微生物檢查方法驗證(2012GMP培訓).ppt

微生物檢查方法驗證 介紹內(nèi)容 一 微生物的基礎知識二 微生物檢查方法驗證 微生物基礎知識 微生物 microorganism microbe 是一些肉眼看不見的微小生物的總稱 微生物 microorganism 包括細菌 支原體 螺旋體 衣原體 立克次體 病毒及真菌霉菌 酵母菌和放線菌 等 微生物的特點 種類多分布廣迄今為止 我們知道的微生物約有10萬種 只占地球上實際存在的微生物總數(shù)的20 微生物的特點 各體小 表面積大物體的表面積和體積之比稱為表面積 大腸埃希菌的表面積是人的30萬倍 微生物的特點 吸收多轉(zhuǎn)化快如大腸埃希菌在合適條件下 每小時可以消耗相當于自身重量2000倍的數(shù)量 而人體則需要40年之久 微生物的特點 適應強易變異多數(shù)細菌能耐0 196 的低溫 硫細菌可在250 300 的高溫條件下正常生長 一些嗜鹽細菌甚至能在飽和鹽水中正常生活 產(chǎn)芽孢細菌和真菌孢子在干燥條件下能保藏幾十年 幾百年 微生物的類群和形態(tài)結構 微生物按其結構 化學組成及生活習性等分為三大類 原核細胞型 細菌 放線菌 支原體 衣原體 立克次氏體 螺旋體等真核細胞型 真菌非細胞型 病毒噬菌體 細菌的繁殖 細菌 bacterium 屬于原核細胞型微生物 其特點是具有細胞壁 原始的核質(zhì) 以二分裂方式繁殖 了解細菌的基本特性 細菌的鑒別 對新藥的研發(fā)和防止藥品污染 保證藥品質(zhì)量具有重要的意義 細菌的形態(tài) 細菌體積微小 是無色半透明的 用肉眼直接觀察難以看到 其結構和形狀須經(jīng)過顯微鏡放大數(shù)百倍至上千倍才能觀察 一般以微米 m 作為測量單位 在細菌學中 按其形態(tài)可分為球菌 桿菌 弧菌和螺桿菌 經(jīng)革蘭染色法 Gramstain 可將細菌分成兩大類 革蘭陽性菌 G 和革蘭陰性菌 G 細菌的形態(tài) 細菌的形態(tài) 真菌 fungus eumycetes 是具有真核和細胞壁的生物 種類很多 已報道的種超過10萬個 大多是由纖細管狀菌絲構成的菌絲體 許多菌絲在一起統(tǒng)稱菌絲體 菌絲體在基質(zhì)上生長的形態(tài)稱為菌落 細菌的形態(tài) 真菌的形態(tài)具有多樣性 大小不一 大的用肉眼可以看到 小的用普通光學顯微鏡放大數(shù)倍乃至千倍方可觀察到 其形態(tài)分單細胞 多細胞 單細胞呈圓形或卵圓形 如酵母菌 yeast 多細胞由菌絲和孢子組成 并交織成團 藥品污染常見的真菌 毛霉屬 根霉屬 曲霉屬 青霉屬 木霉屬 毛霉屬 MucorMicheliexFries 毛霉屬在自然界分布很廣 常用于發(fā)酵工業(yè) 并引起水分高的糧食及食品的霉爛變質(zhì) 毛霉屬的分枝類型 1 單生 不分枝 2 總狀分枝3 假軸狀分枝 毛霉的孢子囊 1 孢子2 膜3 囊軸4 孢子囊柄 根霉屬 RhizopusEhrenberg 根霉屬廣泛應用于發(fā)酵工業(yè) 在潮濕的糧食及食品上能迅速蔓延生長 引起糧食及食品的腐爛 根霉A 1 營養(yǎng)菌絲B 2 匍匐菌絲3 假根4 孢囊柄C 孢囊放大圖1 囊壁2 囊軸3 囊托 曲霉屬 Aspergillus 曲霉屬的菌絲無色 淡色或表面凝聚有色物質(zhì) 為有隔的多細胞 本屬的常見產(chǎn)毒霉菌有8個種 具有強烈的致癌性 曲霉1 雙層小梗分生孢子頭2 單層小梗分生孢子頭3 分生孢子梗基部足細胞4 雙層小梗的細胞微結構 常見青霉分生孢子梗 青霉屬菌絲無色或有色 為有隔的多細胞 分生孢子梗從菌絲垂直生出 無足細胞 頂端不膨大 無頂囊 產(chǎn)生一輪至數(shù)輪分叉 在最后一級分枝的小梗上 長出成串的分生孢子 形似掃帚狀 稱為帚狀枝 本屬的常見產(chǎn)毒霉菌有9個種 其中展青霉可產(chǎn)生展青霉素 是一種神經(jīng)毒素 并具有致畸 致突變和致癌性 霉菌菌落形態(tài) 霉菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上的形態(tài) 酵母菌顯微鏡下形態(tài) 微生物檢查法 微生物限度檢查方法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料 輔料受微生物污染程度的方法 檢查項目包括細菌數(shù) 霉菌數(shù) 酵母菌數(shù)及控制菌檢查 檢查方法多用平皿法 薄膜過濾法 涂抹法和MPN法 國家藥典規(guī)定應用經(jīng)驗證合格的方法 檢查方法的驗證 試驗環(huán)境無菌檢查應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行 其全過程應嚴格遵守無菌操作 防止微生物污染 防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出 檢驗依據(jù)單向流空氣區(qū) 工作臺面及環(huán)境應定期按 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室 區(qū) 懸浮粒子 浮游菌和沉降菌的測試方法 的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度驗證 2010版藥典 隔離系統(tǒng)的應用 應用隔離系統(tǒng)重要的目的 是保護產(chǎn)品免受外源性污染 包括操作人員 操作環(huán)境及外包裝等的污染 保證無菌實驗結果的可靠性 實現(xiàn)一次檢出的要求 是保護操作人員免受實驗過程中的有害物質(zhì)帶來的污染 隔離系統(tǒng)應按相關的要求進行驗證 其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求 日常檢驗還需對試驗環(huán)境進行監(jiān)控 為保證檢驗結果的可靠性 真實性 選擇正確的檢驗方法是至關重要的 因此試驗前必須對選擇的方法進行驗證 證明所采用的方法是適宜的 確認所采用的方法適宜于被檢供試品的微生物污染的檢驗 方法驗證的必要性 檢驗結果的影響因素 供試品的組分抑菌劑 增溶劑 乳化劑及抗氧化劑 這些組分在一定濃度下對微生物起一定的抑制作用也可對污染菌造成損傷 環(huán)境影響不同類型的微生物及不同的存活狀態(tài)對環(huán)境的抗性是不同的 如培養(yǎng)基的質(zhì)量 檢驗人員的操作誤差等 方法驗證 試驗全方面驗證如試驗環(huán)境 培養(yǎng)基 供試液的制備 滅菌方法等全部進行驗證 當驗證試驗符合要求時 就可認為在該試驗條件下該供試品對微生物無抑菌作用或抑菌作用可忽略不計 供試品檢驗結果可真實的體現(xiàn) 驗證方法 菌液制備50 100cfu ml 驗證方法試驗組 菌液組 供試品對照組 釋劑對照組 結果判斷供試品組 對照組 稀釋劑對照組的菌回收率均不低70 方法驗證 驗證方法 按供試液的制備和細菌 霉菌及酵母菌計數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進行 對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證 驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗 并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率 方法驗證 試驗菌株大腸埃希菌 金黃色葡萄球菌 白色念珠菌 黑曲霉 枯草桿菌 菌液制備同計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查 方法驗證 試驗組 平皿法取最低稀釋級供試液1ml和50 100cfu試驗菌 分別注入平皿中 立即傾注瓊脂培養(yǎng)基 平行制備2個平皿 按平皿法測定其菌數(shù) 薄膜過濾法取最低稀釋級供試液 過濾 沖洗 在最后一次的沖洗液中加入50 100cfu試驗菌 過濾 按薄膜過濾法測定其菌數(shù) 方法驗證 菌液組所加的試驗菌數(shù) 供試品對照組測定供試品本底菌數(shù) 稀釋劑對照