【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）水稻半矮稈和早衰突變體遺傳分析與分子定位作物遺傳育種碩士論文

密級 論文編號 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 水稻半矮稈和早衰突變體遺傳分析與分子定位 of t) t) in of t) t) in - I - 摘 要 矮生性是水稻重要的產(chǎn)量性狀之一，矮稈水稻品種的選育和推廣是 20 世紀水稻育種工作的最主要的成就之一。 水稻非 生基因的發(fā)掘和利用歷來受到水稻遺傳育種學家的重視， 開發(fā)新的水稻矮源并及時加以利用，是避免矮稈良種遺傳單一化從而帶來遺傳脆弱性的重要研究課題。 本研究以中花 11 的半矮桿突變體為材料，通過遺傳分析和改良，發(fā)現(xiàn)了一個有希望用于水稻育種的一個新的半矮桿基因。還對一個早衰突變體進行了遺傳研究，并初步將早衰基因定位在第 11 條染色體上。 1、 對新花矮和矮中花兩個突變體的農(nóng)藝性狀和半矮生性狀遺傳進行了研究。結果表明它們的半矮生性都是由一對基因控制的。其中矮中花中的半矮生基因與 位。而新花矮中的半矮生基因 t)與 等位， t)在 謝調控路徑中可能位于 下游 。 2、 對新花矮中的半矮生基因 t)與其他的幾個半矮生基因的等位性 進行了分析。研究表明， t)與 半矮生基因 不等位。在苗期用赤霉素和多效唑進行處理，發(fā)現(xiàn)新花矮對它們都很敏感。暗處理試驗表明，它是一個與 關的突變體。 3、 對新花矮中的半矮生基因 t)的遺傳性狀表現(xiàn)進行了研究， 新花矮不僅有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，而且 t)可以與大粒性、穗粒數(shù)和高結實率結合， t)的副作用可以通過遺傳背景的改良而得以改善。表明 t)有望在水稻育種中利用。 4、 選擇突變體“ 試驗材料，開展了遺傳分析及初步分子定位研究 ，表明早衰基因 t)是顯性的，利用 記，采用 體表型為野生型的單株，將 t)定位在第 11 條染色體引物 間的 范圍內。 關鍵詞： 水稻 (.)，半矮生基因，遺傳分析，早衰突變體 - is of in of of in in 0th of in of in us by of of in In by a be in of a t) t) 1. 1. of HA ZH by in ZH to HA to is by t) in 2. t) t) to A3 at of t) a in 3. of t) of by t) as of be by of t) be in 4. of by SR 2 t) on of 1,.9 cM .), - 目 錄 第一部分 水稻新半矮生基因的發(fā)掘與研究 第一章 緒 論 . 1 1. 1 水稻矮源概述 . 1 1. 2 國內外研究現(xiàn)狀 . 1 本論文選題的意義和目標 . 12 第二章 新矮稈突變體農(nóng)藝性狀及株高遺傳 . 13 2. 1 材料和方法 . 13 2. 2 結果與分析 . 14 2. 3 結論與討論 . 21 第三章 t)等位性分析與 激素生理研究 . 23 3. 1 材料與方法 . 23 3. 2 結果與分析 . 24 3. 3 討論 . 28 第四章 半矮生基因 t)的遺傳改良 . 30 半矮生性與大粒性的結合 . 30 半矮生性與大穗型的結合 . 32 半矮生性與高結實率的結合 . 33 本章討論 . 34 第二部分 水稻早衰突變體 t)的遺傳及分子定位 第一章 緒 言 . 36 述 . 36 老分子生物學研究技術與方法 . 36 植物衰老的幾種假說 . 37 水稻早衰的研究現(xiàn)狀和意義 . 39 第二章 早衰突變體的發(fā)現(xiàn)及基因 t)的定位 . 40 料與方法 . 40 結果與分析 . 42 討 論 . 46 研究展望 . 46 參考文獻 . 47 - 附 錄 . 54 致 謝 . 55 個 人 簡 歷 . 56 - 1 - 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 第一部分 水稻新半矮生基因的發(fā)掘與研究 第一章 緒 論 1. 1 水稻矮源概述 栽培水稻中發(fā)現(xiàn)的含有矮稈、半矮稈基因的種質都叫矮源。水稻的矮生性是指成熟期水稻的株高比正常植株縮短的遺傳特性，廣義上可以把矮稈分為半矮稈，矮稈和極矮稈 3 種類型。狹義上，矮稈指成熟期時的株高等于或小于正常親本株高一半的矮稈變異；半矮稈是指株高介于矮稈和正常高度之間的突變類型（谷福林等， 2003）。 正常的水稻植株，成花誘導的完成伴隨著末梢 4 或 5 個節(jié)間的伸長，而底部 的其他節(jié)間不伸長，水稻矮稈突變體的分類就是建立在末梢節(jié)間伸長類型不同的基礎上（ et 2003）。（ 1969）和 1977）將水稻矮稈突變體分成 5 類： 節(jié)間的伸長方式與野生型相似，只是各節(jié)間按比例縮短； 2 節(jié)間特定的縮短； 部節(jié)間伸長程度減少，下部節(jié)間伸長； 上面節(jié)間不伸長（圖 圖 種不同水稻矮稈突變體節(jié)間伸 長方式示意圖（引自 1977； 999） 1 of of of 1977； 999) 1. 2 國內外研究現(xiàn)狀 水稻最初的矮稈變異來源于自然條件下自發(fā)產(chǎn)生的突變，包括所有的突變是生物變異的重要- 2 - 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 來源，也是生物進化的基礎（江樹 業(yè)， 2003），當然自發(fā)突變的頻率較低。除了自然發(fā)生突變產(chǎn)生的矮源以外，人工誘變是創(chuàng)造矮源的重要的方法，如物理因素，化學藥劑，組織培養(yǎng)， 空誘發(fā)及遺傳操作等，均能誘發(fā)矮稈變異。 1934）首先報道了利用 X 射線誘導一個粳稻品種產(chǎn)生矮稈突變。其他方法，如射線， 32P 處理等方法都取得了成功。上世紀八十年代，先后通過 X 射線和 137射臺中 65 和品種，得到了 多個半矮生基因（ 1994； 1989、 1994）。朱 旭東等（ 2004）利用射線對粳稻品種“中花 11”進行輻照，經(jīng) 選獲得各類突變體 431份，為水稻功能基因組研究提供了基礎材料。其中有半矮生、小粒矮生、大粒矮生、多糵矮生、少糵矮生、特矮生、長劍葉矮生、畸形矮生等多種矮生型，約占總數(shù)的 30。 化學誘變就是利用化學物質來處理植物（一般是種子）來誘發(fā)產(chǎn)生突變?，F(xiàn)在最常用的誘變劑是 導矮稈的效果也很顯著， 產(chǎn)生矮稈的頻率在 右（陸兆新等， 1992）。 （ 2002） 已經(jīng)獲得了 14,000 個水稻 變群體，為水稻定點突變的篩選奠定了基礎。 組織培養(yǎng)的方法，結合化學誘變及輻射技術也是產(chǎn)生矮稈突變的有效方法。此外，重組自交系（ 雙單倍體群體（ 近等基因系（ 群體中也常出現(xiàn)可供利用的突變體。 將某些元件插入到水稻基因組中后，相應位點的基因的表達就可能受到抑制，插入元件同時又可用作標簽，從基因組中分離出相應的基因并鑒定其功能。目前，水稻中最為常用的插入元件主要是 座子及反轉錄轉座子等（江樹業(yè)， 2003）。水稻 入突變庫的構建 工作也取得可喜進展，如 （ 2000）已經(jīng)篩選出至少 30,000 個 入突變體；中國水稻研究所已經(jīng)建成我國第一個水稻 入突變體庫，得到 4,500 份突變體材料，表型分析和分子檢測表明所獲得的植株 95為轉基因植株，單位點插入株系占 2/3。 利用返回式衛(wèi)星搭載植物種子進行空間誘變處理是近十幾年來一個新的誘變方法。徐建龍等利用衛(wèi)星搭載的特早熟粳稻 95誘變后代鑒定出一個株高 56 效分蘗數(shù)多達 60 個以上，株型良好，籽粒正常的多糵矮稈突變體 建龍等， 2003）。 自從印度學者 1922 年首次報道了一個隱性單基因控制的自然矮稈突變系以來，科學家對水稻矮稈的遺傳進行了廣泛的研究。 粳稻中的矮生性遺傳有兩種情況：一是受隱性單基因控制，并伴有作用較明顯的修飾基因，二是由微效多基因控制（朱立宏等， 1984）。在秈稻中，矮生性多數(shù)是由單隱性基因控制，少數(shù)受 2 至 3 對隱性基因控制，僅有極少數(shù)的矮源受多基因控制（朱旭東等， 1997）。水稻株高由單一隱性矮稈基因控制時，表現(xiàn)半矮稈或矮稈，受兩對矮稈基因控制時，植株往往表現(xiàn)為特矮。當然，也有特矮 突變體是由一對矮稈基因控制的。據(jù)網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫檢索，至 2004 年 2 月 稻突變體庫中收集的水稻矮稈、半矮稈基因分別為 44 個（編號： 和 16 個（編號： 原日本水稻基因連鎖群和命名委員會的 d 編號（ 3 - 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 中的矮稈、半矮稈基因也編錄在內。其中，除了 余的都是隱性基因（ ）。與其他的一些性狀不同，矮生基因的顯隱性是相對的，在雜合狀態(tài)下，都有部分的表達。這和植物內源激素復雜的合成代謝過程有關。 度對矮生水稻的影響 “ 1”是通過對品種“ 行射線照射處理而得到的，它是由一個隱性基因控制的（ 1968） 。同時得到的還有另外一個比 1 稍高的矮稈突變體“ 后來作為一個栽培品種曾在日本北部被廣泛種植。 （ 1981）比較了“ 1”和原品種“ 不同溫度處理下的株高變化：在 25 30 的條件下，“ 株高只有46 為“ 56 %；在 18 23 的條件下，其株高達到 60 野生性高度的 84%。 （ 1990）研究發(fā)現(xiàn)，“ 1”中的矮稈基因和“ 稈中的矮稈基因等位的，后者是用吖丙啶（ 理“ 得到的（ et 。他們的研究還發(fā)現(xiàn)，當平均 溫度超過 26 時，“ 1”節(jié)間的伸長被抑制，主要影響第三（從最上面數(shù)）到第五節(jié)間的伸長，這和 的研究結果是一致的。由此可以推斷“ 1”中的矮稈基因對赤霉素的合成有阻礙作用，在低溫條件下，表達強烈，導致水稻植株矮化；也有可能存在另外的抑制矮稈基因表達的基因，該基因在低溫條件下不表達，因此在低溫條件下才表現(xiàn)出矮化。 此外，攜帶矮稈基因 植株在低溫條件下的表型為矮稈小粒，在高溫條件下表現(xiàn)正常。（ 2003）的研究結果表明， k 在總苞期對提高水稻耐冷性具 有多效性作用，可以用來培育超耐冷性的水稻品種在天氣冷的地區(qū)種植。 我國對矮源的發(fā)掘從 50 年代開始就沒有停止過。顧銘洪等（ 1979）發(fā)現(xiàn)了 因，并育成了含有此基因的品系新桂矮，隨后的研究將 位到第 5 染色體上。隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn) 80t) 和 t)（朱立宏等， 1984；萬安良等， 1984）；還有從矮泰引 t)（梁國華等， 1995） ；秈稻矮生品種廣叢中的矮生基因 t)（蔣志謙等，1997）；對赤霉素反應很敏感的江蘇矮，與 禾矮早的 等位，暫時將此基因命名為 t)（錢前等， 1997） ；馬良勇等（ 2002）發(fā)現(xiàn)的含有 t)新黔矮；徐建龍等（ 2003）誘變特早熟粳稻 95定出的多糵矮稈突變體 有吳成等（ 2003）在雜交水稻親本恢復系蜀恢 162 中發(fā)現(xiàn)的小粒矮稈突變體“ 162d”。但是，這些矮稈種質在育種中的利用價值，有待進一步的研究。 目前，已經(jīng)發(fā)掘了超過 60 種的矮稈突變體，大多數(shù)矮稈、半矮稈基因已經(jīng)被 定位到除第 10條染色體以外的 11 條染色體上（表 少數(shù)已經(jīng)進行了克隆和分離，矮化機理已經(jīng)研究清楚。 - 4 - 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 表 已經(jīng)報道的矮生、半矮生基因 因 名 稱 基 因 符 號 基 因 別 稱 代 表 種 質 等 位 基 因 連鎖群 參考文獻 d2 d3 d5 d7 國矮 d 8 粒矮 t) t) t) t) t),237dt dC dW d dB t) 大黑 夷矮 多糵矮 多糵矮 多糵矮 夷糯 閉穎大黑 晚力神 62, 雪矮等 三體 青森糯 14 7237 92 白世 州 栽稻 (, 1 4 6 2 7 7 6 1 4 2 3 1 3 6 1 11 11 2 2 4 2 12 et 1998） et 003) et 984) et 984) Yu et 1995 ） et 997) et 984) et 990) Yu et 1995） et 2000） et 2002) 968) et 984) et 2000) et 2002) et 2000) et 991) 1984) et 1995b ) 974) 1984) 1974) Yu et 1995） 1984) et 989) Yu et 1995） et 974) et 989) et 1992) et 1997) - 5 - 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 * * 葉舌矮 d K8 d 53, D K3 d K5 d K6 d K7 d(x) 粒矮 t) sd(t) t)* t) t) t) t) t) Sd(t) t) 341 107 京 11 號 新泰矮 一支臘 162d 桂陽矮 1號 (, 8 3 11 1 1 3 9 6 7 1 7 1 5 5 4 5 3 5 et 1982) 1984) et 1985) 1984) et 1989b) et 1989b) et 1985) 1976) et 1996) et 1996) et 1996) Wu et 1999) 1993) et 995) et 002) 978b) 978b) 979) 986) 1987) et 996) et 996) 997) 997) et 996) 李欣等（ 2001） 李欣等（ 2001） 李欣等（ 2002） et 003) 梁國華等（ 1994） 以上根據(jù) ）、 ）、 - 6 - 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 * 等位基因； * 等位基因； * 等位基因 生基因作用機理研究與應用 最初，有關水稻矮稈機理的研究主要限制在對水稻外部性態(tài)的研究，隨著細胞生物學的發(fā)展，對矮稈機理的研究深入到細胞水平。例如， （ 1985）通過對近等基因矮稈系的研究，發(fā)現(xiàn)節(jié)間的縮短主要是細胞數(shù)目的減少造成的，而與細胞的長度無明顯的相關性?，F(xiàn)在，分子生物學和分子遺傳學的飛速發(fā)展，對水稻矮稈機理的研究已經(jīng)深入到分子水平，特別是后基因組時代的到來，水稻矮稈作用的分子機理已經(jīng)逐漸被揭示出來。 植物激素突變體是研究植物激素合成、代 謝途徑以及信號轉導的重要植物材料（韓碧文，1993）。各種各樣的因素會使植物矮化，但最近通過對擬南芥（ 其他雙子葉植物矮稈突變體的分子遺傳研究表明，赤霉素（ 稱 油菜素類固醇（ 稱 決定植物株高的兩個最重要的因素 (et 2003)。對水稻矮稈、半矮稈突變體的研究結果也是如此。 1)、水稻矮生性與赤霉素（ 圖 高等植物中赤霉素生物合成與分解代謝的主要途徑 （ . et 2002） he of A) in 的名稱用黑體字表示，在箭頭的下面或右側。 別轉化成 A， - 7 - 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 in or to of be A1 A8 一個很大的雙萜類化合物家族，其中一些具有生物活性，可以對多種發(fā)育過程，如種子發(fā)芽，莖干伸長，葉的伸展，花和果實的發(fā)育等進行調控（ 995）。 作用特別體現(xiàn)在莖 稈的伸長中，因為所有的 陷型的突變體都表現(xiàn)為矮稈（ et 997）。最近，編碼 物合成過程所用的基因（除 化酶）和 解代謝最初步驟已經(jīng)被分離和鑒定出來。 高等植物體內的生物合成，主要有三個階段： 1）質體內，牻牛兒焦磷酸到內根 2）發(fā)生在網(wǎng)膜系統(tǒng)的微粒體細胞色素 加氧酶催化內根 轉變； 3）細胞質中 形成（ . et 002）。 A、 與 水稻突變體 水稻中的半矮稈基因 現(xiàn)代水稻育種中最重要的基因。 因的品種對外源的 理敏感，株高可以恢復到野生型的高度。 碼 化酶（ ，催化 步反應。在小麥中普遍應用的半矮稈基因 碼與 號轉導有關的蛋白。 圖 等植物赤霉素生物合成的早期 13 ,1997； ,2002） 。黑圓表示由 催化的 氧化步驟 he 3of in A 20水稻中至少有兩種 化酶： 碼 鎖。 葉片、莖稈、未開放的花中表達強 烈， 是在未開放的花中表達。這也就揭示了為什么 稻株高減小，而產(chǎn)量不受影響的原因（ . et 2002）。 稻含有一個有缺陷的 化酶，兩個獨立的 位基因都是 部發(fā)生了改變；秈稻半矮稈品種 碼區(qū)（ 缺失了 280時丟失的還有 03稻半矮稈品種 6和野生型 798 位置 C 轉換成了 T，導致 基酸序列中的亮氨酸（ 變成了 。而亮氨酸（ 在所有的 化酶（ 中是保守的，在 是保守的，這就使粳稻 能缺失，表現(xiàn)出半矮稈性狀（ . et 2002）。 - 8 - 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 B、 與水稻突變體 攜 粒、葉色暗綠、直立緊湊型小穗，有時第二節(jié)間不伸長。 蛋白亞 基的基因， 就是糊粉層中 . et 2003)。 一個 突變體的表型表明， 且，還有另外一條不依賴 et 2000）。 C、 與水稻突變體 攜 因的是功能缺失 型突變，可是它的花和種子的發(fā)育沒有受到影響。 碼 (H. et 2001)。在水稻中也至少有兩種 且是特異性表達的： 地上部各器官中廣泛表達； 在生殖器官中特異表達。由 制合成的有生物活性的 用于新芽的伸長，而與生殖發(fā)育無關（ . et 2003） 。在 成路徑中， 要催化 外還催化 . et 2000） 。 D、 與水稻突變體 有關研究 帶 因的 變體株高是其野生型的 60 70%，實際上上個世紀 50 年代經(jīng)被認為是日本產(chǎn)量最高的栽培品種，畝產(chǎn)可達 8.5 t/能是由品種 過自然突變產(chǎn)生的。 因編碼內根 成的最初的階段起作用 (et 1996)。催化內根 根 杉烯醇內根 根 . et 1998）。 等（ 2004）從水稻基因組中分離了 5 個因，它們編碼的蛋白與擬南芥和南瓜的 有很高的同源性，研究表明基因 120序列中前后同向排列，表達分析顯示 各種器官中轉錄活躍，而 是低水平的表達， 許是個假基因。 應于是 弱等位基因。 能參與植物抗毒素的合成。 E、 與水稻突變體 有關研究 突變體 ） 表型為特矮，葉色暗綠，葉片寬。 表達不受外源 理的抑制，而且其營養(yǎng)器官中 含量是野生型的100 多倍，表明 因編碼一個 號中的正調控因子。 碼一個推定的 白，和擬南芥的 相似（ . et 2003） 。 白是一類含有 序 ( 在泛素介導的蛋白質水解過程中具有底物識別特性的蛋白質家族 。 這類蛋白質在細胞時相轉換、信號傳導、發(fā)育等多種生理過程中都具有重要功能 （ 吳靜 等， 2002）。 （ 2004）的研究使我們能更好的了解水稻中 謝過程。他們從各種 - 9 - 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 據(jù)庫中篩選和分離了 29 個編碼 種代謝酶的候選基因：內根 、內根 內根 內根 、 的研究結果表明：催化 物合成早期步驟的酶（也就是 和 要是由單基因編碼的，而催化更后的步驟的酶（也就是 由基因家族編碼