素溶解以后,離心取上清,加入適量體積的2、表達重組蛋白時，細菌裂解方法都有哪些？ 在表達重組蛋白時，誘導以后跑SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)表達都很好，但是在裂解細胞時遇到問題?？偸遣荒軓氐琢呀饧毎?首先我采用超聲裂解，可是不管我如何超聲總有部分細菌沒有裂解。 我的超聲條件如下：寧波新芝超聲細胞破碎儀，功率400W，超5秒，間隔5秒，重復99次。然后顯微鏡觀察，不徹底時再重復99次。菌體來自200ml培養(yǎng)液，用20mlPBS重懸。 然后我又嘗試加溶菌酶，首先加至終濃度100ug/ml，4C半小時菌液不變粘，加大濃度至1mg/ml，半小時后仍無明顯變化。因為我用的PBS是pH7.4，我懷疑是pH不合適，換用pH8.0TEbuffer，1mg/ml溶菌酶，4C半小時仍無明顯變粘。因為這次使用的溶菌酶是前一天配好的，擔心溶菌酶失效，重新稱取凍干粉末，直接加入菌液，仍然沒有明顯變化。 真是郁悶。到底出了什么事？請高手解答，并介紹優(yōu)化的方案。 同時希望能介紹一下如何選擇細胞破碎方法，以及如何確定最佳條件。 溶菌酶在pH7.4時是否沒有活性了？可否配成濃縮液保存溶菌酶，如果可以，應如何保存？ 加入溶菌酶以后，如果細胞壁已破壞，菌液應該變粘吧，因為核酸被釋放出來。 而超聲破碎細胞，我覺得菌液是不會變粘的，因為超聲可以把大分子核酸打碎成小片段。 我判斷細胞破碎不完全是因為，在將破碎后樣品離心分離上清和沉淀跑SDS-PAGE觀察，發(fā)現(xiàn)在細胞碎片組分中除了經(jīng)常出現(xiàn)的一兩條帶以外，還有菌體總蛋白樣品中的很多帶出現(xiàn)。據(jù)此可以判斷細胞只是部分破碎。 不知我的分析是否正確，請版主和各位高手指教。 如果溶菌酶效果還可以，我覺得先用溶菌酶初步裂解細胞，然后再用超聲進一步破碎并斷裂大分子核酸以降低粘度的細胞破碎策略可能比較好。因為超聲有可能使蛋白變性，但單用溶菌酶不能確定是否完全破碎，還要再加核酸酶降低粘度。這種兩步法策略應該還可以減少破碎條件優(yōu)化的時間。 我用的溶菌酶放置時間比較長了，有可能失活了。我剛從生工又定了一支，不過得后天到貨，但愿它有用。 如何觀察溶菌酶是否已裂解細胞，通過觀察粘度變化是否可以？ 只反復凍融是否可以有效裂解大腸桿菌細胞？ 溶菌酶只有在pH值大于8.0的條件下才能發(fā)揮溶菌作用，請務必保持PBS的pH8.0，同時溶菌酶的量一定要足！ 在加入溶菌酶后，最好放于磁力攪拌器上攪拌30分鐘，再進行超聲破菌，我的超聲條件是：功率400W，工作2秒，間隔2秒，重復199次。菌體來自500ml培養(yǎng)物，用30mlPBS重懸，超聲效率還是可以的。 哪兒的溶菌酶好用？ 我用生工的溶菌酶，稱取干粉20mg。200ml菌液用18mlNaCl重懸，加入2ml25mMTris-HCl(pH8.0)，將溶菌酶干粉加入體系，混勻，測pH降低到56，加20ul2MTris堿，體系pH升到8。4C放置1小時，菌液上層變澄清，搖動發(fā)現(xiàn)體系沒有變粘。測pH仍在8左右。再37C保溫1小時，還沒有變化，我簡直不知如何才好了。 另一瓶200ml培養(yǎng)物，溶菌酶處理1小時后超聲。條件：300W，超5秒停5秒，重復99次。菌液有變化，但很不明顯。繼續(xù)超聲400次，從外觀來看沒有太大區(qū)別。我簡直要說tmd了。見鬼了。 我的操作有什么地方不妥當，請各位指正。 溶菌酶的廠商要求是否很重要？ 我的誘導物來自1：20過夜培養(yǎng)物接種，37C生長3小時后30C誘導2小時（0.8mMIPTG）。 是否菌液太濃，Pharmacia的說明書200ml培養(yǎng)物用10ml重懸，我用20ml，仍然不夠?。坑腥烁嬖V我菌液應該稀一些，200ml用3040ml重懸。但實際操作也不夠理想。 SDS-PAGE總是觀察到細胞破碎效果不夠徹底。超聲那么多次，蛋白都要被超碎變性了。 3、酵母的破碎 酵母是一類單細胞真菌的總稱，其成員分別屬于不同的真菌綱，細胞壁成分是否會有較大差別，這些都是做破碎酵母細胞前要考慮的。我歸納了一下，做破碎酵母的幾種方法： 1機械的方法：一般的PROTOCOL都是用glassbeads：如sigmaG-8772，加玻璃珠后超聲，蛋白活性保持較好。 2化學裂解的方法：10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分攪拌至液體狀（希望高手點評） 3尿素裂解液（尿素8mol/L,NaCl0.5mol/L,Tris20mmol/L,EDTA20mmol/L,2%SDS,PH值8.0）高壓勻漿。（這個好象也該在方法2中） 4液氮凍融并研磨酵母破壁，我認為這種可能在小試中比較合適。 5溫和的酶法，可能不會會破壞酵母原生質(zhì)體 酶法裂解主要用兩種酶：1。蝸牛酶，可以直接從蝸牛的胃液中獲得；2。lyticase，可以從sigma定購。這兩種酶解法都可以和上面的幾種方法結(jié)合使用，尤其是glassbeads方法，效果很好。 我用過化學裂解的方法，10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分攪拌至液體狀。此法的裂解效果不錯的，不妨試一下。 一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L,NaCl0.5mol/L,Tris20mmol/L,EDTA20mmol/L,2%SDS,PH值8.0），據(jù)說效果可以 酵母破碎效果好的我所做過的方法中還是玻璃珠，就象microbe和rongjunli所說的那樣，效率很高的，而且對目的蛋白活性不會有什么影響。一般應該用這個方法。 4、超聲破碎的條件選擇 超聲破碎的條件不能一概而論，要看你的實驗要求，有的是細菌破碎，有的是對組織細胞進行破碎，要掌握好功率和每次超聲時間，功率大時，每次超聲時間可縮短，不能讓溫度升高，必要時在冰浴條件下進行超聲破碎。至于每次超聲時是否起泡沫到不是關鍵的問題，這與你超聲的量明顯有關。 5、如何鑒定細菌超聲破碎的程度 最簡單的方法：涂片-革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘-顯微鏡觀察 切記：只用結(jié)晶紫染色，別忘了染色后再用水稍沖洗一下 6、細菌裂解的DNaseI 不同純度的酶換算標準不同，所以你最好查查是哪個公司的酶？仔細看說明書，可能會有換算說明。 另外看一下參考文獻所用的酶是哪個公司的，到該公司的主頁也可能有收獲。 我用過華美和TAKARA的DNA酶，華美的是用mg/ml。華美也有RNasefree的DNA酶，定量用活性單位。TAKARA的兩種酶都是用活性單位定量的。 我在超聲裂解細菌時加入一些DNA酶，一般用超聲液加不同量的酶做一個預實驗，選取符合你需要的酶量。 其實根據(jù)目的和方法的不同，所需要的酶量也是可調(diào)節(jié)的，比如酶切溫度（16度或37度）。 7、超聲裂解細菌是否完全？ 最簡單的方法：涂片-革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘-顯微鏡觀察 切記：只用結(jié)晶紫染色 二、包涵體的洗滌 1、包涵體的洗滌問題 通常的洗滌方法一般是洗不干凈的，我以前是這么做的，先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過濾除去未溶解的物質(zhì)，注意留樣跑電泳，然后用水稀釋到4M,離心把沉淀和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，你可以找到一個合適去除雜質(zhì)的辦法，其實這就是梯度沉淀的方法，我覺得比通常的直接洗脫效果好。 包涵體一般難溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑電泳對比，因為有時候難溶解的就是你的目標蛋白，所以每次處理都要把上清和沉淀跑電泳對比，免得把目標蛋白弄丟了。 此外剛處理完的包涵體好溶解。冷凍后難溶解，溶解也需要長點時間，也需要大量的溶劑。如果說是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。 2、如何得到比較純的包涵體 對于包涵體的純化，包涵體的前處理是很重要的。 包涵體中主要含有重組蛋白,但也含有一些細菌成分,如一些外膜蛋白、質(zhì)粒和其它雜質(zhì)。洗滌常用1%以下的中性去垢劑，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和還原劑2-巰基蘇糖醇（DTT）、-巰基乙醇等反復多次進行，因去垢劑洗滌能力隨溶液離子強度升高而加強，在洗滌包涵體時可加50mMNaCL。這樣提取的包涵體純度至少可達50%以上，而且可保持元結(jié)構。也可用低濃度的鹽酸胍或尿素/中性去垢劑/EDTA/還原劑等洗去包涵體表面吸附的大部分不溶性雜蛋白。洗滌液pH以與工程菌生理條件相近為宜，使用的還原劑為0.1-5mM。EDTA為0.1-0.3mM。去垢劑如TritonX-100、脫氧膽酸鹽和低濃度的變性劑如尿素充分洗滌去除雜質(zhì),這一步很重要,因為大腸桿菌外膜蛋白OmpT(37KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵體的溶解和復性過程中可導致重組蛋白質(zhì)的降解。 對于尿素和鹽酸胍的選擇： 尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑，易經(jīng)透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質(zhì)的氨基進行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復性后除去不會造成大量蛋白質(zhì)沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點，故目前已被廣泛采用。 鹽酸胍溶解能力達95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質(zhì)的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀、復性后除去可能造成大量蛋白質(zhì)沉淀和對蛋白質(zhì)離子交換色譜有干擾等缺點。 包涵體最后的純化，一般是離子交換，疏水，或者是親和層析，親和層析尤其是金屬螯合層析用得比較廣泛，而純化的效果也不錯，通常是一步就能達到純度為95%以上的包涵體。 8M高濃度尿素溶解后離心獲得的包涵體溶解液，放在4度冰箱過夜后出現(xiàn)沉淀，這種現(xiàn)象我也在實驗中遇到過;開始感覺很奇怪，后來發(fā)現(xiàn)是我們的冰箱的溫控出了問題實驗際溫度要比設定溫度低至少4度（呵呵，不好意思?。２贿^我接著往下進行SDS-PAGE、層析等發(fā)現(xiàn)沒有什么不良影響。所以，你不用擔心也許你的蛋白也只是和你開了個玩笑呢！ 三、關于包涵體的溶解： 1、請教GST包涵體溶解 直接用8M的脲或6M胍融解，取上清，測濃度。直接稀釋后包被檢測相應抗體。（由于快速稀釋相當于復性過程，產(chǎn)物用于檢測沒有問題的） 我所用的包涵體提取方法： 1PBS或生理鹽水洗滌誘導后菌體，BufferA重懸菌體，超聲波破碎至清亮 度，rpm離心分鐘，棄上清 用或生理鹽水洗滌沉淀次 往沉淀中加mlBufferA及ml的（十二烷基肌氨酸鈉）貯存液，劇烈攪動，使其緩慢溶解，室溫靜置分鐘至小時 度，rpm離心分鐘，取上清 加ul至終濃度為，加mM的氧化型谷胱甘肽ul至終濃度為mM,加100mM的還原型谷胱甘肽ul至終濃度為mM,靜置分鐘至小時（亦可度復性過夜） 以（pH8.0)或（pH8.0)透析，取出度保存?zhèn)溆?！BufferA配方： Tris-base50mM E