第三章紫外可見分光光度法

第三章紫外-可見分光光度法,儀 器 分 析,學(xué)習(xí)目的通過本章學(xué)習(xí)，為后續(xù)藥物分析、中藥分析課程中有關(guān)藥品的定性鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測定的學(xué)習(xí)奠定基礎(chǔ)。學(xué)習(xí)要點 紫外-可見分光光度法的基本原理；電子躍遷類型，吸收帶的類型、特點及影響因素；Lambert-Beer定律；紫外-可見分光光光度計的基本構(gòu)造；定性定量方法。,目 錄,第一節(jié) 紫外-可見分光光度法的基本原理第二節(jié) 紫外-可見分光光度計第三節(jié) 紫外-可見分光光度法分析條件的選擇第四節(jié) 紫外-可見分光光度法的應(yīng)用,紫外-可見分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry，UV-Vis)是基于分子中價電子躍遷所產(chǎn)生的吸收光譜而進(jìn)行分析的方法，又稱紫外-可見吸收光譜法。該法波長范圍一般在190800nm。特點：靈敏度較高，一般為10-7 10-4g/ml；準(zhǔn)確度較好，相對誤差一般在0.5%，精度高的可達(dá)0.2%；儀器設(shè)備簡單，操作方便，分析速度較快。,概述,一、紫外-可見吸收光譜,（一）電子躍遷的類型,1、 * 躍遷2、 * 躍遷3、 n * 躍遷4、 n * 躍遷5、電荷遷移躍遷6、配位場躍遷,第一節(jié) 紫外-可見分光光度法的基本原理,電子躍遷所需能量及所處波段示意圖,*n* * n*,5、電荷遷移躍遷用電磁輻射照射化合物時，電子從給與體向接受體相聯(lián)系的軌道上躍遷稱為電荷遷移躍遷。某些取代芳烴分子同時具有電子給與體和電子接受體兩部分，可以產(chǎn)生電荷轉(zhuǎn)移吸收光譜。某些過渡金屬離子與含生色團(tuán)的試劑反應(yīng)所產(chǎn)生的配合物，以及許多無機(jī)物離子均可產(chǎn)生電荷遷移躍遷。此類吸收帶較寬，吸收強(qiáng)度大，一般max 104。,（一）電子躍遷的類型,6、配位場躍遷第4、5周期過渡金屬水合離子或過渡金屬離子與顯色劑所形成的配合物在電磁輻射作用下，吸收適當(dāng)波長的紫外光或可見光，從而獲得相應(yīng)的吸收光譜。配位場躍遷吸收強(qiáng)度較弱，一般max 102。如Ti(H2O)63+水合離子的配位場躍遷吸收帶max為490nm。大多數(shù)鑭系和錒系元素離子的4f或5f電子可發(fā)生ff*躍遷（配位場躍遷），因而在紫外-可見光區(qū)都有吸收。,（一）電子躍遷的類型,8,電子躍遷類型及特點,1、吸收光譜（吸收曲線）2、生色團(tuán)3、助色團(tuán)4、藍(lán)移、紅移5、增色效應(yīng)、減色效應(yīng),（二）紫外-可見吸收光譜中的常用術(shù)語,1、吸收光譜（吸收曲線）,(1)最大吸收波長（max）吸收曲線上的最大吸收峰所對應(yīng)的波長。(2)最小吸收波長（min）吸收曲線上的最低部位的谷所對應(yīng)的波長。(3)肩峰（sh）吸收峰上的曲折處稱為肩峰。(4)末端吸收在吸收曲線的最短波長處呈現(xiàn)強(qiáng)吸收而不成峰形的部分稱為末端吸收。,有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中含有n*、*躍遷的基團(tuán)，能在紫外-可見光范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收的基團(tuán)。如C=C、C=O、N=N等簡單的雙鍵或叁鍵，以及CO、CN、CS、NO、NO2等有雜原子滲入的雙鍵或共軛雙鍵。,2、生色團(tuán),含有非成鍵電子的雜原子飽和基團(tuán)，本身不能吸收波長大于200nm的輻射，但與發(fā)色團(tuán)或飽和烴相連時，能使生色團(tuán)的吸收峰向長波方向位移并增強(qiáng)其吸收強(qiáng)度的基團(tuán)。如NH2、OH、NR2、OR、SH、SR、Cl、Br等。這些基團(tuán)中的 n電子能與生色團(tuán)中的電子相互作用（可能產(chǎn)生p-共軛），使*躍遷能量降低，躍遷幾率變大。,3、助色團(tuán),(1)藍(lán)移（紫移、短移）因化合物的結(jié)構(gòu)改變或溶劑效應(yīng)等引起的吸收峰向短波方向移動的現(xiàn)象 (2)紅移（長移）因化合物的結(jié)構(gòu)改變或溶劑效應(yīng)等引起的吸收峰向長波方向移動的現(xiàn)象,4、藍(lán)移、紅移,(1)增色效應(yīng)由于化合物的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化或外界因素的影響，使化合物的吸收強(qiáng)度增大的現(xiàn)象(2)減色效應(yīng)由于化合物的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化或外界因素的影響，使化合物的吸收強(qiáng)度減小的現(xiàn)象,5、增色效應(yīng)、減色效應(yīng),（三）吸收帶,依據(jù)電子躍遷和分子軌道類型，吸收帶可分為：1、R帶Radikal(基團(tuán))2、K帶Konjugation(共軛作用) 3、B帶benzenoid(苯) 4、E帶芳香族化合物特征吸收帶,1、R帶Radikal(基團(tuán)),由含雜原子不飽和基團(tuán)（ CO、NO、NO2、NN ）的n*躍遷引起。吸收峰處于較長波長范圍（250500nm）內(nèi)，吸收強(qiáng)度中等（100） 。,2、K帶Konjugation(共軛作用),由共軛雙鍵中 *躍遷引起。吸收峰出現(xiàn)在200nm以上，吸收強(qiáng)度大（105）。隨著共軛雙鍵的增加，吸收峰紅移，吸收強(qiáng)度有所增加。如丁二烯max =217nm為K帶。,3、B帶benzenoid(苯),芳香族（包括雜芳香族）特征吸收帶。由苯等芳香族化合物的 *躍遷所引起的吸收帶之一。吸收峰出現(xiàn)在230270nm之間，中心波長256nm。在極性溶劑中，B帶精細(xì)結(jié)構(gòu)變得不明顯或消失。,苯的紫外吸收光譜（異辛烷溶劑中）,4、E帶芳香族化合物特征吸收帶,由苯環(huán)結(jié)構(gòu)中3個乙烯的環(huán)狀共軛系統(tǒng)的 *躍遷所引起。分為E1和E2兩個吸收帶。E1吸收帶約在184nm， max=60000 ，強(qiáng)吸收帶。E2吸收帶在204nm以上， max=8000 ，強(qiáng)吸收帶。,苯的紫外吸收光譜（異辛烷溶劑中）,一些化合物的電子結(jié)構(gòu)、躍遷和吸收帶,21,1、有機(jī)化合物的紫外吸收光譜2、影響紫外吸收光譜的主要因素,（四）紫外-可見吸收光譜與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,22,(1)飽和化合物飽和碳?xì)浠衔镏挥须娮樱虼酥荒墚a(chǎn)生*躍遷，需要能量較大，吸收的波長通常在150nm左右的真空紫外光區(qū)。含有O、N、S、X等雜原子的飽和化合物，除電子外，還有n電子，可發(fā)生n*躍遷，在200nm附近有弱吸收，通常為末端吸收。僅少數(shù)化合物（如烷基碘）的max為259nm（ max =400）。在200400nm的近紫外區(qū)沒有強(qiáng)吸收（常稱為透明）。在紫外吸收光譜分析中常作溶劑。,1、有機(jī)化合物的紫外吸收光譜,23,(2)不飽和烴及共軛烯烴含孤立雙鍵或叁鍵的簡單不飽和脂肪化合物，可以產(chǎn)生*和*兩種躍遷。最大吸收波長max小于200nm。具有共軛體系的不飽和化合物，共軛體系越長，躍遷時所需能量越小，吸收峰紅移越顯著。如1,3,5,7,9,11-十二烷基六烯max為364nm，max為138000。,1、有機(jī)化合物的紫外吸收光譜,(3)羰基化合物羰基化合物含有C=O基團(tuán)，可發(fā)生n*、n*和*躍遷。其中n*躍遷所需要能量較低，吸收波長在近紫外光區(qū)或紫外光區(qū)，為10100。醛、酮、羧酸及其衍生物(酯、酰胺、酰鹵等)，均屬于這類化合物的吸收類型。、-不飽和醛、酮，由于C=O和C=C雙鍵共軛，使*躍遷紅移至200nm以上，約為104；而n*躍遷紅移至310350nm（ 100 ）。如CH2=CH-CHO，共軛*躍遷max為210nm，n*躍遷max為315nm。,1、有機(jī)化合物的紫外吸收光譜,(4)芳香族化合物苯具有環(huán)狀共軛體系，在紫外光區(qū)，由*躍遷產(chǎn)生E1帶、E2帶和B帶3個吸收帶。B帶是芳香族化合物的特征。當(dāng)苯環(huán)上引入NH2、OH、CHO、NO2基團(tuán)時，苯的B帶顯著紅移，吸收強(qiáng)度增大。如果引入的基團(tuán)帶有不飽和雜原子時，則產(chǎn)生了n*躍遷的新吸收帶。如硝基苯、苯甲醛的n*躍遷的吸收波長分別為330nm和328nm。,1、有機(jī)化合物的紫外吸收光譜,2、影響紫外吸收光譜的主要因素,分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和外部環(huán)境等各種因素對吸收譜帶也有一些，主要表現(xiàn)為譜帶位移、譜帶強(qiáng)度的變化、譜帶精細(xì)結(jié)構(gòu)的改變等。(1)位阻影響(2)跨環(huán)效應(yīng)(3)溶劑效應(yīng)(4)體系pH值的影響,(1)位阻影響化合物中若有兩個生色團(tuán)產(chǎn)生共軛效應(yīng)，可使吸收帶長移。但如果兩個生色團(tuán)由于立體阻礙妨礙它們處于同一平面上，就會影響共軛效應(yīng)。二苯乙烯由于順式結(jié)構(gòu)有立體阻礙，苯環(huán)不能與乙烯雙鍵在同一平面上，不易產(chǎn)生共軛，因此反式結(jié)構(gòu)的K帶max比順式明顯紅移，且吸收系數(shù)也增加。,2、影響紫外吸收光譜的主要因素,二苯乙烯順式反式異構(gòu)體的紫外吸收光譜,2、影響紫外吸收光譜的主要因素,(2) 跨環(huán)效應(yīng)跨環(huán)效應(yīng)指非共軛基團(tuán)之間的相互作用。如對亞甲基環(huán)丁酮在214nm處出現(xiàn)一中等強(qiáng)度的吸收帶，同時284nm處出現(xiàn)R帶。這是由于結(jié)構(gòu)中雖然雙鍵與酮基不產(chǎn)生共軛體系，但適當(dāng)?shù)牧Ⅲw排列，使羰基氧的孤電子對與雙鍵的電子發(fā)生作用，相當(dāng)于n*躍遷的R帶向長波移動。,對亞甲基環(huán)丁酮,2、影響紫外吸收光譜的主要因素,(3)溶劑效應(yīng)n* 隨溶劑極性的增大，吸收峰向短波移動。* 隨溶劑極性的增大，吸收峰向長波移動。,極性溶劑對兩種躍遷能級差的影響示意圖,2、影響紫外吸收光譜的主要因素,溶劑極性對異丙叉丙酮的兩種躍遷吸收峰的影響,對稱四嗪的吸收光譜a. 蒸氣態(tài)中 b. 環(huán)己烷中 c. 水中,極性溶劑往往使吸收峰的精細(xì)結(jié)構(gòu)消失,2、影響紫外吸收光譜的主要因素,(4)體系pH值的影響體系酸堿度對酸堿性有機(jī)化合物吸收光譜的影響普遍存在。如酚類化合物由于體系pH值不同，其解離情況不同，而產(chǎn)生不同的吸收光譜。,max 210.5nm（max 6200） 236nm（max 9400） 270nm （max 1450） 287nm（max 2600）,2、影響紫外吸收光譜的主要因素,二、朗伯-比爾定律,朗伯-比爾定律(Lambert-Beer)是光吸收的基本定律，是分光光度法定量分析的依據(jù)和基礎(chǔ)。如果濃度c以物質(zhì)的量濃度（mol/L）表示，則公式可以寫成 其中稱為摩爾吸收系數(shù)，單位為L/（molcm）。如果濃度c以質(zhì)量百分濃度（g/100ml）表示，則公式可以寫成 其中稱為百分吸收系數(shù)，單位為100ml/（gcm）。吸收系數(shù)兩種表示方式之間的關(guān)系是：,（一）數(shù)學(xué)表達(dá)式及物理意義,例 某種從中藥提取物分離純化制得的有效成分，濃度為12.6g/ml，用1cm吸收池，在最大吸收波長238nm處測得其吸光度為0.437，試計算其 （max ）；若該組分的分子量是264，計算其（max ）。解：已知c=12.6g/ml=12.610-6100=1.2610-3 (g/100ml),朗伯-比爾定律公式運(yùn)用,1、化學(xué)因素2、光學(xué)因素（非單色光，雜散光，散射光和反射光，非平行光）,（二）偏離朗伯-比爾定律的因素,吸光物質(zhì)可因濃度的改變而發(fā)生離解、締合、溶劑化以及配合物生成等變化，使吸光物質(zhì)的存在形式發(fā)生變化，從而偏離朗伯-比爾定律。 C6H5COOHH2O = C6H5COOH3O max（nm) 273 268max L/(molcm) 970 560稀釋溶液或改變?nèi)芤簆H值時，吸收波長及吸收系數(shù)都會改變。,1、化學(xué)因素,2、光學(xué)因素,(1)非單色光(2)雜散光 (3)散射光和反射光(4)非平行光,(1)非單色光比爾定律只適用于單色光，實際用于測量的都是具有一定譜帶寬度的復(fù)合光，譜帶寬度越小，單色性越好。,譜帶寬度,應(yīng)選擇曲線較為平坦的最大吸收波長a處測定,2、光學(xué)因素,2、光學(xué)因素,(2)雜散光 從單色器得到的單色光中，還有一些不在譜帶范圍內(nèi)的、與所需波長相隔甚遠(yuǎn)的光，稱為雜散光。它是由于儀器光學(xué)系統(tǒng)的缺陷或光學(xué)元件受灰塵、霉蝕的影響而引起的。在透光率很弱時，雜散光會產(chǎn)生明顯的作用。在接近紫外末端吸收處，雜散光的比例相對增大，從而干擾測定，有時還會出現(xiàn)假峰。,2、光學(xué)因素,(3)散射光和反射光吸光質(zhì)點對入射光有散射作用，吸收池內(nèi)外界面之間入射光通過時會有反射作用。散射和反射作用致使透射光強(qiáng)度減弱。真溶液散射作用較弱，可用空白進(jìn)行補(bǔ)償?；鞚崛芤荷⑸渥饔幂^強(qiáng)，影響結(jié)果測定，故要求被測溶液為澄清溶液。,2、光學(xué)因素,(4)非平行光傾斜光通過吸收池的實際光程將比垂直照射的平行光的光程長，使吸光度增加，影響測量值。,透光率測量誤差（T）來自儀器的噪聲。濃度測量結(jié)果的相對誤差（c/c）與透光率測量誤差關(guān)系可由朗伯-比爾定律導(dǎo)出：濃度測量的相對誤差取決于透光率T和透光率測量誤差T的大小。,相對誤差與透光率的關(guān)系,（三）透光率測量誤差,一、主要部件,第二節(jié) 紫外-可見分光光度計,（一）光源,光源的作用是提供激發(fā)能，使待測分子產(chǎn)生吸收。1、光源的要求 發(fā)射連續(xù)輻射光；有足夠的輻射強(qiáng)度及良好的穩(wěn)定性；輻射強(qiáng)度隨波長的變化應(yīng)盡可能小；光源的使用壽命長，操作方便。,（一）光源,2、光源的種類 常用的光源有熱輻射光源（如鎢燈、鹵鎢燈）和氣體放電光源（如氫燈和氘燈）兩類。(1)鎢燈和碘鎢燈：3402500nm，可見光區(qū)內(nèi)輻射強(qiáng)度與工作電壓的4次方成正比。(2)氫燈和氘燈：160375nm，氘燈比同功率的氫燈光強(qiáng)度大35倍。(3)激光紫外光源：高強(qiáng)度、高單色性，氬離子激光器、可調(diào)諧染料激光器。,單色器是從光源的復(fù)合光中分出單色光的光學(xué)裝置，其主要特點是產(chǎn)生光譜純度高、色散率高且波長可調(diào)節(jié)。由進(jìn)光狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件、聚焦元件和出光狹縫等幾個部分組成，核心部件是色散元件。,（二）單色器,單色器光路示意圖,棱鏡色散與光柵色散,（二）單色器,1、色散元件(1)棱鏡：利用折射率差別制成。(2)光柵：利用光的衍射與干涉作用制成。每1mm玻璃上刻6001200條槽。每條刻線相當(dāng)于1條狹縫，光在未刻部分發(fā)生反射，各反射光束間的干涉引起色散。,（二）單色器,2、準(zhǔn)直鏡以狹縫為焦點的聚光鏡。將進(jìn)入單色器的發(fā)射光變成平行光；將色散后的平行單色光聚集于出光狹縫。,（二）單色器,3、狹縫狹縫寬度直接影響單色光的純度。狹縫過寬，單色光不純；狹縫過窄，光通量過小，靈敏度降低。定性分析宜采用較小的狹縫寬度。定量分析宜采用較大的狹縫寬度。,（二）單色器,4、雜散光及其消除雜散光：指出射光束中混有的與儀器所指示的波長相差較大的光波。雜散光會嚴(yán)重影響吸光度測定。雜散光產(chǎn)生的原因：各光學(xué)部件和單色器的外殼內(nèi)壁的反射；大氣或化學(xué)部件表面塵埃的散射；光學(xué)元件霉變、腐蝕。可將單色器用罩殼封閉起來，罩殼內(nèi)涂有黑體以吸收雜散光。,即比色皿，用于盛放待測溶液的容器。1、光學(xué)玻璃吸收池 可見光區(qū)2、熔融石英吸收池 可見光區(qū)、紫外光區(qū)用于盛放供試液和參比液的比色皿，應(yīng)厚度相同，兩只比色皿的透光率之差小于0.5%。,（三）吸收池,將光信號轉(zhuǎn)變成電信號的光電轉(zhuǎn)換元件，其產(chǎn)生的電信號與照射光強(qiáng)度成正比。要求：在測量范圍內(nèi)具有高靈敏度；對輻射能量的響應(yīng)快、線性關(guān)系好、線性范圍寬；對不同波長的輻射影響性能相同且可靠；穩(wěn)定性好，噪聲水平低。,（四）檢測器,1、光電池2、光電管3、光電倍增管4、光二極管陣列檢測器,（四）檢測器,1、光電池硒光電池：敏感光區(qū)300800nm，易疲勞，壽命短。硅光電池：紫外光區(qū)及可見光區(qū)。,（四）檢測器,2、光電管以一彎成半圓柱形的金屬片為陰極，陰極內(nèi)表面鍍有堿金屬或堿金屬氧化物等光敏層；在圓柱形的中心置一金屬絲為陽極，可接受陰極釋放的電子。兩電極密封于玻璃管或石英管內(nèi)并抽真空。紅敏光電管(鍍有銀和氧化銫)可用于6251000nm波長。藍(lán)敏光電管(鍍有銻和銫)可用于200625nm波長。光電管靈敏度高，光敏范圍寬，不易疲勞。,（四）檢測器,光電管檢測器示意圖,3、光電倍增管一種加上多級倍增電極的光電管。外殼由玻璃或石英制成，陰極表面涂有光敏物質(zhì)，在陰極與陽極之間裝有一系列次級電子發(fā)射極，即電子倍增極。輻射光子撞擊陰極時發(fā)射光電子，該電子被電場加速并撞擊第一倍增極，撞出更多電子，依次進(jìn)行，最后陽極收集到的電子數(shù)是陰極發(fā)射電子的105106倍。,（四）檢測器,光電倍增管示意圖,光電管輸出的電信號很弱，需經(jīng)過放大才能以某種方式將測量結(jié)果顯示出來，一般的分光光度計多具有熒屏顯示、結(jié)果打印及吸收曲線掃描等功能?，F(xiàn)代的分光光度計裝備有計算機(jī)光譜工作站，可對數(shù)字信號進(jìn)行采集、處理與顯示，并對各系統(tǒng)進(jìn)行自動控制。,（五）信號處理和顯示系統(tǒng),1、單光束分光光度計2、雙光束分光光度計3、雙波長分光光度計4、全波長分光光度計,二、分光光度計的類型,在單光束光學(xué)系統(tǒng)中，單色器色散后的單色光進(jìn)入吸收池。經(jīng)單色器分光后形成一束平行光，輪流通過參比溶液和樣品溶液，以進(jìn)行吸光度的測定。這種簡易型分光光度計結(jié)構(gòu)簡單，操作方便，維修容易，適用于常規(guī)分析。,（一）單光束分光光度計,光源發(fā)出光經(jīng)單色器分光后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)扇面鏡（切光器）分為強(qiáng)度相等的兩束光，一束通過參比池，另一束通過樣品池，光度計能自動比較兩束光的強(qiáng)度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸光度，并作為波長函數(shù)記錄下來。雙光束分光光度計一般都能自動記錄吸收光譜曲線。由于兩束光同時分別通過參比池和樣品池，因而能自動消除光源強(qiáng)度變化所引起的誤差。,（二）雙光束分光光度計,由同一光源發(fā)出的光被分為兩束，分別經(jīng)過兩個單色器，得到兩束不同波長的單色光。利用切光器使兩束光以一定頻率交替照射同一吸收池，然后測定兩個波長處的吸光度差值A(chǔ)。A= A1 A2=(1 2)lc,（三）雙波長分光光度計,優(yōu)點：雙波長分光光度計只利用1個吸收池，消除了吸收池及參比池所引起的測量誤差；用同一光源得到兩束光，可減小因光源電壓變化產(chǎn)生的影響。,（三）雙波長分光光度計,光電二極管陣列（PDA）是在晶體硅上緊密排列一系列光電二極管檢測管，光經(jīng)全息光柵表面色散并透射到二極管陣列檢測器上，被其中的光二極管接受。二極管輸出的電信號強(qiáng)度與光強(qiáng)度成正比。兩個二極管中心距離的波長單位稱為采樣間隔。二極管數(shù)目越多，分辨率越高。,（四）全波長分光光度計,全波長分光光度計同時檢測透過樣品復(fù)色光。它具有靈敏度高、噪音低、線性范圍寬等優(yōu)點，可用作高效液相色譜檢測器。,（四）全波長分光光度計,（一）光學(xué)性能1、輻射波長2、儀器的測量范圍3、儀器的重復(fù)性及準(zhǔn)確度4、雜散光,三、光學(xué)性能與儀器校正,1、輻射波長(1)波長范圍：指儀器所能測量的波長范圍，通常為200800nm。(2)光譜帶寬：指在最大透光強(qiáng)度一半處曲線的寬度，通常為6nm以下。(3)波長準(zhǔn)確度：儀器所顯示的波長數(shù)值與單色光的實際波長值之間的誤差，規(guī)定紫外光區(qū)1nm，500nm附近2nm。(4)波長重復(fù)性：重復(fù)使用同一波長，單色光實際波長的變動值，通常1nm。,三、光學(xué)性能與儀器校正,2、儀器的測量范圍透光率表示：-1.0%200.0%吸光度表示：-0.5A3.000A3、儀器的重復(fù)性及準(zhǔn)確度光度重復(fù)性：指同樣情況下重復(fù)測量透光率的變動，通常0.5%。光度準(zhǔn)確度：指以透光率測量值的誤差表示。透光率滿量程誤差為0.5%（鉻酸鉀溶液）,三、光學(xué)性能與儀器校正,4、雜散光通常以測光信號較弱的波長處所含雜散光的強(qiáng)度百分比為指標(biāo)。藥典規(guī)定：220nm處NaI（1g/100ml）透光率0.8%，340nm處Na2NO2（5g/100ml）透光率0.8%。,三、光學(xué)性能與儀器校正,1、波長的校正 常用汞燈（237.83nm、253.65 nm等）或氘燈（486.02 nm、656.10nm）中的較強(qiáng)譜線進(jìn)行校正。高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器。2、吸光度的校正 使用重鉻酸鉀的硫酸溶液，在規(guī)定的波長處測定并計算其吸收系數(shù)，并與規(guī)定的吸收系數(shù)比較，來檢定分光光度計吸光度的準(zhǔn)確度。3、雜散光的檢查 測定規(guī)定濃度的碘化鈉或亞硝酸鈉溶液在規(guī)定波長處的透光率來進(jìn)行檢查。,（二）儀器校正,一、檢測波長的選擇1、定量分析中，測定波長一般選擇在被測組分最大吸收波長處。2、如果被測組分有幾個最大吸收波長時，可選擇不易出現(xiàn)干擾吸收、吸光度較大而且峰頂比較平坦的最大吸收波長。3、若干擾物質(zhì)在最大吸收波長處有較強(qiáng)的吸收，可選用非最大吸收處的波長。,第三節(jié) 紫外-可見分光光度法分析條件的選擇,所選擇的溶劑應(yīng)易于溶解樣品而不與樣品發(fā)生作用，且在測定波長區(qū)間內(nèi)吸收小，不易揮發(fā)。常用溶劑的截止波長,二、溶劑的選擇,1、溶劑參比 當(dāng)試樣組成較為簡單，共存組分很少且在測定波長吸收極小，以及顯色劑沒有吸收，可采用純?nèi)軇┳鳛閰⒈热芤骸？上軇⑽粘氐纫蛩氐挠绊憽?三、參比溶液的選擇,2、試劑參比如果顯色劑或其他試劑在測定波長有吸收，按顯色反應(yīng)相同的條件，不加入試樣溶液，同樣加入試劑和溶劑作為參比溶液?？上噭┲薪M分所產(chǎn)生吸收的影響。,三、參比溶液的選擇,3、試樣參比如果試樣基體（除被測組分外的其他共存組分）在測定波長處有吸收，而與顯色劑不起顯色反應(yīng)時，可不加顯色劑但按與顯色反應(yīng)相同的條件處理試樣，作為參比溶液。適用于試樣中有較多的共存組分，加入的顯色劑量較少，且顯色劑在測定波長無吸收。,三、參比溶液的選擇,通過調(diào)節(jié)待測溶液的濃度和吸收池的厚度來調(diào)節(jié)A值，使其在0.20.7之間。,四、溶液吸光度的范圍及測定,對于不能產(chǎn)生吸收的物質(zhì)或者吸收系數(shù)很小的物質(zhì)，可選用適當(dāng)?shù)脑噭┡c被測物質(zhì)定量反應(yīng)，生成對紫外或可見光有較大吸收的物質(zhì)再進(jìn)行測定。（一）顯色反應(yīng)要求（二）顯色條件的選擇,五、顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇,（一）顯色反應(yīng)要求,1、被測物質(zhì)和所生成的有色物質(zhì)之間必須有確定的計量關(guān)系；2、反應(yīng)產(chǎn)物必須有較高的吸光能力（103105）和足夠的穩(wěn)定性；3、反應(yīng)產(chǎn)物的顏色與顯色劑的顏色必須有明顯的差別；4、顯色反應(yīng)必須有較好的選擇性，以減免干擾。,1、顯色劑用量2、溶液酸堿度3、顯色時間4、溫度5、溶劑,（二）顯色條件的選擇,顯色劑用量可通過實驗選擇，在固定金屬離子濃度的情況下，作吸光度A隨顯色濃度c的變化曲線，選取吸光度恒定時的顯色劑用量。,1、顯色劑用量,酸堿度對顯色反應(yīng)影響極大。如Fe3+與水楊酸的配合物，組成隨介質(zhì)pH值的不同而變化。pH值范圍 絡(luò)合物組成 顏 色 1.84 Fe(C7H4O3)+ 紫紅色 47 Fe(C7H4O3)2- 棕褐色 810 Fe(C7H4O3)33- 黃色合適的pH值可以通過繪制A-pH曲線來確定。,選擇平坦處對應(yīng)pH值,2、溶液酸堿度,由于各種顯色反應(yīng)的速度不同，且介質(zhì)酸度、顯色劑的濃度都將會影響顯色時間。必須固定其他顯色條件，通過實驗作出A-t曲線，才能確定適宜的顯色時間和測定時間。,3、顯色時間,顯色反應(yīng)須在適當(dāng)溫度下進(jìn)行。一般的顯色反應(yīng)也可以在室溫下進(jìn)行。,4、溫度,溶液的性質(zhì)可直接影響被測物質(zhì)對光的吸收，且顯色反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性也與溶劑有關(guān)?？辔端嵩谒芤褐谐庶S色，在三氯甲烷在呈無色。硫氰酸鐵紅色配合物在丁醇中比在水溶液中穩(wěn)定。,5、溶劑,第四節(jié) 紫外-可見分光光度法的應(yīng)用,一、定性分析二、純度檢查三、定量分析四、結(jié)構(gòu)分析五、應(yīng)用與示例,利用紫外吸收光譜的形狀、吸收峰的數(shù)目、各吸收峰的波長和相應(yīng)的吸收系數(shù)等可對部分有機(jī)化合物進(jìn)行定性鑒別。,3.吸收峰的數(shù)目,1.吸收光譜形狀,2.各吸收峰的波長,4.相應(yīng)波長處的吸收系數(shù),一、定性分析,定性分析方法：對比法,1、比較吸收光譜的一致性兩個相同化合物，在同一條件下測定其吸收光譜應(yīng)完全一致。,一、定性分析,例 安宮黃體酮和炔諾酮分子中都存在、-不飽和羰基的特征吸收結(jié)構(gòu)，最大吸收波長相同但相對分子量不同，有明顯差異，可用于鑒別。,安宮黃體酮（M386.53） 炔諾酮（M= 298.43） max2401nm max2401nm,408,571,2、比較吸收光譜的特征數(shù)據(jù),一、定性分析,3、比較吸光度（或吸收系數(shù)）比值有多個吸收峰的化合物，可利用在不同吸收峰（或峰與谷）處測得吸光度的比值A(chǔ)1/A2或1/2作為鑒別的依據(jù)。例 中國藥典（2015年版）對葉酸采用下述方法鑒別：將檢品按規(guī)定方法配成10g/ml的溶液，分別測定256nm和365nm處的吸光度，兩者比值應(yīng)為2.83.0。,一、定性分析,二、純度檢查,1、雜質(zhì)檢查 利用試樣與所含雜質(zhì)在紫外-可見光區(qū)吸收的差異。,2、雜質(zhì)的限量檢測 藥物地蒽酚中常有其制備的原料和氧化分解產(chǎn)物二羥基蒽醌。在三氯甲烷溶液中兩者的紫外吸收光譜有顯著差異，中國藥典（2015年版）規(guī)定，0.01%的地蒽酚三氯甲烷溶液用1cm吸收池在432nm處測定，吸光度不得大于0.12，即相當(dāng)于含二羥基蒽醌的含量不大于2.0%。,地蒽酚和二羥基蒽醌的紫外吸收光譜,二、純度檢查,（一）單組分樣品的定量分析（二）多組分樣品的定量分析,三、定量分析,1、單組分樣品定量分析的條件 在一個試樣中只要測定一種組分，且在選定的測量波長下，試樣中其它組分對該組分不干擾。2、單組分樣品定量分析的方法（1）吸收系數(shù)法（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法（3）標(biāo)準(zhǔn)對照法,（一）單組分樣品的定量分析,（1）吸光系數(shù)法根據(jù)Beer定律，若l和吸收系數(shù)或 已知，即可根據(jù)供試品溶液測得的A值求出被測組分的濃度。,（一）單組分樣品的定量分析,例 維生素B12的水溶液在361nm處的 值是207，盛于1cm吸收池中，測得溶液的吸光度為0.621，則溶液濃度為： c = 0.621/(2071)=0.00300 (g/100ml),注意：用 ， 則c單位為g/100ml；用，則c單位為mol/L。,（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法先配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以不含被測組分的空白溶液作參比，測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制吸光度-濃度曲線，稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而擬合出回歸方程。在相同的條件下測定試樣溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線山找出對應(yīng)的濃度，或者從回歸方程求出被測組分濃度。,（一）單組分樣品的定量分析,（3）標(biāo)準(zhǔn)對照法在相同條件下配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液，在選定波長處，分別測其吸光度，根據(jù)朗伯-比爾定律,因標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液是同種物質(zhì)、同臺儀器及同一波長于厚度相同的吸收池中測定，故l和E均相等，有,注意：標(biāo)準(zhǔn)對照法應(yīng)用的前提是方法學(xué)考察時制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)過原點。,（一）單組分樣品的定量分析,適用條件：若樣品中有兩種或兩種以上的吸光組分共存時，可根據(jù)吸收光譜相互重疊的情況分別采用不同的測定方法。,（