【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）心血管疾病發(fā)病機制的深入研究

第一章 前 言 心血管疾病已成為威脅人類生命健康的一個主要問題，最新的研究數(shù)據(jù)預測，到 2030 年全球將有 2360 萬人死于心血管相關疾病 1。由于動脈粥樣硬化是導致心血管相關疾病的主要原因 2，因此對其發(fā)病機制的深入研究以尋找到可能的防治方法具有重要的意義。 大約在 1900 年，大多數(shù)內(nèi)科醫(yī)生認為動脈粥 樣硬化是年齡的產(chǎn)物。因此，幾乎沒有相應的治療和干預措施 3。直到 1913 年， 用一個兔的動脈粥樣硬化模型證實，血液高水平的膽固醇是導致此病發(fā)生的一個主要原因 4。此后進行了大量關于膽固醇對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展影響的實驗，目前認為動脈粥樣硬化是一個涉及脂質和膽固醇過度沉積在大、中動脈的炎癥代謝性疾病。 多種危險因素，主要包括遺傳性因素和環(huán)境因素可以導致早期動脈血管壁的形態(tài)學及功能性損傷，從而促使動脈粥樣硬化的發(fā)生 5。遺傳易感性通常表現(xiàn)為有動脈粥樣硬化相關疾病的家族史，同時這些家族的 個體發(fā)生動脈粥樣硬化的危險增高 6。環(huán)境因素主要與個體的生活習慣相關，主要包括高脂飲食，吸煙及缺乏鍛煉。在這些危險因素的作用下出現(xiàn)血管內(nèi)皮功能紊亂、血管炎癥，脂質、膽固醇及細胞成分在血管壁內(nèi)膜下不斷聚積，最終導致粥樣硬化斑塊的形成。 動脈粥樣硬化發(fā)生的主要初始事件是由于各種危險因素所導致的內(nèi)皮功能紊亂，包括血管損傷、膠原暴露、脂質和膽固醇沉積于血管壁，或血流速度或壓力的改變而導致管壁應力改變等 7。在這些因素中最主要的是 含的脂蛋白，如低密度脂蛋白（ 血管壁內(nèi)膜下的滯留和積累，當血漿中 平過高時， 會滯留在血管分叉處或血管彎曲的部位 8。這些滯留的 發(fā)慢性炎癥反應，使內(nèi)皮功能改變并誘導和釋放趨化因子，上調(diào)粘附分子 /受體表達，從而將血液中的單核細胞招募到激活部位，此后單核細胞便粘附并遷移至內(nèi)皮下 9。此外，滯留的 到炎性介質刺激后轉化為修飾的脂蛋白，如氧化低密度脂蛋白（ 通過激活內(nèi)皮導致趨化因子的進一步產(chǎn)生，招募越來越多的單核細胞到達激活部位 10。單核細胞一旦進入內(nèi)皮下就分化為巨噬細胞，巨噬細胞上的清道夫受體介導攝取沉積及修飾的脂蛋白，最終使巨噬細胞轉變?yōu)槟懝檀几患呐菽毎罅康呐菽毎銟嫵闪酥緱l紋，此為最早可見的動脈粥樣硬化病變 11。隨著病變的進一步進展，泡沫細胞內(nèi)過度積聚的脂質，尤其是游離膽固醇導致細胞毒性，其可誘導特異性細胞因子釋放并引發(fā)泡沫細胞死亡。泡沫細胞的死亡導致了由脂質、膽固醇結晶和細胞碎片構成的壞死核心，同時釋放到細胞外的細胞內(nèi)容物持續(xù)的刺激維持著 一個慢性炎癥狀態(tài)，進一步促使巨噬細胞遷移到內(nèi)膜區(qū)域，從而引發(fā)惡性循環(huán) 12。 鑒于泡沫細胞在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到的關鍵性作用，通過對巨噬源性泡沫細胞形成過程的干預來阻止粥樣斑塊的形成，對防治動脈粥樣硬化具有重要意義。泡沫細胞形成過程中細胞內(nèi)正常膽固醇代謝機制失衡， 胞內(nèi)膽固醇代謝涉及到膽固醇的合成、流入及流出過程，巨噬細胞內(nèi)的 ?；o酶 A 膽固醇酰基轉移酶 1（ ， 及細胞膜上 合盒轉運蛋白 1（ of ， 參與細胞內(nèi)膽固醇的調(diào)節(jié)。 與細胞內(nèi)膽固醇存在形式的調(diào)節(jié)，使吞噬進入細胞的游離膽固醇轉化為膽固醇酯；而 與細胞內(nèi)膽固醇含量的調(diào)節(jié)，可以將細胞內(nèi)過多的膽固醇移出細胞外。在正常生理狀態(tài)下，它們可以維持細胞內(nèi)膽固醇的代謝平衡，但當細胞膽固醇大量聚集時，這種穩(wěn)態(tài)機制不堪重負，巨噬細胞內(nèi) 膽固醇的流入流出過程失衡，從而使巨噬細胞內(nèi)膽固醇大量聚集，最終導致泡沫細胞的形成 10。膽固醇逆向轉運（ 程是對抗細胞內(nèi)膽固醇聚集的主要機制，此概念最初由 出 13，指將肝外組織和細胞的膽固醇轉運至肝，由肝臟轉化為膽汁并從糞便排出的生理過程。 認為 對抗動脈粥樣硬化的一個保護性機制 14，而起始步驟是巨噬細胞內(nèi)的膽固醇流出 15，因此 促進巨噬細胞的膽固醇逆向轉運過程，減少細胞內(nèi)膽固醇的聚集，可能抑制泡沫細胞的形成。 研究發(fā)現(xiàn) 泡沫細胞膽固醇逆行轉運均有影響 16, 17，通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的 表達，來促進巨噬源性泡沫細胞的 程，可能抑制泡沫細胞的形成。 噻唑烷二酮類藥物（ 括曲格列酮，羅格列酮和吡格列酮，為過氧化物增殖物激活受體 (，人工合成配體 18。 一個亞型，屬于配體調(diào)控的轉錄因子，其在脂肪代謝和糖代謝中有著重要的作用 19。 受體形成異二聚體并綁定在特定的 而調(diào)節(jié)靶基因的轉錄 20。在臨床上噻唑烷二酮類藥物主要用于 2型糖尿病的治療，近來有關 動物模型的數(shù)據(jù)顯示羅格列酮能夠抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成 21，但其機制尚未明確。一些研究顯示羅格列酮可能的抗動脈粥樣硬化機制包括改善內(nèi)皮功能 22、促進脂質代謝 23, 24、抑制炎癥 25和增加斑塊的穩(wěn)定 26等?；趧用}粥樣硬化發(fā)生機制的復雜性，我們在目前的研究基礎上進一步探討羅格列酮抗動脈粥樣硬化的機制。 本實驗通過將 察羅格列酮 對巨噬源性泡沫細胞內(nèi)膽固醇含量及 討其可能的細胞水平的機制，以尋找羅格列酮對抗動脈粥樣硬化的潛在靶點。 第二章 材料與方法 1 實驗主要試劑和設備 要試劑 小鼠單核巨噬細胞株 中科院上海細胞庫） ； 胎牛血清 （ 杭州四季青生物制品公司， 批號： ； 糖培養(yǎng)基（含葡萄糖 4.5 g/L） （ 美國 司，批號： ； 氧化低密度脂蛋白 （ 廣州奕源生物科技有限公司，批號： ； 羅格列酮 （ 美國 司，批號： ； 總膽固醇試劑盒 （ 北京普利萊生物科技有限公司，批號： ； 游離膽固醇試劑盒 （ 北京普利萊生物科技有限公司，批號： 兔抗人 體 （ 美國 司，批號： 兔抗人 體 （ 美國 司，批號： 體 （ 上海豐翔生物公司，批號： 辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體 （ 上海豐翔生物公司，批號： 劑 （ 美國 司，批號： 34077）； 細胞蛋白提取 解液 （ 美國 司，批號： 白濃度測定試劑盒 （ 美國 司，批號： 23277）； 要設備 超凈工作臺 （ 蘇州凈化儀器廠 ）； 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱 （ 美國 司 ）； 高速離心機 （ 上海安亭 科學儀器廠 ）； 電熱恒溫培養(yǎng)箱 （ 成都紅星電烘箱廠 ）； 倒置顯微鏡 （ 日本 司 ）； 自動酶標儀 （ 美國寶特 司 ）； 電泳槽 （ 美國 司 ）； 轉膜儀 （ 美國 司 ）； 恒溫水浴箱 （ 北京西城區(qū)醫(yī)療機械廠 ）； 電子天平 （ 上海天平儀器廠 ）； 冰箱 （ 青島海爾股份有限公司 ）； 超聲波清洗機 （ 寧波新芝生物科技有限公司 ）； 手提式不銹鋼蒸汽消毒器 （ 上海醫(yī)療器械廠 ）； 要實驗材料 250 胞培養(yǎng)瓶， 6 孔細胞培養(yǎng)板， 96 孔細 胞培養(yǎng)板， 10 管， 10 1.5 心管， 1.5 存管，加樣器及吸頭， 250 100 10 璃瓶，定性濾紙， 氏濾器，酒精燈等。 2 實驗方法 胞培養(yǎng)及建立泡沫細胞模型 制培養(yǎng)基 1）將一瓶 糖型培養(yǎng)基（含葡萄糖 4.5 g/L）粉劑， 3.7 g 碳酸氫鈉溶解于雙蒸水中，待完全溶解后用雙蒸水定容至 1 L； 2） 4 下保存； 3）滅活胎牛血清，具體方法為將 保存的胎牛血清在室溫下完全溶解，置于 56 水浴箱內(nèi)輕輕晃動 30 活； 4）配制完全培養(yǎng)基，成分為 89 濾后的 養(yǎng)基，加入 10 00 U/青霉素和鏈霉素。 胞培養(yǎng) 參照文獻方法 27，使用含有 10%胎牛血清的 噬細 胞。將細胞置于 37 下，通以 95%空氣及 5% 合氣體的細胞培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)。當細胞貼壁達 70% 80%時進行傳代。 胞傳代 當細胞貼壁達 70% 80%時，為防止細胞因生長空間不足或因細胞生長密度過大而導致營養(yǎng)障礙，影響細胞生長，需要將細胞由原培養(yǎng)瓶分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)以維持細胞的生長。細胞傳代的具體步驟為： 1）棄去培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，使用 沖液洗滌培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞 3 遍，以去除殘留的培養(yǎng)基； 2）用加樣器取 酶 1 入培養(yǎng)瓶，并置于 37培養(yǎng)箱內(nèi)使其與細胞充分作用 5 3）達到消化時間后，在培養(yǎng)瓶內(nèi)加入含血清的完全培養(yǎng)基已終止胰酶的消化，并按順序依次吹打瓶底細胞使形成細胞懸液； 4）將細胞懸液移至 10 心管內(nèi)，高速離心， 1000 4 5）離心好后，棄去上清液，加入完全培養(yǎng)基并重新吹打制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度后接種至新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。 胞凍存 1）選擇生長良好的貼壁細胞并在凍存前一天給細胞換液； 2）棄去原來的培養(yǎng)液，用 滌細胞 3 遍后，加入 蛋白酶 1 照傳代的方法將細胞收集與離心管內(nèi)離心， 1000 4 3）離心后，去除上清液，加入配制好的凍存液，凍存液中完全培養(yǎng)基、胎牛血清、 比例為 7:2:1，將細胞吹打均勻后移入凍存管內(nèi)； 4）嚴密封口且做好標記的凍存管依次在 冰箱放置 2 h， 冰箱放置2h，液氮口放置過夜后投入液氮中進行長期保存。 胞復蘇 1） 從液氮罐中取出凍存管，用鑷子夾住瓶口，在預先調(diào)至 37 39 的水中輕輕晃動使溶解，時間控制在 1 2 ； 2）配制好復蘇細胞的培養(yǎng)液，成分為 8 2 牛血清及終濃度為 100 U/ 青霉素和鏈霉素； 3）將復蘇的細胞加入配制的培養(yǎng)液中，記好復蘇時間，放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)； 4）次日對復蘇細胞進行更換培養(yǎng)液，以去除殘留 治其對細胞的副作用。 沫細胞模型的建立 參照文獻方法 28，取生 長良好的貼壁細胞，棄去細胞液，加入 全培養(yǎng)基和終濃度為 30 同孵育 48 h 使其轉化為泡沫細胞。細胞內(nèi)膽固醇酯 /總膽固醇比值大于 50%界定為造模成功 29。 沫細胞油紅 O 染色鑒定 1）配制油紅 O 儲存液：取 0.5 g 油紅 O 粉劑溶于 100 丙醇中，在 4下避光保存； 2） 棄去模型細胞內(nèi)的培養(yǎng)基，用 細胞洗滌 3 遍； 3）加入 4%多聚甲醛，固定細胞 30 4）用去離子水稀釋油紅 O 儲存液，比例為 3 紅 O 儲存液中加入 2 釋后的油紅 O 染液用濾紙過濾以去除雜質； 5）在細胞中加入油紅 O 染液，并在 37細胞培養(yǎng)箱內(nèi)放置 30 6）棄去細胞中的染液，用 75%酒精洗滌 1 遍細胞，顯微鏡下觀察染色結果。 驗分組 實驗分為 5 組： 空白對照組，將巨噬細胞培養(yǎng)于含 10%胎牛血清的 于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)不做其他處理； ，用終濃度為 30 的 入完全培養(yǎng)基中，孵育巨噬細胞 48 h； 30 羅格列酮組，用終濃度為 5 的羅格列酮預孵巨噬細胞 2 h 后，加入終濃度為 30 的 8 h； 30 0 羅格列酮組，用 10 的羅格列酮預孵 2 h，其他操作同前； 30 0 羅格列酮組，用 20 的羅格列酮預孵 2 h，其他操作同前。 胞內(nèi)總膽固醇及游離膽固醇測定 按膽固醇檢測試劑盒說明書操作，具體步驟如下： 1）棄去細胞培養(yǎng)液，用 沖液洗滌細胞 3 遍； 2）洗滌后的細胞中加入細胞裂解液，加入比例為每 106 個細胞中加入 0.1 加樣器反復吹打，使細胞充分裂解； 3）將細胞裂解液移入 1.5 心管中，高速離心（ 2000 5 收集離心后上清液用于酶學測定； 4）配制游離膽固醇和總膽固醇工 作液，成分為 劑和 劑，配制比例為 2=4:1，混合后立即使用； 5）在 96 孔板的微孔中加入 10 L 樣品上清液和 190 L 工作液，置于 37細胞培養(yǎng)箱內(nèi) 20 其充分反應； 6） 酶標儀測定各孔 ，繪制標準曲線計算總膽固醇及游離膽固醇濃度。 測 蛋白表達水平 劑的配制 液 250 .0 g 用 200 餾水溶解，用濃鹽酸調(diào)節(jié) 所需點后，用蒸餾水定容至 250 各 濃硫酸需要量 17 16 15 10 0 g 100 丙醇溶解，分裝于離心管中， 存； 0.2 12 g 500 餾水溶解，高壓滅菌后室溫保存； 0.2 71.6 g 1000 餾水溶解，高壓滅 菌后室溫保存 10% 50水浴下 ， 10 g 蒸餾水溶解，并定容至 100 溫下保存； 10%過硫酸銨（ 0.1 g 過硫酸銨用 1.0 純水溶解， 4下可保存一周； 1.5 g 200 純水溶解，濃鹽酸調(diào) 純水定容至 250 壓滅菌后室溫保存； 0.5 g 200 純水溶解，濃鹽酸調(diào) 純水定容至 250 壓滅菌后室溫 保存； 10 沖液： 80 g 2 g 14.4 g 2.4 g 蒸餾水溶解，濃鹽酸調(diào)整 餾水定容至 1 L，高壓滅菌后室溫保存； 20% 0 蒸餾水定容至 100 4下保存。 用液 30%丙烯酰胺溶液： 29 g 丙烯酰胺加 1 g 甲叉雙丙稀酰胺，用去離子水定容至 100 光室溫保存； 10%過硫酸銨： 1 g 過硫酸胺加入 10 離子水， 存； 8 g 0.2 g g g 蒸餾時溶解，濃鹽酸調(diào)整 餾水定容至 1 L，高壓滅菌后室溫保存； 18.2 g 離子水溶解，加 離子水定容至 100 1M g 離子水溶解，加 離子水定容至 100 10蛋白電泳緩沖液： 30 g 144 g 甘 氨酸， 10 g 離子水定容至 1000 2 白上樣緩沖液： 5 .5 加入 4 0%14 0%甘油， 4 酚藍； 馬斯亮藍 液： 0.5 g 考馬斯亮藍 于 125 醇，加入 35 酸，去離子水定容至 500 避光室溫下保存； 蛋白轉移緩沖液： g g 甘氨酸， 100 0%甲醇，去離子水溶解并定容至 500 封閉液： 5 g 脫脂奶 粉，溶于 100 制成含 5%脫脂奶粉的 沖液； 沖液： 8.8 g 加入 10 餾水定容至 1000 沖液： 0% 加入 700 勻。 驗步驟 白提取及蛋白含量測定 1）棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入 4預冷的 沖液，洗滌 3 遍，以去除殘存培養(yǎng)基； 2）洗滌好的細胞中加入 胞裂解液同時加入苯甲基磺酰氟（ 比例為 1胞裂解液中加入 10 L 待細胞裂解完全后，用刮刀將細胞刮下，將含有細胞碎片的裂解液均移至 1.5 心管內(nèi)； 3） 4下超速離心， 12000 5 4）收集蛋白樣品上清液， 測定蛋白濃度。 膠 制膠方法：固定好電泳玻璃板，根據(jù)樣品蛋白選擇 10%（ 8%（ 分離膠，加入分離膠后再在膠上加一層水，待膠凝固后吸出上層水，再在分離膠以上空間內(nèi)加入濃縮膠，加完后立即在濃縮膠中插入梳子，待濃縮膠凝固后小心拔除梳子。 不同濃度膠的配方 ： 10%分離膠（ 10 取 3.3 0%丙烯酰胺，加入 2.5 0.1 0%0.1 0%過硫酸銨， 4 餾水， 勻； 8%分離膠（ 10 取 2.7 0%丙烯酰胺，加入 2.5 0.1 0%0.1 0%過硫酸銨， 4.6 餾水， 勻； 5%濃縮膠（ 5 取 0%丙烯酰胺，加入 0%0%過硫酸銨， 3.4 餾水， 勻； 注：加入 立即混勻灌膠。 泳 1）將收集的蛋白樣品加入 2 白上樣緩沖液， 100加熱 5 蛋白變性； 2）待膠凝固后將玻璃板固定于電泳槽中，加入電泳緩沖液，再加入處理的變性蛋白樣品，接通電源，先穩(wěn)壓 80V 30 調(diào)電壓至 1100 膜 1） 提前將電泳好的凝膠，濾紙，海綿墊浸泡于電轉緩沖液中； 2） 取一塊 ，依次作如下處理： 100%甲醛中浸泡 10 秒，去離子水中浸泡 3 轉緩沖液中浸泡 3 3）在裝有電轉緩沖液的轉膜槽中放入電轉三明治，順序依次為：轉膜槽正極，海綿，濾紙， ，凝膠，濾紙，海綿，轉膜槽負極，注意趕出氣泡。放好后加蓋，接通電源進行轉膜， 整電流至 200 膜 150 整電流至 25 膜 17 h； 4）將轉膜后的 置于含 5%脫脂 奶粉的 沖液中封閉 2 h。 體孵育 1）轉移膜加入 10 抗， 4下孵育過夜， 沖液洗滌 3 遍； 2）加入 15 抗，室溫下孵育 2 3 h， 沖液洗滌 3 遍。 學發(fā)光，顯影及圖像分析 1）配制 ， 1 液（ A 液）和 1 液（ B 液）混合后即可使用； 2）避光下用 澆膜，沖洗膜大約 10 次左右； 3）將膜放入夾片中， X 線曝光拍照； 4) 像分析軟件分析結果，用樣品蛋白的面積灰度值分別與 灰度值比較，比值為樣品蛋白的相對表達水平。 計學處理 采用 件系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)標準差（ x s）表示，兩組之間比較采用 t 檢驗，大于兩組比較采用單因素方差分析。當 P S in . J 2000, 275(29): 2243541 , , G, et a a . 2005, 54(3): 81142 , , , et in J. J 2007, 321(2): 43143 , , L, et in . 2004, 24(2): 25744 J, . in . 2010, 7(2): 7745 , , , et of of in . 2009, 203(2): 48346 J, G, T, et of in . J 2006, 116(1): 5947 , , , et .