谷氨酸發(fā)酵機(jī)制以及雜菌噬菌體防治

谷氨酸發(fā)酵機(jī)制,一、谷氨酸合成途徑二、葡萄糖發(fā)酵谷氨酸的理想途徑三、細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié)四、谷氨酸生產(chǎn)菌的特征和種類,一、谷氨酸合成途徑,糖酵解途徑（EMP途徑） 磷酸戊糖途徑（HMP途徑）三羧酸循環(huán)乙醛酸循環(huán)丙酮酸羧化支路（CO2固定反應(yīng)）,谷氨酸發(fā)酵的代謝途徑,生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脫氫酶系的作用下氧化脫羧生成乙酰CoA，另一部分經(jīng)CO2固定反應(yīng)生成草酰乙酸或蘋果酸.草酰乙酸與乙酰CoA在檸檬酸合成酶催化作用下，縮合成檸檬酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，檸檬酸在順烏頭酸酶的作用下生成異檸檬酸，異檸檬酸再在異檸檬酸脫氫酶的作用下生成-酮戊二酸，-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前體。-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶作用下經(jīng)還原氨基化反應(yīng)生成谷氨酸,谷氨酸,脫氫酶,合成酶,Glc,丙酮酸,草酰乙酸,CO2,天冬氨酸（Asp）,乙酰-coA,CO2,羧化酶,檸檬酸,順烏頭酸,異檸檬酸,-酮戊二酸,Glu,反饋抑制,異檸檬酸,脫氫酶,反饋?zhàn)瓒?優(yōu)先合成,谷氨酸生物合成調(diào)節(jié)機(jī)制,-酮戊二酸脫氫酶,優(yōu)先合成 谷氨酸比天冬氨酸優(yōu)先合成，谷氨酸合成過量后，就會抑制和阻遏自身的合成途徑，使代謝轉(zhuǎn)向合成天冬氨酸檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié) 檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，除受能荷調(diào)節(jié)外，還受谷氨酸的反饋?zhàn)瓒艉晚槥躅^酸的反饋抑制，谷氨酸合成過量時，代謝轉(zhuǎn)向天冬氨酸的合成。,優(yōu)先合成與反饋調(diào)節(jié),-酮戊二酸脫氫酶的調(diào)節(jié)在谷氨酸產(chǎn)生菌中，-酮戊二酸脫氫酶活性微弱，使-酮戊二酸不能繼續(xù)氧化。谷氨酸脫氫酶的調(diào)節(jié) 谷氨酸對谷氨酸脫氫酶存在著反饋抑制和反饋?zhàn)瓒?-酮戊二酸合成后由于-酮戊二酸脫氫酶活性微弱，谷氨酸脫氫酶的活力很強(qiáng)，故優(yōu)先合成谷氨酸,控制谷氨酸合成的重要措施,丙酮酸羧化酶,檸檬酸合成酶作用生成檸檬酸,乙醛酸循環(huán)基本不發(fā)生,一檸檬酸脫氫酶作用,-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱,谷氨酸脫氫酶能力強(qiáng),細(xì)胞膜通透性強(qiáng),（1）葡萄糖經(jīng)過EMP和HMP生成丙酮酸，以EMP途徑為主，生物素充足時HMP占38%，亞適量為26%.(2) 生成的丙酮酸在脫氫酶系作用下生成乙酰輔酶A，另一部分生成草酰乙酸或蘋果酸。（3）草酰乙酸和乙酰輔酶A在檸檬酸合成酶作用下生成檸檬酸，然后再順烏頭酸酶作用下生成異檸檬酸，再在異檸檬酸脫氫酶作用下生成-酮戊二酸?？刂乒劝彼岷铣傻闹匾胧?1、-酮戊二酸氧化能力弱 2、谷氨酸脫氫酶活性強(qiáng) 3、細(xì)胞膜對谷氨酸通透性高,二、細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié),對谷氨酸發(fā)酵的重要性：當(dāng)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)變?yōu)橛欣诠劝彼嵯蚰ね鉂B透的方式，谷氨酸才能不斷地排出細(xì)胞外，這樣既有利于細(xì)胞內(nèi)谷氨酸合成反應(yīng)的優(yōu)先性、連續(xù)性，也有利于谷氨酸在胞外的積累。,細(xì)胞膜是在細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)之間的一層柔軟而富有彈性的半滲透性膜，磷脂雙分子層為其基本結(jié)構(gòu)，在雙分子層中鑲嵌蛋白質(zhì)。,一種是通過控制脂肪酸和甘油的合成，實(shí)現(xiàn)對磷脂合成的控制，使得細(xì)胞不能形成完整的細(xì)胞膜；一種是通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的形成，使得細(xì)胞不能形成完整的細(xì)胞壁，喪失了對細(xì)胞膜的保護(hù)作用。在膜內(nèi)外滲透壓差等因素影響下，細(xì)胞膜物理性損傷，增大膜的通透性。,根據(jù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)特性，控制細(xì)胞膜通透性的方法主要有兩種：,1控制細(xì)胞膜的形成,1、利用生物素缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時，限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的濃度。生物素是催化脂肪酸合成起始反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶，對脂肪酸的形成起促進(jìn)作用，進(jìn)而影響了磷脂的合成和細(xì)胞膜的形成。選育生物素缺陷型菌株，阻斷生物素合成，亞適量控制生物素添加，抑制不飽和脂肪酸的合成，使得細(xì)胞膜不完整，提高了細(xì)胞膜對谷氨酸的通透性。,2、利用生物素過量的糖蜜原料進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時，添加表面活性劑或飽和脂肪酸。 在生物素過量的條件下，添加表面活性劑或飽和脂肪酸仍能進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，其原因在于這些物質(zhì)對生物素起拮抗作用，抑制不飽和脂肪酸的合成，導(dǎo)致油酸合成量減少，磷脂合成不足，使得細(xì)胞膜不完整，提高了細(xì)胞膜對谷氨酸的通透性。常用的表面活性劑有吐溫-60、吐溫-40等。常用的飽和脂肪酸有十七烷酸、硬脂酸等。,3、利用油酸缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，限制發(fā)酵培養(yǎng)基油酸的濃度。 油酸缺陷型菌株喪失了自身合成油酸的能力，直接影響磷脂的合成，不能形成完整細(xì)胞膜，必須添加油酸才能生長，所以通過控制油酸的添加量，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜對谷氨酸的通透性。 當(dāng)油酸過量時，該菌株只長菌或產(chǎn)酸少；當(dāng)油酸亞適量時，隨著油酸的耗盡，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化，使得谷氨酸的通透性提高。,一種脂肪酸。分子式C18H34O2,甘油缺陷型菌株不能自身合成磷酸甘油和磷脂，外界供給甘油才能使其生長，因此可以通過控制甘油添加量來控制細(xì)胞膜對谷氨酸的通透性。 當(dāng)甘油添加量過多時，磷脂正常合成，菌體正常生長，不產(chǎn)酸或產(chǎn)酸低； 當(dāng)甘油添加量過少時，菌體生長不好，產(chǎn)酸低，所以控制甘油亞適量是控制的關(guān)鍵。,4、利用甘油缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，限制發(fā)酵培養(yǎng)基甘油的濃度。,5、利用溫度敏感突變株控制細(xì)胞膜的生物合成,溫度敏感突變株的突變位置是發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有密切關(guān)系的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的基因上，發(fā)生堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，一個堿基為另一個堿基所置換。這樣，該基因所指導(dǎo)譯出的酶只能在一定溫度下有合成完整細(xì)胞膜的活性；提高溫度此酶就失活，導(dǎo)致細(xì)胞膜某些結(jié)構(gòu)改變。,2控制細(xì)胞壁的形成,細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)是肽聚糖。對細(xì)胞壁形成的控制方法：添加青霉素、頭孢霉素C等-內(nèi)酰胺類抗生素。,雙糖單位：N-乙酰胞壁酸（NAM）和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）,青霉素是糖肽末端結(jié)構(gòu)(D-Ala-D-Ala)的類似物，與轉(zhuǎn)肽酶的活性中心結(jié)合，使轉(zhuǎn)肽酶受到了不可逆的抑制，糖肽合成不能完成，結(jié)果形成不完整的細(xì)胞壁，使細(xì)胞膜處于無保護(hù)狀態(tài)，易于破損，增大谷氨酸的通透性。,轉(zhuǎn)肽酶功能：在蛋白質(zhì)生物合成過程中肽鍵的形成具有必須的作用。轉(zhuǎn)肽酶識別特異多肽,催化不同的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。,青霉素控制細(xì)胞壁形成的原因：,由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途徑：A？B？,谷氨酸生物合成的理想途徑,三、葡萄糖發(fā)酵谷氨酸的理想途徑,1、當(dāng)通過CO2固定反應(yīng)供給四碳二羧酸時，葡萄糖的理論轉(zhuǎn)化率為,1分子葡萄糖1分子谷氨酸,由上述谷氨酸生物合成的理想途徑可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的總反應(yīng)方程式為：C6H12O6+NH3+1.5O2 C5H9O4N+CO2 + 3H2O,1mol葡萄糖1mol谷氨酸，因此理論糖酸轉(zhuǎn)化率為81.7%。,若CO2固定反應(yīng)完全不起作用，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶的催化作用下，脫氫脫酸全部氧化成乙酰CoA，通過乙醛酸循環(huán)供給四碳二羧酸，則反應(yīng)如下：1mol 葡萄糖2乙酰CoA 四碳二羧酸0.5 mol 葡萄糖乙酰CoA 由于3葡萄糖可以生成2mol的谷氨酸，因此理論糖酸轉(zhuǎn)化率僅為54.4%。實(shí)際糖酸轉(zhuǎn)化率處于54.4%和81.7%之間。,2、當(dāng)通過乙醛酸循環(huán)供給四碳二羧酸時,1mol Glu,噬菌體與雜菌的防治,一、什么是噬菌體二、谷氨酸發(fā)酵中噬菌體的污染三、防治噬菌體對谷氨酸發(fā)酵的污染四、染菌隱患的檢查和處理五、染菌的預(yù)防措施,目錄,什么是噬菌體,噬菌體是侵染細(xì)菌、放線菌等微生物并使細(xì)胞裂解死亡的一類病毒。噬菌體對理化因素抵抗力強(qiáng)，且寄生性具有高度特異性專一性，一種噬菌體往往只侵染一種或某一菌株,谷氨酸發(fā)酵中噬菌體的污染,噬菌體污染發(fā)酵液以后的情況，因?yàn)榘l(fā)酵工業(yè)的種類、污染噬菌體的特性、感染時間、培養(yǎng)基成分、發(fā)酵罐內(nèi)物理和化學(xué)條件等不同而異，即同樣的噬菌體不一定引起同樣的異常發(fā)酵情況,（一）噬菌體污染的異常情況,由于污染時間和感染數(shù)量不同，以及噬菌體毒力差異表現(xiàn)的癥狀不一，但一般有”二高三低“即pH高、殘?zhí)歉?、OD值低、溫度低、谷氨酸產(chǎn)量低。具體表現(xiàn)如下：1、二級種子污染噬菌體：OD值不長、pH上升、泡沫大、耗糖慢、不產(chǎn)酸等電信的噬菌體污染現(xiàn)象。2、發(fā)酵前期污染噬菌體：吸光度先升后降、不升或回降pH升到8以上且不下降，OD值下跌耗糖慢。產(chǎn)生大量泡沫粘度增大發(fā)酵液發(fā)紅發(fā)灰，有刺激性氣味，氨基酸產(chǎn)量少或不產(chǎn),鏡檢時發(fā)現(xiàn)菌體數(shù)量顯著減少具體不規(guī)則革蘭士染色有紅色碎片。平板有噬菌斑。發(fā)酵周期變長，生物素需求變大。精制中和時色素深泡沫大堿液加不進(jìn)去。3、發(fā)酵后期污染噬菌體：對產(chǎn)酸影響不大有時還能提高產(chǎn)酸。但也不能忽視，因?yàn)椴粌H會使難于過濾且污染會前移造成更大污染,三、防治噬菌體對谷氨酸發(fā)酵的污染,1、合理使用抗性菌株：使用對噬菌體不敏感的菌株，也可以輪換使用對噬菌體敏感性弱的菌株。2、利用藥物防治噬菌體：現(xiàn)在使用的藥物分為兩類：一是阻止噬菌體吸附的藥物，多為螯合劑；另一類是抑制噬菌體蛋白質(zhì)合成或阻斷其復(fù)制的藥物，多為抗生素。此外還有用染料、抗壞血酸雜蒽累等藥物。但不能對人體有害。,3、采取以環(huán)境凈化為中心的綜合防治措施：如定期檢查包括空氣在內(nèi)的環(huán)境中的噬菌體；嚴(yán)禁活菌體任意排放，凡是污染噬菌體的發(fā)酵液、洗罐水等都要加熱到80C以上，發(fā)酵罐拍的氣體都要與蒸汽或堿液、漂白粉充分混合；滅殺環(huán)境中的噬菌體；滅殺壓縮空氣中的噬菌體；避免噬菌體侵染菌株；避免噬菌體侵入設(shè)備4、污染噬菌體的挽救措施：并罐法、菌株輪換活使用抗性菌株、放罐重消法、罐內(nèi)滅噬菌體法,四、染菌隱患的檢查和處理,（一）染菌檢查 ：檢查凈化空氣、檢查培養(yǎng)基和培養(yǎng)物、檢查發(fā)酵罐、檢查罐道的污染隱患、檢查無法直接觀察的設(shè)備部件雜菌污染,（二）染菌處理 1、前期出現(xiàn)染菌：輕度時降低溫度，降低pH，補(bǔ)加適量的菌種等確立生產(chǎn)菌的生長優(yōu)勢 。嚴(yán)重時糖分高則實(shí)施實(shí)罐滅菌低則補(bǔ)加培養(yǎng)液，無法挽救則倒罐。2、中期染菌：降低通風(fēng)量溫度，停止攪拌補(bǔ)加糖3、后期染菌：輕度染菌則可以讓其發(fā)酵完，可以適當(dāng)提前放罐；重度染菌則立即放罐，并且度空罐進(jìn)行清洗滅菌,五、染菌的預(yù)防措施,（一）空氣的凈化：減少過濾前空氣的塵埃、賈少過濾前